外源血小板生成素基因体内导入对循环免疫因子水平的影响
作者：赵建增 刘 丽 梅英杰
单位：空军总医院空军临床分子生物学研究中心，北京 100036
关键词：血小板生成素；免疫调节；IFN-γ；TNF-α；IL-2；组织相容性抗原
中国免疫学杂志990303 中国图书分类号 Q511 R392.12 R392.11
摘 要 目的：研究外源TPO基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人TPO的真核表达质粒pcDNA3/hTPO包裹后，注射到Balb/c鼠的后肢肌肉内，用ELISA法检测小鼠血液中多种细胞因子的水平。结果：在TPO cDNA转移到体内后，血液中IFN-γ、TNF-α和IL-2迅速升高。其中，IFN-γ与血小板计数呈明显负相关，并且在血小板计数回落后，保持在对照水平的9～12倍；TNF-α仅在第1周内与之成正相关，但可达对照水平的120倍；IL-2升高幅度较小，与TPO水平相一致。血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势，与IL-2的变化类似 ；而Ⅰ型分子与TNF-α的变化相似。结论：TPO在多方面刺激了机体免疫机能，而免疫因子如IFN-γ在血小板生成过程中起重要的调节作用。
, 百拇医药
Effect of thrombopoietin gene delivery on the concentration of serum cytokines in mice
ZHAO Jian-Zeng,LIU Li,MEI Ying-Jie.
Laboratory of Gene Therapy,Center for Clinical Molecular Biology,General Hospital of Air Force,Beijing 100036
Abstract Objective：To investigate the effect of TPO on the expression of cytokines.Methods：The liposome-coated DNA of plasmid pcDNA3 carring human thrombopoietin(TPO) cDNA was intramuscularly administered into Balb/c mice.The serum cytokine levels were determined using ELISA.Results:Soon after the gene delivery,serum IFN-γ,TNF-α and IL-2 abruptly increased.IFN-γ level was negatively associated with platelet count(PLTC) in the stage of PLTC declination,it reached to 9～12 folds more than that of the controls.Although TNF-α level had reached 120 folds more than that of the control in the first week,positively associated with the PLTC. The increase of IL-2 was not significant. Furthermore,class Ⅱ molecules of major histocompatibility were also increased, while class I molecules showed no significant changes except the first week.Conclusion:TPO might participate in immunoregulation.And IFN-γ might play key role in down regulation of the thrombopoiesis.
, 百拇医药
Key words Thrombopoietin Immunoregulation IFN-γ TNF-α IL-2 Histocompatibility antigens
一般认为，血小板生成素(TPO)是巨核系特异的促生长因子，由于分子结构与EPO有高度的同源性，它同样能诱导粒/巨核系集落形成单位和红系爆式集落形成单位的增生。另外，不仅在巨核系细胞中，而且在肝、肾、脾以及肌肉组织、上皮细胞、肝细胞中也都发现TPO mRNA转录[1]，提示TPO是一种多能分子。我们利用质粒载体介导hTPO经肌肉组织转移，通过基因表达实现TPO对巨核细胞和血小板的促生长作用[2]。鉴于TPO基因注射后，小鼠血小板与巨核系集落形成单位(CFU-MK)二者的增长以及CFU-MK与TPO水平的不一致[3]，提示在机体内诱发了与血小板生成相关的负调节机制。以基因治疗鼠的脾脏组织学变化为线索[4]，本文研究了具有造血调控意义的免疫因子在血小板生成中的变化规律。
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1 材料与方法
