人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定
作者：曲春枫 孙宗棠
单位：中国协和医科大学肿瘤研究所，北京100021
关键词：人IL-12；树突状细胞；DNA序列；生物学活性
中国免疫学杂志990104 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：克隆中国人IL-12 p40基因，构建IL-12的真核基因表达载体。方法：采用RT-PCR从北京地区人脐血树突状细胞(DC)中克隆IL-12 p40cDNA基因，并进行序列分析。利用pcDNA3.1和pLXPXSN构建IL-12表达载体，转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人DC中IL-12 p40cDNA基因210位密码子有独特的结构，为GCC(Ala)。并且239和291位密码子与已报道的NKSF和CLMF p40序列各有异同，在与国外提供的p35基因共同转染细胞后能产生功能性的IL-12。用其构建的IL-12双亚基共表达逆转录病毒载体在转染肝癌细胞株并经选择后，上清液中有较高的具有刺激淋巴母细胞增殖活性的IL-12。Western blot分析结果显示，在70 kD处有特异性的蛋白条带出现。结论：支持人IL-12p40基因可能存在着多态性的假设；IL-12的产生需要p35和p40基因的共同表达。
, 百拇医药
Cloning,sequence analysis and biological characterization of human recombinant IL-12
QU Chun-Feng ，SUN Zong-Tang .
Cancer Institute,Peking Union Medical College,Beijing 100021
Abstract Objective：Cloning IL-12p40 from Chinese and constructing human recombinant IL-12 expression vector.Methods：By using RT-PCR to clone IL-12 p40cDNA from the mRNA extracted from cord blood dendritic cells(DC) of Beijing newborns' and then sequenced.Expression vectors encoding the IL-12 subunits p35,p40 and IL-12 bicistronic expression vector were constructed by using pCDNA3.1 and pLXPXSN,and then transfected human heptocellular carcinoma(HCC) cell line by lipofection.Results:IL-12 cloned from DC of Beijing has unique structure in codon 210,being GCC(Ala).The 239 and 291 codons are the same as CLMF p40 but different from NKSF p40.Transfection with expression vectors encoding either the p40 or the p35 of hIL-12 to HCC cell line showed that only in the case of co-transfection with both vectors in equivalent amount,the supernatant of the transfected cells showed biological activity of IL-12.Subsequently,the bicistronic retroviral vector encoding both p40 and p35 of hIL-12 was transfected the replicating HCC cell line.Following selection,the supernatant of the transduced cell colonies showed prominent biological activity in stimulating the proliferation of lymphoblasts.Western blot showed the appearance of the characteristic 70 kD band.Conclusion:The above data support the hypothesis that the p40 gene of human IL-12 may be polymorphic.
, 百拇医药
Key words Human IL-12 Dendritic cells DNA sequence Biological activity
