CD40反义RNA的构建及其诱导Balm细胞凋亡
作者：王艳华 杨贵贞
单位：白求恩医科大学免疫学教研室，长春130021
关键词：CD40反义RNA；Balm细胞；凋亡
中国免疫学杂志990302 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：探讨CD40反义RNA对Balm细胞的影响。方法：用RT-PCR法从人扁桃体细胞获得CD40 cDNA，双脱氧终止法测序正确后，构建编码膜内段CD40基因的反义RNA表达载体(pcDNA3-CD40)，将其导入人B细胞株Balm细胞。结果：发现转导后细胞生长代谢受抑，细胞体积缩小，有细胞碎块脱落，FACS检测出现典型凋亡峰；细胞发光减弱，发光值明显低于正常对照组及转导空载体组(P<0.001)，与放线菌素D(ActD)、氨甲喋呤(MTX)、肿瘤坏死因子(TNF)处理组有相似的形态及发光改变。结论：提示CD40反义RNA特异性阻断了CD40正常功能的发挥，导致细胞凋亡。
, 百拇医药
The construction of CD40 antisense RNA and its apoptotic effect on Balm cell
WANG Yan-Hua,YANG Gui-Zhen.
Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
Abstract Objective:In order to explore the effects of CD40 antisense RNA on Balm cell.Methods:Human CD40 cDNA was acquired by RT-PCR form human tonsil cell by CD40 specific primers. The cloned CD40 products were sequenced to confirmed the specific CD40 coding region fragments by dideoxy-mediated-chain termination method.Then CD40 cyto-plasmic region(176 bp) antisense RNA expression vector of pcDNA3-CD40 was constructed,which was transfected into B cell line-Balm cell.Results:The transfected Balm cell showed apoptotic changes such as condense of nucleus and dark staining,apoptotic peak under FACS examination compared with the Balm cell transfected with only pcDNA3 vector.The luminometer counts of those CD40 antisense RNA treated cells are much lower than those of the controls(P<0.001).Conclusion:The results suggest that CD40 antisense RNA can inhibit normal function of CD40 and induce apoptosis of CD40 bearing cells.
, 百拇医药
Key words CD40 antisense RNA Balm cell Apoptosis
CD40是存在于B细胞、抗原提呈细胞及某些癌变上皮细胞表面的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白[1]。它与存在于T细胞、肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面的CD40配体(CD40 ligand,CD40L)反应，参与双方细胞的活化及效应功能的发挥。在免疫反应、炎症及肿瘤的发生发展中发挥重要作用[2，3]。这些功能的发挥是通过CD40介导信号传递而完成，用CD40反义RNA特异性封闭CD40基因，阻断CD40的表达，中止其信号传递，在炎症与肿瘤的治疗中可能有一定意义。因此本文构建编码CD40膜内段基因的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40，导入B细胞传代细胞系Balm细胞，观察CD40基因特异性封闭后Balm细胞的形态与功能变化。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 CD40反义RNA表达载体的构建
1.1.1 CD40膜内基因片段的获得 用RT-PCR法从人扁桃体细胞中获得CD40基因片段。上游引物为5′-AAGTCGACATGGTTCGCCTGCCTCTGCAGTGCG-TCCTCTG-3′；下游引物为5′-CATAAGCTTTCATCTCA-GCCGATCCTGGGGACCACAGACA-3′，PCR产物用双脱氧终止法测序正确后，用下游引物中的Hind Ⅲ限制性酶切位点及CD40 cDNA 654 bp处的BamHI酶切位点，用此二酶对PCR产物酶切处理，冻融法回收目的片段。
1.1.2 真核表达载体的处理及反义RNA表达载体的构建 真核表达载体pcDNA3，在多克隆位点处用BamHI、HindⅢ双酶切线性化。将CD40目的片段与pcDNA3线性化载体定向反向连接，重组子即为编码CD40膜内段基因的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40。