1.1 动物 Balb/c小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物中心。
1.2 基因及载体 人TPO cDNA由本中心从肝总RNA中经RT-PCR获得，其功能区片段的原核表达载体pSTPO及真核表达载体均由本中心构建。
1.3 抗TPO血清制备 携带pSTPO质粒的DH5a的大肠杆菌，经IPTG诱导表达后，通过电泳从中分离相应片段。以此片段免疫家兔，获得的抗血清用于基因治疗鼠体内TPO表达水平的检测。
1.4 基因转移 把pcDNA3/hTPO质粒与lipofectin(GIBCO)按5:1(μg:μl)混合后，置室温10 min，以60 μg/只注射到小鼠后肢肌肉组织内。在一定时间内采集血液，分离血浆，用于各种细胞因子或免疫相关分子的检测。鉴于空质粒导入不能提高小鼠血小板计数，也不能使小鼠耐受环磷酰胺的毒性(待发表材料)，本试验未设空质粒对照。
, 百拇医药
1.5 IL-2、TNF-α和IFN-γ的ELISA检测 IL-2和IFN-γ的ELISA kit购自DuPont NEN公司;TNF-α ELISA kit购自邦定生物技术公司。基因治疗鼠和对照鼠的血清按kit要求进行检测。IFN-γ、TNF-α 和IL-2的敏感性分别为3、100和31 pg/ml。按标准曲线求得不同时间的相关因子的浓度。
1.6 组织相容性抗原的检测 鉴于未能得到小鼠组织相容性抗原及其抗体，本文用人HLA-ABC和HLA-DR抗体建立了替代ELISA检测方法，用于判定小鼠血液中游离组织相容性抗原的变化。100 μl血清于4℃过夜包被96孔酶标板，此后依次与抗HLA-ABC和HLA-DR抗体(1:1 000，华美公司)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG各温育1 h，用含2% Tween 20的PBS洗板，四甲基联苯胺盐酸盐显色，2 mol/L 硫酸中止反应。在Bio-Rad Model 450 Microplate读取OD值，以未加酶标抗体的孔为空白对照。
, 百拇医药
1.7 血小板计数及血浆中TPO浓度的检测 血小板计数按直接计数法进行，TPO按1.6方法检测，抗-TPO血清的工作浓度为1:100。
2 结果
2.1 血浆IFN-γ、TNF-α以及IL-2的动态变化 在TPO基因转移后不到24 h，血浆中此3种细胞因子即出现明显升高。其中，IFN-γ在前72 h内变化幅度较小，于第1周末才陡然增高至对照组小鼠的9～12倍，并持续到4 w以后;TNF-α在转移初期一过性升高，最高达到对照组的120倍，但1 w后回落到对照水平，甚至更低;IL-2在基因治疗后始终处于增高水平，与血浆中TPO的变化基本一致见图1、2。血小板计数变化见文献[2]。
图1 TPO基因导入鼠血液循环中细胞因子的动力学变化
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Fig.1 Circulating cytokines dynamics of TPO gene transferred mice
图2 血液中可溶性组织相容性抗原及所表达hTPO的变化
Fig.2 Changes in circulating histocompatibility antigens and the expressed hTPO
2.2 组织相容性抗原的变化特点 鉴于未能建立更精细的检测方法，本研究以各组酶标记样品的光吸收值作为其浓度变化参照值。从图2可以看出，Ⅰ类抗原的变化与TNF-α相对应；Ⅱ类抗原与IL-2相一致。
3 讨论
, 百拇医药 TPO刺激血小板生成这一功能是作用在多个环节的，包括巨核细胞的分化、增殖和血小板释放等。多种因素与血小板水平的调节有关，本文主要研究了免疫因子和可溶性组织相容性抗原与TPO表达的关系。
IFN-γ是一种造血抑制因子，对多种造血祖细胞包括CFU-MK的增殖有抑制作用[5]。在TPO基因转移后，IFN-γ与血小板计数呈现负相关，它的快速升高与血小板计数降低相吻合，它的持续高水平伴随的是血小板计数的波动性变化。TNF-α是造血干细胞和祖细胞的生理调节因子，在体外与其他因子共刺激时，或形成促进或形成抑制，依其配合的因子而异。IFN-γ与TNF-α的协同作用的结果常是对祖细胞的抑制。本研究中，TNF-α与血小板计数呈正相关性，它在血浆中的升高仅出现在基因治疗后的1 w 内，此后不论血小板的变化如何，它均保持在正常水平或略有低下。Liu等人报道，TNF-α能刺激人巨核细胞株的增殖[6]，据此似可认为，TNF-α协同性地促进血小板计数升高，但却不是主要因素。IL-2对造血机能的调控都是通过IFN-γ和TNF-α的介导的，对其他祖细胞表现抑制作用。Ⅱ类组织相容性抗原也参与造血抑制。它们在TPO高表达中变化的意义还不明了。
, 百拇医药