自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)[1]是从EBV转化细胞系RPMI-8866中纯化得到的一种细胞因子，作用于T细胞和NK细胞而刺激其产生IFN-γ，增强其细胞毒活性，并促进这两种细胞的增殖等。同期，另一实验室从EBV转化的细胞系NC-37中纯化得到了细胞毒性T细胞成熟因子(CLMF)[2]，其生物学作用和结构与NKSF相同，现统一命名为IL-12[3]。它是由p40和p35两条多肽链组成一个p70异二聚体。比较已发表的NKSF和CLMF的序列可见，两条链间存在有个别氨基酸差异，这提示IL-12可能存在有多态性。最近我们从北京地区人脐带血DC中克隆了一个新的IL-12p40基因，构建了IL-12双基因共表达载体，在肝癌细胞株中表达出了具有生物学及免疫学活性的人IL-12。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌株与载体 大肠杆菌DH5α及表达载体pcDNA3.1(5.4 kb)购自Invitrogen。逆转录病毒载体pLXPXSN(6.4 kb)为一双基因表达载体，由NIH的Richard Morgan惠赠。
1.2 克隆质粒p35 NKSF14-1-1 由ATCC提供，NotⅠ/SalⅠ酶切1.3 kb片段包含IL-12 p35的完整编码基因。
1.3 引物设计与合成 根据文献[1]报道的序列，共设计4条引物用于克隆IL-12 p40 cDNA，其中59043：5′-GCCCAGAGCAAGATGTG-3′(2-18),59044:5′-GTCTATTCCGTTGTGTC-3′(1077-1061)为p40的外套引物。55684：5′-CAGAGCAAGATGTGTCAC-3′(5-22)，55685：5′-TGGTCAGAACCTAACTG-3′(1011-994)为p40的内套引物。上述引物均在计算机上进行复检，委托CyberSyn公司合成。
, http://www.100md.com
1.4 主要试剂 IFN-γ，抗IL-12 p70特异性单抗MAB611(IL-12捕捉抗体)，MAB219(IL-12中和抗体)，BAF219(生物素标记的羊抗人IL-12 p70免疫血清)均购自R&D公司。LPS购自Sigma；限制性内切酶及其它酶类为华美公司和Promega的产品；TA克隆试剂盒为Invitrogen产品。
1.5 逆转录(RT)和巢式PCR进行IL-12 p40基因扩增与克隆 培养来自北京地区的人成熟脐血DC，加入IFN-γ和LPS进行诱导后一步法提取细胞总RNA[4]。采用PE公司的Gene Amp RNA PCR试剂盒，逆转录成IL-12 p40 cDNA第一条链，所用引物为59044。然后巢式PCR扩增IL-12 p40链。第1次PCR所用引物为59043和59044，第2次PCR所用引物为55684和55685。第2次PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实在相应位置上出现明显的条带后，将此新鲜产物插入到TA克隆载体pCRTM2.1中，具体操作按说明书进行。小量提取质粒DNA后酶切鉴定PCR确定方向。
, 百拇医药
1.6 p40克隆质粒的序列分析 采用Promega公司Wizard试剂盒小量提取质粒DNA，委托北京赛因思公司采用T7 Promoter和M13 Reverse primer引物在ABI377自动序列分析仪上进行正反两个方向的序列分析。
1.7 p35和p40基因表达载体的构建 从p35质粒和p40质粒上酶切获得p35和p40的编码基因，分别克隆到pcDNA3.1表达载体上，构建成p35和p40基因表达载体pC35，pC40。经鉴定后提取质粒DNA，PEG纯化后用于细胞转染。
1.8 IL-12双基因表达载体pL35P40SN的构建 见图1。
图1 pL35P40SN的构建
, 百拇医药
Fig.1 Construction of pL35P40SN
1.9 IL-12在人肝癌细胞中的表达 采用GIBCO/BRL的Lipofectin进行细胞转染，操作按说明书进行。表达载体pL35P40SN经PEG纯化后转染人肝癌细胞株7701(详见表1)。转染72 h后收集上清，加G418筛选。在有明显克隆形成后，撤去G418。数天后收集培养细胞上清，进行IL-12的生物及免疫活性的检测。
1.10 IL-12生物活性的检测 IL-12特异性捕捉抗体MAB611加入到Falcon 96孔培养板中室温下过夜；PBS洗涤后，加入1% BSA-PBS封闭洗涤后加标准IL-12及待测样品。部分细胞上清先与MAB219抗体37℃作用30 min后加入。室温下放置3 h，洗涤后加入经PHA刺激的人淋巴母细胞，37℃，5% CO2培养24 h，加入3H-TdR后培养18 h，收集细胞，计数同位素掺入量。
, 百拇医药
1.11 Western blot 参照文献[5]进行。经MAB611浓缩的转导细胞上清及未经浓缩转导细胞裂解物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上。用生物素标记的羊抗人IL-12免疫血清(BAF219)作为第一抗体，按ABC法显色。