, 百拇医药
1.2 细胞培养及pcDNA3-CD40反义RNA的转导 按常规方法进行。
1.3 转导细胞阳性克隆筛选 Balm细胞转导72 h后，更换含G418 800 μg/ml的 DMEM加压培养筛选，10 d后可见抗性细胞生长，改用含200 μg/ml G418的DMEM维持培养2 w，观察细胞生长代谢，收获细胞，做形态、FACS及发光学检测。
1.4 转导细胞的FACS检测 取转导细胞1×106个，用PBS缓冲液洗涤2次，70%乙醇固定过夜，上机前用PBS洗去乙醇，加入0.5 ml PCB(192 ml 0.2 mol/L Na2HPO4+18 ml 0.1 mol/L 柠檬酸，pH 7.8)室温30 min，离心弃上清，加入RNaseA常温下30 min，加入终浓度50 μg/ml PI染细胞总RNA，室温避光20 min，上机检测。
, http://www.100md.com
1.5 转导细胞发光学检测 取转导细胞1×106个，MTX终浓度10 μg/ml处理72 h、TNF终浓度10 U/ml处理20 h、ActD终浓度1 μg/ml处理12 h及未作任何处理的Balm细胞各1×106个，均用无血清DMEM洗2次，重悬于1 ml无血清DMEM中，置石英杯中在发光仪中检测各组细胞发光情况。
2 结果
2.1 pcDNA3-CD40反义RNA表达载体的构建
2.1.1 CD40目的基因的获得 经RT-PCR从人扁桃体细胞中获得CD40基因片段，见图1。
图1 CD40 cDNA RT-PCR电泳
, 百拇医药
Fig.1 Map of CD40 cDNA RT-PCR
Note:A.D.Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ markers B. CD40 cDNA 831 bp (whole length);C.CD40 cDNA 588 bp(intramembrane fragment)
2.1.2 pcDNA3-CD40反义RNA表达载体的获得 pcDNA3经BamHI\,HindⅢ双酶切处理的粘性末端，与上述CD40目的片段，定向反向连接产物即为pcDNA3-CD40反义RNA表达载体。构建模式图及酶切鉴定图，见图2、3。
图2 CD40反义RNA表达载体构建模式图
, 百拇医药
Fig.2 The construction model of expression vector of CD40 antisense RNA
图3 pcDNA3-CD40反义RNA酶切鉴定
Fig.3 Map of pcDNA3-CD40 antisense RNA by restriction enzymes
Note:A.Lambda DNA HindⅢ marker B.D. pcDNA3 plasmid；C.pcDNA3-CD40 antisense RNA by BamHI/HindⅢ;E. pcDNA3-CD40 recombinant plasmid
, 百拇医药
2.2 转导细胞凋亡的检测
2.2.1 转导细胞的生长及形态学变化 转导细胞经800 μg/ml G418筛选后，阳性细胞在G418 200 μg/ml维持培养过程中，转导pcDNA3-CD40反义RNA的Balm细胞生长受抑，培养液酸化程度变慢，镜下细胞体积缩小，出现细胞碎块，而转导pcDNA3空载体组的Balm细胞生长旺盛，体积增大，用MTX、TNF、ActD处理的细胞也出现转导pcDNA3-CD40反义RNA组细胞形态改变。
2.2.2 转导细胞的FACS检测 转导细胞经含G418 200 μg/ml DMEM培养后，进行FACS检测出现DNA亚二倍体核峰，即凋亡峰，而转导空载体Balm细胞未见凋亡峰。
2.3 转导细胞发光计数检测 经G418 200 μg/ml维持培养的转导Balm细胞、MTX、TNF、ActD处理的Balm细胞和对照组细胞各1×106个，在发光仪中检测细胞发光数值，1次/s，共计数10次，发现转导CD40反义RNA组、MTX、TNF、ActD处理组细胞发光明显低于空载体组及正常对照组细胞(P<0.001)。各组细胞发光数值见表1。
, http://www.100md.com
表1 不同因素处理Balm细胞的发光计数
Tab.1 Luminometer counts of Balm cells by different factors Group
Luminometer counts
P(compared with
control group)
A. Control
112.5±10.48
B. pcDNA3
117.9±11.18
, 百拇医药
>0.05
C. pcDNA3-CD40
86.6±7.87
<0.001
D. MTX
98.2±15.36
<0.05
E. TNF
91.0±9.68
<0.05
F. ActD
84.6±9.86
, 百拇医药
<0.001
Note:C vs B,P<0.001；D.E or F vs B,P<0.05；D.E or F vs C,P>0.05
3 讨论