IFN-γ、TNF-α和IL-2是重要的免疫调节因子，又是内皮细胞的活化因子，它们的生成增加提示其生成细胞包括T淋巴细胞和巨噬细胞及内皮细胞的活化。Ⅱ类组织相容性抗原参与辅助性T淋巴细胞对抗原的识别。TPO基因治疗过程中的这些分子生物学变化提示机体处于一种免疫活动状态，包括多种免疫细胞的活化。我们的研究显示，外源TPO基因在体内的表达，使小鼠骨髓、胸腺、脾脏以及外周血中T淋巴细胞的组成发生了明显的改变[7]，这些变化为细胞因子的生成增加提供了细胞学依据。TPO介导免疫的途径可能不止一种，TPO能刺激一种干扰素诱导基因的表达[8]，诱导内皮细胞增殖和表达粘附分子[9]，似为直接作用。巨核细胞能释放内皮细胞生长因子[10]，从而诱发内皮细胞活化，这是TPO的间接作用途径。我们还注意到，一些内分泌因素也在其间发挥作用(资料待发表)。但要充分阐明TPO的作用模式，还需进一步研究。
作者简介：赵建增，男，36岁，博士后，副研究员，主要从事肿瘤、造血机能障碍、皮肤病的基因治疗等研究
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4 参考文献
1 Kaushansky K. Thrombopoietin: the primary regulator of platelet production. Blood, 1995; 86:419
2 Zhao J Z, Liu L, Li Y. Promotion platelet production by hTPO cDNA injection. Hematologica, 1997;83(3):383
3 赵建增,刘 丽,陈惠仁 et al. 血小板生成素基因在体内的表达及对造血祖细胞增殖活性的影响. 中国生物化学与分子生物学学报, 1998;14(2):117
4 赵建增，刘 丽，李 奕 et al.TPO基因注射促进血小板生成的研究.军医进修学院学报, 1998;19(1):40
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5 Carlo-Stella C, Cazzola M, Ganser A et al. Synergistic antiproliferative effect of recombinant interferon-gamma with recombinant interferon-alpha on chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitor cells (CFU-GEMM，CFU-Mk BFU-E，and CFU-GM). Blood，1988;72:1293
6 Liu R Y, Fan C, Mitchell S et al. Tumor necrosis factor (TNF)-α stimulates the proliferation of the human factor-dependent megakaryocytic cell line, MO7E. Exp Hematol，1996;24:1071
, http://www.100md.com
7 Zhao J Z, Mei Y J, Guo Z K et al. Thrombopoietin: a potential T helper lymphocyte stimulator -changes in T lymphocyte differentiation and blood cytokine levels in thrombopoietin cDNA transferred mice. Heamatologica,1998;83(6):572
8 Fujimoto T, Katsutani S, Fujii T et al. Thrombopoietin induces the expression of one of the interferon-inducible gene family，9-27: an analysis of the thrombopoietin action. Blood， 1996;88(10 suppl. 1):63a
, 百拇医药
9 Mohis R, Rafii S, Greene D et al. Megakaryocytes produce vascular endothelial growth factor (VECF): increased release after stimulation and possible role in migration and platelet shedding. Exp Hematol,1996;24:1070
10 Kubota Y, Kashima M, Koishi M et al. Effects of thrombopoietin on the proliferation and cell adhesion molecule expression of human endothelial cells. Exp Hemtol,1996; 24:1069
〔收稿1997-09-25 二次修回1998-05-20〕, 百拇医药
单位：空军总医院空军临床分子生物学研究中心，北京 100036
关键词：血小板生成素；免疫调节；IFN-γ；TNF-α；IL-2；组织相容性抗原
中国免疫学杂志990303 中国图书分类号 Q511 R392.12 R392.11