2 结果
2.1 北京地区人脐血DC IL-12 p40 cDNA的克隆 采用IFN-γ和LPS对细胞诱导后[6]经IL-12p40外套下游特异性引物59044逆转录合成其cDNA第一条链，然后进行巢式PCR。第二次PCR后在略大于1 000 bp位置上出现高亮度条带(图2)。
图2 RT-PCR扩增IL-12p40 cDNA片段的电泳图谱
Fig.2 Electrophorectic profile of RT-PCR pro-duct for p40
, 百拇医药
Note:Lane 1.products after the first round PCR；Lane 2.products after the second round of PCR showing a clear band around 1 000 bp(annealing temperature is 56℃ Mg2+ is 1.5 mmol/L)；Lane 3.products after the second round of PCR(annealing temperature is 58℃ Mg2+ is 1.4 mmol/L)；Lane 4.DNA marker
表1 转染细胞上清对PHA活化的淋巴母细胞的增殖作用
Tab.1 Biological activity of transfected cells supernatant in stimulating lymphoblasts IL-12
, 百拇医药
(ng/ml)
3 H-TdR
incorporation(×103)
Plasmids for
transfection
3 H-TdR
incorporation(×103)
0
26.30±0.60
pCDNA3
, 百拇医药 25.48±0.10
0.1
32.56±0.16
pC35
26.39±0.19
0.5
37.44±0.25
pC40
25.63±0.22
2.5
39.23±0.52
pC35+pC40
, http://www.100md.com
39.83±0.44
12.5
42.51±0.61
pL35P40SN
53.47±0.32
pLXPXSN
28.43±0.22
表2 不同IL-12p40 cDNA结构特征的比较
Tab.2 Comparison of hIL-12 p40 cDNA sequence feature p40 cDNA
Codon 210
, http://www.100md.com
Codon 239
Codon 291
phDCp40
GCC(Ala)
AAG(Lys)
ACG(Thr)
NKSF.p40
GTC(Val)
AAC(Asn)
ACC(Thr)
CLMF.p40
GTC(Val)
, http://www.100md.com
AAG(Lys)
ACG(Thr)
2.2 IL-12 p40克隆的序列分析 对两个经鉴定有正确插入的p40 cDNA克隆分别进行正反两个方向的序列分析，结果完全一致。将所得序列与NKSF(Accession ＃M65290)和CLMF(Accession ＃M65272)进行比较，结果发现我们所克隆的p40基因有一完整读码框架，其绝大部分与上述序列一致，但在第210位密码子上存在着独特结构，是GCC(Ala)而非GTC(Val)，见表2。此外，在239和291密码子也各有异同。将此质粒命名为phDCp40。
2.3 IL-12的表达及其生物学活性鉴定 对人肝癌细胞株7701分别进行了pC35,pC40,pC35+pC40的转染，细胞转染后72 h收集其上清进行生物学活性的鉴定。结果见表1。pC35和pC40基因只有在等量共转染时才能测出有功能的IL-12，其对淋巴母细胞的刺激水平与2.5 ng/ml的参照IL-12相当。我们又进一步构建了IL-12的双亚基共表达载体pL35P40SN，用其转染肝癌细胞并经G418选择后，上清中的表达产物对淋巴母细胞的刺激能力显著超过12.5 ng/ml参照IL-12的效应。在与抗IL-12的中和性单克隆抗体(MAB219)作用后，其活性大大减弱。
, 百拇医药
2.4 IL-12的免疫学鉴定 对经免疫浓缩的转导细胞上清及未经浓缩的细胞裂解进行Western blot分析，结果在70 kD处可见有特异性蛋白条带。浓缩上清产物加入2-巯基乙醇后，此70 kD的条带消失(图略)。
3 讨论
IL-12最初是两个实验室分别从不同的人B淋巴母细胞瘤株中得到的。在生理条件下，吞噬性的抗原递呈细胞如DC和巨噬细胞而非B淋巴细胞是机体IL-12产生的主要细胞[7]。应用RT-PCR技术，从来自北京地区的人DC中克隆了IL-12 p40 cDNA，经序列测定证实为人的IL-12 p40的编码基因。IL-12p40基因在第210位密码子上存在着独特的特征，在239和291位密码子上与已报道的NKSFp40序列不同，但与CLMF的序列相同。为排除所克隆的基因变异是由Taq酶错误所引发，我们对两个质粒分别进行序列分析，结果完全一致。生物学功能实验证明转染细胞的上清液中表达了IL-12所具有的特异性生物学活性，Western blot分析显示有特异性的蛋白条带。这表明人IL-12p40基因序列可能存在多态性，这一假设有待于进一步验证。