自从80年代初由Izant和Weitraub首次报道胸腺嘧啶激酶(TK)基因反义RNA(Antisense RNA)能选择性抑制真核细胞TK基因表达以来[4]，反义RNA作为一种调控特定基因表达的手段已被广泛采用。利用反义RNA分子能与特异mRNA分子互补的特点，特异性封闭某些基因使其不表达或低表达，从而影响细胞的代谢活性及功能。本文构建了编码CD40膜内段cDNA的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40，导入人B细胞传代细胞系Balm细胞，观察了其对CD40 mRNA阻断后Balm细胞生长代谢及形态的变化。文献报道CD40膜内段234位苏氨酸突变导致细胞生长受抑，CD40的功能性表达抑制B细胞凋亡的发生。本实验发现CD40膜内段176 bp的反义RNA表达载体导入Balm细胞后，细胞生长缓慢，体积变小，有细胞碎块出现，化学发光明显低于对照组及空载体组(P<0.001)，与MTX、TNF、ActD处理组Balm细胞变化相似，FACS检测出现凋亡峰，说明CD40反义RNA发挥了其特异性封闭CD40 mRNA表达的作用，抑制细胞的生长，促进细胞凋亡的发生。这一结果为CD40反义RNA对B细胞瘤的实验性基因治疗、CD40特定区段功能分析提供了依据。
, 百拇医药
王艳华 中国预防医学科学院病毒学研究所形态室，北京100052
作者简介：王艳华，女，35岁，现为博士后
4 参考文献
1 Stamenkovic I,Clark E A,Seed B A.B-lymphocyte activation molecule related to nerve growth factor receptor and induced by cytokines in carcinomas.EMBO J,1989;8:1403
2 Stout R D,Suttles J. The many role of CD40 in cell-mediated inflammatory response.Immunol Today,1996;17:487
, 百拇医药
3 Knox K A,Gordon J. Protein tyrosine phosphorylation is mandantory for CD40-mediated rescue of germinal center B cells from apoptosis.Eur J Immunol,1993;23:2578
4 Izant J G,Weitraub H.Inhibition of thymidine kinase gene expression by antisense RNA: a molecular approach to genetic analysis.Cell,1984;36:1007
〔收稿1997-12-01 修回1998-03-10〕, 百拇医药
单位：白求恩医科大学免疫学教研室，长春130021
关键词：CD40反义RNA；Balm细胞；凋亡
中国免疫学杂志990302 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：探讨CD40反义RNA对Balm细胞的影响。方法：用RT-PCR法从人扁桃体细胞获得CD40 cDNA，双脱氧终止法测序正确后，构建编码膜内段CD40基因的反义RNA表达载体(pcDNA3-CD40)，将其导入人B细胞株Balm细胞。结果：发现转导后细胞生长代谢受抑，细胞体积缩小，有细胞碎块脱落，FACS检测出现典型凋亡峰；细胞发光减弱，发光值明显低于正常对照组及转导空载体组(P<0.001)，与放线菌素D(ActD)、氨甲喋呤(MTX)、肿瘤坏死因子(TNF)处理组有相似的形态及发光改变。结论：提示CD40反义RNA特异性阻断了CD40正常功能的发挥，导致细胞凋亡。
, 百拇医药
The construction of CD40 antisense RNA and its apoptotic effect on Balm cell
WANG Yan-Hua,YANG Gui-Zhen.
Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
Abstract Objective:In order to explore the effects of CD40 antisense RNA on Balm cell.Methods:Human CD40 cDNA was acquired by RT-PCR form human tonsil cell by CD40 specific primers. The cloned CD40 products were sequenced to confirmed the specific CD40 coding region fragments by dideoxy-mediated-chain termination method.Then CD40 cyto-plasmic region(176 bp) antisense RNA expression vector of pcDNA3-CD40 was constructed,which was transfected into B cell line-Balm cell.Results:The transfected Balm cell showed apoptotic changes such as condense of nucleus and dark staining,apoptotic peak under FACS examination compared with the Balm cell transfected with only pcDNA3 vector.The luminometer counts of those CD40 antisense RNA treated cells are much lower than those of the controls(P<0.001).Conclusion:The results suggest that CD40 antisense RNA can inhibit normal function of CD40 and induce apoptosis of CD40 bearing cells.