摘 要 目的：研究外源TPO基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人TPO的真核表达质粒pcDNA3/hTPO包裹后，注射到Balb/c鼠的后肢肌肉内，用ELISA法检测小鼠血液中多种细胞因子的水平。结果：在TPO cDNA转移到体内后，血液中IFN-γ、TNF-α和IL-2迅速升高。其中，IFN-γ与血小板计数呈明显负相关，并且在血小板计数回落后，保持在对照水平的9～12倍；TNF-α仅在第1周内与之成正相关，但可达对照水平的120倍；IL-2升高幅度较小，与TPO水平相一致。血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势，与IL-2的变化类似 ；而Ⅰ型分子与TNF-α的变化相似。结论：TPO在多方面刺激了机体免疫机能，而免疫因子如IFN-γ在血小板生成过程中起重要的调节作用。
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Effect of thrombopoietin gene delivery on the concentration of serum cytokines in mice
ZHAO Jian-Zeng,LIU Li,MEI Ying-Jie.
Laboratory of Gene Therapy,Center for Clinical Molecular Biology,General Hospital of Air Force,Beijing 100036
Abstract Objective：To investigate the effect of TPO on the expression of cytokines.Methods：The liposome-coated DNA of plasmid pcDNA3 carring human thrombopoietin(TPO) cDNA was intramuscularly administered into Balb/c mice.The serum cytokine levels were determined using ELISA.Results:Soon after the gene delivery,serum IFN-γ,TNF-α and IL-2 abruptly increased.IFN-γ level was negatively associated with platelet count(PLTC) in the stage of PLTC declination,it reached to 9～12 folds more than that of the controls.Although TNF-α level had reached 120 folds more than that of the control in the first week,positively associated with the PLTC. The increase of IL-2 was not significant. Furthermore,class Ⅱ molecules of major histocompatibility were also increased, while class I molecules showed no significant changes except the first week.Conclusion:TPO might participate in immunoregulation.And IFN-γ might play key role in down regulation of the thrombopoiesis.
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Key words Thrombopoietin Immunoregulation IFN-γ TNF-α IL-2 Histocompatibility antigens
一般认为，血小板生成素(TPO)是巨核系特异的促生长因子，由于分子结构与EPO有高度的同源性，它同样能诱导粒/巨核系集落形成单位和红系爆式集落形成单位的增生。另外，不仅在巨核系细胞中，而且在肝、肾、脾以及肌肉组织、上皮细胞、肝细胞中也都发现TPO mRNA转录[1]，提示TPO是一种多能分子。我们利用质粒载体介导hTPO经肌肉组织转移，通过基因表达实现TPO对巨核细胞和血小板的促生长作用[2]。鉴于TPO基因注射后，小鼠血小板与巨核系集落形成单位(CFU-MK)二者的增长以及CFU-MK与TPO水平的不一致[3]，提示在机体内诱发了与血小板生成相关的负调节机制。以基因治疗鼠的脾脏组织学变化为线索[4]，本文研究了具有造血调控意义的免疫因子在血小板生成中的变化规律。
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1 材料与方法
1.1 动物 Balb/c小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物中心。