, 百拇医药
IL-12通过作用于T细胞和NK细胞而发挥其生物学作用[7]。在本实验中，我们对其生物学活性的测定主要是根据其能刺激PHA活化的淋巴细胞增殖而设计的，利用IL-12p70的特异性抗体来捕捉样品中的IL-12，经洗涤后去除了一些其它的刺激或抑制淋巴细胞增殖的因子，能较客观地反映出IL-12的生物学活性。对各种不同表达载体转染细胞上清的检测发现，只有p35和p40基因共转染同一细胞时才能产生出有活性的IL-12，表明有功能的IL-12蛋白的产生需要p35和p40基因在同一细胞中的共同表达。为此，我们利用pLXPXSN构建了IL-12的双亚基共表达载体，在其转染细胞后能够产生既有较强生物活性又有免疫化学特征的IL-12。
作者简介：曲春枫，女，免疫学博士生；
孙宗棠，男，教授，博士生导师，主要从事肝癌病因及免疫预防的研究
4 参考文献
, 百拇医药
1 Wolf S F,Temple P A,Kobayashi M et al.Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor,a heterodimeric cytokine with multiple biologic effect of T and natural killer cells.J Immunol,1991;146:3074
2 Stern A S,Podlaski F J,Hulmes J D et al.Purification to homogeneity and partial characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor from human B-lymphoblastoid cells.Proc Natl Acad Sci USA,1990;87:6808
3 Gubler U,Chua A O,Schoenhaut D S et al.Coexpression of two distinct genes is required to generate secreted bioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor.Proc Natl Acad Sci USA,1991;88:4143
, http://www.100md.com
4 Chomozynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochem,1987;162:156
5 Sambrook,Fritsch,Maniatis ed.金冬雁，黎孟枫 译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：888-897
6 Ma X,Chow J M,Gri G et al.The interleukin-12 p40 gene promoter is primed by IFN-γ in monocytic cells.J Exp Med,1996;183:147
7 Trinchieri G.Interleukin-12:a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity.Annu Rev Immunol,1995;13:251
〔收稿1998-04-10 修回1998-07-01〕, http://www.100md.com
单位：中国协和医科大学肿瘤研究所，北京100021
关键词：人IL-12；树突状细胞；DNA序列；生物学活性
中国免疫学杂志990104 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：克隆中国人IL-12 p40基因，构建IL-12的真核基因表达载体。方法：采用RT-PCR从北京地区人脐血树突状细胞(DC)中克隆IL-12 p40cDNA基因，并进行序列分析。利用pcDNA3.1和pLXPXSN构建IL-12表达载体，转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人DC中IL-12 p40cDNA基因210位密码子有独特的结构，为GCC(Ala)。并且239和291位密码子与已报道的NKSF和CLMF p40序列各有异同，在与国外提供的p35基因共同转染细胞后能产生功能性的IL-12。用其构建的IL-12双亚基共表达逆转录病毒载体在转染肝癌细胞株并经选择后，上清液中有较高的具有刺激淋巴母细胞增殖活性的IL-12。Western blot分析结果显示，在70 kD处有特异性的蛋白条带出现。结论：支持人IL-12p40基因可能存在着多态性的假设；IL-12的产生需要p35和p40基因的共同表达。
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Cloning,sequence analysis and biological characterization of human recombinant IL-12
QU Chun-Feng ，SUN Zong-Tang .