, 百拇医药
Key words CD40 antisense RNA Balm cell Apoptosis
CD40是存在于B细胞、抗原提呈细胞及某些癌变上皮细胞表面的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白[1]。它与存在于T细胞、肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面的CD40配体(CD40 ligand,CD40L)反应，参与双方细胞的活化及效应功能的发挥。在免疫反应、炎症及肿瘤的发生发展中发挥重要作用[2，3]。这些功能的发挥是通过CD40介导信号传递而完成，用CD40反义RNA特异性封闭CD40基因，阻断CD40的表达，中止其信号传递，在炎症与肿瘤的治疗中可能有一定意义。因此本文构建编码CD40膜内段基因的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40，导入B细胞传代细胞系Balm细胞，观察CD40基因特异性封闭后Balm细胞的形态与功能变化。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 CD40反义RNA表达载体的构建
1.1.1 CD40膜内基因片段的获得 用RT-PCR法从人扁桃体细胞中获得CD40基因片段。上游引物为5′-AAGTCGACATGGTTCGCCTGCCTCTGCAGTGCG-TCCTCTG-3′；下游引物为5′-CATAAGCTTTCATCTCA-GCCGATCCTGGGGACCACAGACA-3′，PCR产物用双脱氧终止法测序正确后，用下游引物中的Hind Ⅲ限制性酶切位点及CD40 cDNA 654 bp处的BamHI酶切位点，用此二酶对PCR产物酶切处理，冻融法回收目的片段。
1.1.2 真核表达载体的处理及反义RNA表达载体的构建 真核表达载体pcDNA3，在多克隆位点处用BamHI、HindⅢ双酶切线性化。将CD40目的片段与pcDNA3线性化载体定向反向连接，重组子即为编码CD40膜内段基因的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40。
, 百拇医药
1.2 细胞培养及pcDNA3-CD40反义RNA的转导 按常规方法进行。
1.3 转导细胞阳性克隆筛选 Balm细胞转导72 h后，更换含G418 800 μg/ml的 DMEM加压培养筛选，10 d后可见抗性细胞生长，改用含200 μg/ml G418的DMEM维持培养2 w，观察细胞生长代谢，收获细胞，做形态、FACS及发光学检测。
1.4 转导细胞的FACS检测 取转导细胞1×106个，用PBS缓冲液洗涤2次，70%乙醇固定过夜，上机前用PBS洗去乙醇，加入0.5 ml PCB(192 ml 0.2 mol/L Na2HPO4+18 ml 0.1 mol/L 柠檬酸，pH 7.8)室温30 min，离心弃上清，加入RNaseA常温下30 min，加入终浓度50 μg/ml PI染细胞总RNA，室温避光20 min，上机检测。
, http://www.100md.com
1.5 转导细胞发光学检测 取转导细胞1×106个，MTX终浓度10 μg/ml处理72 h、TNF终浓度10 U/ml处理20 h、ActD终浓度1 μg/ml处理12 h及未作任何处理的Balm细胞各1×106个，均用无血清DMEM洗2次，重悬于1 ml无血清DMEM中，置石英杯中在发光仪中检测各组细胞发光情况。
2 结果
2.1 pcDNA3-CD40反义RNA表达载体的构建
2.1.1 CD40目的基因的获得 经RT-PCR从人扁桃体细胞中获得CD40基因片段，见图1。
图1 CD40 cDNA RT-PCR电泳
, 百拇医药
Fig.1 Map of CD40 cDNA RT-PCR
Note:A.D.Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ markers B. CD40 cDNA 831 bp (whole length);C.CD40 cDNA 588 bp(intramembrane fragment)
2.1.2 pcDNA3-CD40反义RNA表达载体的获得 pcDNA3经BamHI\,HindⅢ双酶切处理的粘性末端，与上述CD40目的片段，定向反向连接产物即为pcDNA3-CD40反义RNA表达载体。构建模式图及酶切鉴定图，见图2、3。
图2 CD40反义RNA表达载体构建模式图
, 百拇医药
Fig.2 The construction model of expression vector of CD40 antisense RNA
图3 pcDNA3-CD40反义RNA酶切鉴定
Fig.3 Map of pcDNA3-CD40 antisense RNA by restriction enzymes
Note:A.Lambda DNA HindⅢ marker B.D. pcDNA3 plasmid；C.pcDNA3-CD40 antisense RNA by BamHI/HindⅢ;E. pcDNA3-CD40 recombinant plasmid