1.2 基因及载体 人TPO cDNA由本中心从肝总RNA中经RT-PCR获得，其功能区片段的原核表达载体pSTPO及真核表达载体均由本中心构建。
1.3 抗TPO血清制备 携带pSTPO质粒的DH5a的大肠杆菌，经IPTG诱导表达后，通过电泳从中分离相应片段。以此片段免疫家兔，获得的抗血清用于基因治疗鼠体内TPO表达水平的检测。
1.4 基因转移 把pcDNA3/hTPO质粒与lipofectin(GIBCO)按5:1(μg:μl)混合后，置室温10 min，以60 μg/只注射到小鼠后肢肌肉组织内。在一定时间内采集血液，分离血浆，用于各种细胞因子或免疫相关分子的检测。鉴于空质粒导入不能提高小鼠血小板计数，也不能使小鼠耐受环磷酰胺的毒性(待发表材料)，本试验未设空质粒对照。
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1.5 IL-2、TNF-α和IFN-γ的ELISA检测 IL-2和IFN-γ的ELISA kit购自DuPont NEN公司;TNF-α ELISA kit购自邦定生物技术公司。基因治疗鼠和对照鼠的血清按kit要求进行检测。IFN-γ、TNF-α 和IL-2的敏感性分别为3、100和31 pg/ml。按标准曲线求得不同时间的相关因子的浓度。
1.6 组织相容性抗原的检测 鉴于未能得到小鼠组织相容性抗原及其抗体，本文用人HLA-ABC和HLA-DR抗体建立了替代ELISA检测方法，用于判定小鼠血液中游离组织相容性抗原的变化。100 μl血清于4℃过夜包被96孔酶标板，此后依次与抗HLA-ABC和HLA-DR抗体(1:1 000，华美公司)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG各温育1 h，用含2% Tween 20的PBS洗板，四甲基联苯胺盐酸盐显色，2 mol/L 硫酸中止反应。在Bio-Rad Model 450 Microplate读取OD值，以未加酶标抗体的孔为空白对照。
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1.7 血小板计数及血浆中TPO浓度的检测 血小板计数按直接计数法进行，TPO按1.6方法检测，抗-TPO血清的工作浓度为1:100。
2 结果
2.1 血浆IFN-γ、TNF-α以及IL-2的动态变化 在TPO基因转移后不到24 h，血浆中此3种细胞因子即出现明显升高。其中，IFN-γ在前72 h内变化幅度较小，于第1周末才陡然增高至对照组小鼠的9～12倍，并持续到4 w以后;TNF-α在转移初期一过性升高，最高达到对照组的120倍，但1 w后回落到对照水平，甚至更低;IL-2在基因治疗后始终处于增高水平，与血浆中TPO的变化基本一致见图1、2。血小板计数变化见文献[2]。
图1 TPO基因导入鼠血液循环中细胞因子的动力学变化
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Fig.1 Circulating cytokines dynamics of TPO gene transferred mice
图2 血液中可溶性组织相容性抗原及所表达hTPO的变化
Fig.2 Changes in circulating histocompatibility antigens and the expressed hTPO
2.2 组织相容性抗原的变化特点 鉴于未能建立更精细的检测方法，本研究以各组酶标记样品的光吸收值作为其浓度变化参照值。从图2可以看出，Ⅰ类抗原的变化与TNF-α相对应；Ⅱ类抗原与IL-2相一致。
3 讨论
, 百拇医药 TPO刺激血小板生成这一功能是作用在多个环节的，包括巨核细胞的分化、增殖和血小板释放等。多种因素与血小板水平的调节有关，本文主要研究了免疫因子和可溶性组织相容性抗原与TPO表达的关系。
IFN-γ是一种造血抑制因子，对多种造血祖细胞包括CFU-MK的增殖有抑制作用[5]。在TPO基因转移后，IFN-γ与血小板计数呈现负相关，它的快速升高与血小板计数降低相吻合，它的持续高水平伴随的是血小板计数的波动性变化。TNF-α是造血干细胞和祖细胞的生理调节因子，在体外与其他因子共刺激时，或形成促进或形成抑制，依其配合的因子而异。IFN-γ与TNF-α的协同作用的结果常是对祖细胞的抑制。本研究中，TNF-α与血小板计数呈正相关性，它在血浆中的升高仅出现在基因治疗后的1 w 内，此后不论血小板的变化如何，它均保持在正常水平或略有低下。Liu等人报道，TNF-α能刺激人巨核细胞株的增殖[6]，据此似可认为，TNF-α协同性地促进血小板计数升高，但却不是主要因素。IL-2对造血机能的调控都是通过IFN-γ和TNF-α的介导的，对其他祖细胞表现抑制作用。Ⅱ类组织相容性抗原也参与造血抑制。它们在TPO高表达中变化的意义还不明了。