Cancer Institute,Peking Union Medical College,Beijing 100021
Abstract Objective：Cloning IL-12p40 from Chinese and constructing human recombinant IL-12 expression vector.Methods：By using RT-PCR to clone IL-12 p40cDNA from the mRNA extracted from cord blood dendritic cells(DC) of Beijing newborns' and then sequenced.Expression vectors encoding the IL-12 subunits p35,p40 and IL-12 bicistronic expression vector were constructed by using pCDNA3.1 and pLXPXSN,and then transfected human heptocellular carcinoma(HCC) cell line by lipofection.Results:IL-12 cloned from DC of Beijing has unique structure in codon 210,being GCC(Ala).The 239 and 291 codons are the same as CLMF p40 but different from NKSF p40.Transfection with expression vectors encoding either the p40 or the p35 of hIL-12 to HCC cell line showed that only in the case of co-transfection with both vectors in equivalent amount,the supernatant of the transfected cells showed biological activity of IL-12.Subsequently,the bicistronic retroviral vector encoding both p40 and p35 of hIL-12 was transfected the replicating HCC cell line.Following selection,the supernatant of the transduced cell colonies showed prominent biological activity in stimulating the proliferation of lymphoblasts.Western blot showed the appearance of the characteristic 70 kD band.Conclusion:The above data support the hypothesis that the p40 gene of human IL-12 may be polymorphic.
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Key words Human IL-12 Dendritic cells DNA sequence Biological activity
自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)[1]是从EBV转化细胞系RPMI-8866中纯化得到的一种细胞因子，作用于T细胞和NK细胞而刺激其产生IFN-γ，增强其细胞毒活性，并促进这两种细胞的增殖等。同期，另一实验室从EBV转化的细胞系NC-37中纯化得到了细胞毒性T细胞成熟因子(CLMF)[2]，其生物学作用和结构与NKSF相同，现统一命名为IL-12[3]。它是由p40和p35两条多肽链组成一个p70异二聚体。比较已发表的NKSF和CLMF的序列可见，两条链间存在有个别氨基酸差异，这提示IL-12可能存在有多态性。最近我们从北京地区人脐带血DC中克隆了一个新的IL-12p40基因，构建了IL-12双基因共表达载体，在肝癌细胞株中表达出了具有生物学及免疫学活性的人IL-12。
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1 材料与方法
1.1 菌株与载体 大肠杆菌DH5α及表达载体pcDNA3.1(5.4 kb)购自Invitrogen。逆转录病毒载体pLXPXSN(6.4 kb)为一双基因表达载体，由NIH的Richard Morgan惠赠。
1.2 克隆质粒p35 NKSF14-1-1 由ATCC提供，NotⅠ/SalⅠ酶切1.3 kb片段包含IL-12 p35的完整编码基因。