, 百拇医药
2.2 转导细胞凋亡的检测
2.2.1 转导细胞的生长及形态学变化 转导细胞经800 μg/ml G418筛选后，阳性细胞在G418 200 μg/ml维持培养过程中，转导pcDNA3-CD40反义RNA的Balm细胞生长受抑，培养液酸化程度变慢，镜下细胞体积缩小，出现细胞碎块，而转导pcDNA3空载体组的Balm细胞生长旺盛，体积增大，用MTX、TNF、ActD处理的细胞也出现转导pcDNA3-CD40反义RNA组细胞形态改变。
2.2.2 转导细胞的FACS检测 转导细胞经含G418 200 μg/ml DMEM培养后，进行FACS检测出现DNA亚二倍体核峰，即凋亡峰，而转导空载体Balm细胞未见凋亡峰。
2.3 转导细胞发光计数检测 经G418 200 μg/ml维持培养的转导Balm细胞、MTX、TNF、ActD处理的Balm细胞和对照组细胞各1×106个，在发光仪中检测细胞发光数值，1次/s，共计数10次，发现转导CD40反义RNA组、MTX、TNF、ActD处理组细胞发光明显低于空载体组及正常对照组细胞(P<0.001)。各组细胞发光数值见表1。
, http://www.100md.com
表1 不同因素处理Balm细胞的发光计数
Tab.1 Luminometer counts of Balm cells by different factors Group
Luminometer counts
P(compared with
control group)
A. Control
112.5±10.48
B. pcDNA3
117.9±11.18
, 百拇医药
>0.05
C. pcDNA3-CD40
86.6±7.87
<0.001
D. MTX
98.2±15.36
<0.05
E. TNF
91.0±9.68
<0.05
F. ActD
84.6±9.86
, 百拇医药
<0.001
Note:C vs B,P<0.001；D.E or F vs B,P<0.05；D.E or F vs C,P>0.05
3 讨论
自从80年代初由Izant和Weitraub首次报道胸腺嘧啶激酶(TK)基因反义RNA(Antisense RNA)能选择性抑制真核细胞TK基因表达以来[4]，反义RNA作为一种调控特定基因表达的手段已被广泛采用。利用反义RNA分子能与特异mRNA分子互补的特点，特异性封闭某些基因使其不表达或低表达，从而影响细胞的代谢活性及功能。本文构建了编码CD40膜内段cDNA的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40，导入人B细胞传代细胞系Balm细胞，观察了其对CD40 mRNA阻断后Balm细胞生长代谢及形态的变化。文献报道CD40膜内段234位苏氨酸突变导致细胞生长受抑，CD40的功能性表达抑制B细胞凋亡的发生。本实验发现CD40膜内段176 bp的反义RNA表达载体导入Balm细胞后，细胞生长缓慢，体积变小，有细胞碎块出现，化学发光明显低于对照组及空载体组(P<0.001)，与MTX、TNF、ActD处理组Balm细胞变化相似，FACS检测出现凋亡峰，说明CD40反义RNA发挥了其特异性封闭CD40 mRNA表达的作用，抑制细胞的生长，促进细胞凋亡的发生。这一结果为CD40反义RNA对B细胞瘤的实验性基因治疗、CD40特定区段功能分析提供了依据。
, 百拇医药
王艳华 中国预防医学科学院病毒学研究所形态室，北京100052
作者简介：王艳华，女，35岁，现为博士后
4 参考文献
1 Stamenkovic I,Clark E A,Seed B A.B-lymphocyte activation molecule related to nerve growth factor receptor and induced by cytokines in carcinomas.EMBO J,1989;8:1403
2 Stout R D,Suttles J. The many role of CD40 in cell-mediated inflammatory response.Immunol Today,1996;17:487
, 百拇医药
3 Knox K A,Gordon J. Protein tyrosine phosphorylation is mandantory for CD40-mediated rescue of germinal center B cells from apoptosis.Eur J Immunol,1993;23:2578
4 Izant J G,Weitraub H.Inhibition of thymidine kinase gene expression by antisense RNA: a molecular approach to genetic analysis.Cell,1984;36:1007
〔收稿1997-12-01 修回1998-03-10〕, 百拇医药