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IFN-γ、TNF-α和IL-2是重要的免疫调节因子，又是内皮细胞的活化因子，它们的生成增加提示其生成细胞包括T淋巴细胞和巨噬细胞及内皮细胞的活化。Ⅱ类组织相容性抗原参与辅助性T淋巴细胞对抗原的识别。TPO基因治疗过程中的这些分子生物学变化提示机体处于一种免疫活动状态，包括多种免疫细胞的活化。我们的研究显示，外源TPO基因在体内的表达，使小鼠骨髓、胸腺、脾脏以及外周血中T淋巴细胞的组成发生了明显的改变[7]，这些变化为细胞因子的生成增加提供了细胞学依据。TPO介导免疫的途径可能不止一种，TPO能刺激一种干扰素诱导基因的表达[8]，诱导内皮细胞增殖和表达粘附分子[9]，似为直接作用。巨核细胞能释放内皮细胞生长因子[10]，从而诱发内皮细胞活化，这是TPO的间接作用途径。我们还注意到，一些内分泌因素也在其间发挥作用(资料待发表)。但要充分阐明TPO的作用模式，还需进一步研究。
作者简介：赵建增，男，36岁，博士后，副研究员，主要从事肿瘤、造血机能障碍、皮肤病的基因治疗等研究
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4 参考文献
1 Kaushansky K. Thrombopoietin: the primary regulator of platelet production. Blood, 1995; 86:419
2 Zhao J Z, Liu L, Li Y. Promotion platelet production by hTPO cDNA injection. Hematologica, 1997;83(3):383
3 赵建增,刘 丽,陈惠仁 et al. 血小板生成素基因在体内的表达及对造血祖细胞增殖活性的影响. 中国生物化学与分子生物学学报, 1998;14(2):117
4 赵建增，刘 丽，李 奕 et al.TPO基因注射促进血小板生成的研究.军医进修学院学报, 1998;19(1):40
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5 Carlo-Stella C, Cazzola M, Ganser A et al. Synergistic antiproliferative effect of recombinant interferon-gamma with recombinant interferon-alpha on chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitor cells (CFU-GEMM，CFU-Mk BFU-E，and CFU-GM). Blood，1988;72:1293
6 Liu R Y, Fan C, Mitchell S et al. Tumor necrosis factor (TNF)-α stimulates the proliferation of the human factor-dependent megakaryocytic cell line, MO7E. Exp Hematol，1996;24:1071
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7 Zhao J Z, Mei Y J, Guo Z K et al. Thrombopoietin: a potential T helper lymphocyte stimulator -changes in T lymphocyte differentiation and blood cytokine levels in thrombopoietin cDNA transferred mice. Heamatologica,1998;83(6):572
8 Fujimoto T, Katsutani S, Fujii T et al. Thrombopoietin induces the expression of one of the interferon-inducible gene family，9-27: an analysis of the thrombopoietin action. Blood， 1996;88(10 suppl. 1):63a
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9 Mohis R, Rafii S, Greene D et al. Megakaryocytes produce vascular endothelial growth factor (VECF): increased release after stimulation and possible role in migration and platelet shedding. Exp Hematol,1996;24:1070
10 Kubota Y, Kashima M, Koishi M et al. Effects of thrombopoietin on the proliferation and cell adhesion molecule expression of human endothelial cells. Exp Hemtol,1996; 24:1069
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