1.3 引物设计与合成 根据文献[1]报道的序列，共设计4条引物用于克隆IL-12 p40 cDNA，其中59043：5′-GCCCAGAGCAAGATGTG-3′(2-18),59044:5′-GTCTATTCCGTTGTGTC-3′(1077-1061)为p40的外套引物。55684：5′-CAGAGCAAGATGTGTCAC-3′(5-22)，55685：5′-TGGTCAGAACCTAACTG-3′(1011-994)为p40的内套引物。上述引物均在计算机上进行复检，委托CyberSyn公司合成。
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1.4 主要试剂 IFN-γ，抗IL-12 p70特异性单抗MAB611(IL-12捕捉抗体)，MAB219(IL-12中和抗体)，BAF219(生物素标记的羊抗人IL-12 p70免疫血清)均购自R&D公司。LPS购自Sigma；限制性内切酶及其它酶类为华美公司和Promega的产品；TA克隆试剂盒为Invitrogen产品。
1.5 逆转录(RT)和巢式PCR进行IL-12 p40基因扩增与克隆 培养来自北京地区的人成熟脐血DC，加入IFN-γ和LPS进行诱导后一步法提取细胞总RNA[4]。采用PE公司的Gene Amp RNA PCR试剂盒，逆转录成IL-12 p40 cDNA第一条链，所用引物为59044。然后巢式PCR扩增IL-12 p40链。第1次PCR所用引物为59043和59044，第2次PCR所用引物为55684和55685。第2次PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实在相应位置上出现明显的条带后，将此新鲜产物插入到TA克隆载体pCRTM2.1中，具体操作按说明书进行。小量提取质粒DNA后酶切鉴定PCR确定方向。
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1.6 p40克隆质粒的序列分析 采用Promega公司Wizard试剂盒小量提取质粒DNA，委托北京赛因思公司采用T7 Promoter和M13 Reverse primer引物在ABI377自动序列分析仪上进行正反两个方向的序列分析。
1.7 p35和p40基因表达载体的构建 从p35质粒和p40质粒上酶切获得p35和p40的编码基因，分别克隆到pcDNA3.1表达载体上，构建成p35和p40基因表达载体pC35，pC40。经鉴定后提取质粒DNA，PEG纯化后用于细胞转染。
1.8 IL-12双基因表达载体pL35P40SN的构建 见图1。
图1 pL35P40SN的构建
, 百拇医药
Fig.1 Construction of pL35P40SN
1.9 IL-12在人肝癌细胞中的表达 采用GIBCO/BRL的Lipofectin进行细胞转染，操作按说明书进行。表达载体pL35P40SN经PEG纯化后转染人肝癌细胞株7701(详见表1)。转染72 h后收集上清，加G418筛选。在有明显克隆形成后，撤去G418。数天后收集培养细胞上清，进行IL-12的生物及免疫活性的检测。
1.10 IL-12生物活性的检测 IL-12特异性捕捉抗体MAB611加入到Falcon 96孔培养板中室温下过夜；PBS洗涤后，加入1% BSA-PBS封闭洗涤后加标准IL-12及待测样品。部分细胞上清先与MAB219抗体37℃作用30 min后加入。室温下放置3 h，洗涤后加入经PHA刺激的人淋巴母细胞，37℃，5% CO2培养24 h，加入3H-TdR后培养18 h，收集细胞，计数同位素掺入量。
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1.11 Western blot 参照文献[5]进行。经MAB611浓缩的转导细胞上清及未经浓缩转导细胞裂解物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上。用生物素标记的羊抗人IL-12免疫血清(BAF219)作为第一抗体，按ABC法显色。
2 结果
2.1 北京地区人脐血DC IL-12 p40 cDNA的克隆 采用IFN-γ和LPS对细胞诱导后[6]经IL-12p40外套下游特异性引物59044逆转录合成其cDNA第一条链，然后进行巢式PCR。第二次PCR后在略大于1 000 bp位置上出现高亮度条带(图2)。
图2 RT-PCR扩增IL-12p40 cDNA片段的电泳图谱
Fig.2 Electrophorectic profile of RT-PCR pro-duct for p40
, 百拇医药
Note:Lane 1.products after the first round PCR；Lane 2.products after the second round of PCR showing a clear band around 1 000 bp(annealing temperature is 56℃ Mg2+ is 1.5 mmol/L)；Lane 3.products after the second round of PCR(annealing temperature is 58℃ Mg2+ is 1.4 mmol/L)；Lane 4.DNA marker
表1 转染细胞上清对PHA活化的淋巴母细胞的增殖作用
Tab.1 Biological activity of transfected cells supernatant in stimulating lymphoblasts IL-12
, 百拇医药
(ng/ml)
3 H-TdR
incorporation(×103)
Plasmids for
transfection
3 H-TdR
incorporation(×103)
0
26.30±0.60
pCDNA3
, 百拇医药 25.48±0.10
0.1
32.56±0.16
pC35
26.39±0.19
0.5
37.44±0.25
pC40
25.63±0.22
2.5
39.23±0.52
pC35+pC40
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39.83±0.44
12.5
42.51±0.61
pL35P40SN
53.47±0.32
pLXPXSN
28.43±0.22
表2 不同IL-12p40 cDNA结构特征的比较
Tab.2 Comparison of hIL-12 p40 cDNA sequence feature p40 cDNA
Codon 210
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Codon 239
Codon 291
phDCp40
GCC(Ala)
AAG(Lys)
ACG(Thr)
NKSF.p40
GTC(Val)
AAC(Asn)
ACC(Thr)
CLMF.p40
GTC(Val)
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AAG(Lys)
ACG(Thr)
2.2 IL-12 p40克隆的序列分析 对两个经鉴定有正确插入的p40 cDNA克隆分别进行正反两个方向的序列分析，结果完全一致。将所得序列与NKSF(Accession ＃M65290)和CLMF(Accession ＃M65272)进行比较，结果发现我们所克隆的p40基因有一完整读码框架，其绝大部分与上述序列一致，但在第210位密码子上存在着独特结构，是GCC(Ala)而非GTC(Val)，见表2。此外，在239和291密码子也各有异同。将此质粒命名为phDCp40。
2.3 IL-12的表达及其生物学活性鉴定 对人肝癌细胞株7701分别进行了pC35,pC40,pC35+pC40的转染，细胞转染后72 h收集其上清进行生物学活性的鉴定。结果见表1。pC35和pC40基因只有在等量共转染时才能测出有功能的IL-12，其对淋巴母细胞的刺激水平与2.5 ng/ml的参照IL-12相当。我们又进一步构建了IL-12的双亚基共表达载体pL35P40SN，用其转染肝癌细胞并经G418选择后，上清中的表达产物对淋巴母细胞的刺激能力显著超过12.5 ng/ml参照IL-12的效应。在与抗IL-12的中和性单克隆抗体(MAB219)作用后，其活性大大减弱。
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2.4 IL-12的免疫学鉴定 对经免疫浓缩的转导细胞上清及未经浓缩的细胞裂解进行Western blot分析，结果在70 kD处可见有特异性蛋白条带。浓缩上清产物加入2-巯基乙醇后，此70 kD的条带消失(图略)。
3 讨论
IL-12最初是两个实验室分别从不同的人B淋巴母细胞瘤株中得到的。在生理条件下，吞噬性的抗原递呈细胞如DC和巨噬细胞而非B淋巴细胞是机体IL-12产生的主要细胞[7]。应用RT-PCR技术，从来自北京地区的人DC中克隆了IL-12 p40 cDNA，经序列测定证实为人的IL-12 p40的编码基因。IL-12p40基因在第210位密码子上存在着独特的特征，在239和291位密码子上与已报道的NKSFp40序列不同，但与CLMF的序列相同。为排除所克隆的基因变异是由Taq酶错误所引发，我们对两个质粒分别进行序列分析，结果完全一致。生物学功能实验证明转染细胞的上清液中表达了IL-12所具有的特异性生物学活性，Western blot分析显示有特异性的蛋白条带。这表明人IL-12p40基因序列可能存在多态性，这一假设有待于进一步验证。
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IL-12通过作用于T细胞和NK细胞而发挥其生物学作用[7]。在本实验中，我们对其生物学活性的测定主要是根据其能刺激PHA活化的淋巴细胞增殖而设计的，利用IL-12p70的特异性抗体来捕捉样品中的IL-12，经洗涤后去除了一些其它的刺激或抑制淋巴细胞增殖的因子，能较客观地反映出IL-12的生物学活性。对各种不同表达载体转染细胞上清的检测发现，只有p35和p40基因共转染同一细胞时才能产生出有活性的IL-12，表明有功能的IL-12蛋白的产生需要p35和p40基因在同一细胞中的共同表达。为此，我们利用pLXPXSN构建了IL-12的双亚基共表达载体，在其转染细胞后能够产生既有较强生物活性又有免疫化学特征的IL-12。
作者简介：曲春枫，女，免疫学博士生；
孙宗棠，男，教授，博士生导师，主要从事肝癌病因及免疫预防的研究
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〔收稿1998-04-10 修回1998-07-01〕, http://www.100md.com