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编号:10258028
异常凝血酶原单克隆抗体的制备与鉴定
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 1999年第4期
     作者:曹纯章 卜丽莎 赵 虹 王维忠

    单位:白求恩医科大学第三临床学院,长春130031

    关键词:

    中国免疫学杂志990418 中国图书分类号 R392.11

    凝血酶原是由肝脏合成的依赖维生素K的凝血因子。异常凝血酶原(Abnormal Prothrombin,APT)和凝血酶原的化学结构极其相似,区别在于:APT分子氨基端的特定位置上的谷氨酸残基未经羧基化,因而缺乏结合钙离子的结构基础,在一般凝血试验中无凝血活性。自从1984年Liebman等观察到原发性肝癌患者血浆APT水平显著升高,APT与肝癌的关系受到关注,其临床应用价值受到重视,测定方法不断改进。由于单克隆抗体建立的酶联法受外界因素影响小,可直接测出酶蛋白的含量,特异性强,灵敏度高,操作简便,是一种理想的检测方法。本试验旨在研制出抗APT的单克隆抗体,以检测出人血浆中APT的水平,建立灵敏、特异的检测方法。
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    1 材料与方法

    1.1 免疫用抗原 经生化处理,从服用华法令的羊血浆中提取、纯化APT,经SDS-PAGE鉴定为单一区带,分子量为72 kD,并与已知抗体发生特异性反应。

    1.2 杂交瘤细胞的制备 用纯化的APT免疫Balb/c小鼠,共3次,每次间隔2 w,200 μg/(次*只),免疫第3次后10 d尾静脉取血测效价,效价达1∶8以上。融合前3 d腹腔注入APT加强免疫。取免疫小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞在50%PGE作用下融合,HAT培养液选择性培养。

    1.3 克隆和检测 采用间接ELISA法,对杂交瘤细胞培养上清进行筛选,选出与APT反应阳性的杂交瘤细胞。克隆化采用显微镜操作法,用特制的弯头毛细管在倒置显微镜下吸出单个杂交瘤细胞后,逐个放入预先加有饲养细胞的培养板小孔中培养。

    1.4 单克隆抗体的制备 将杂交瘤细胞1×106接种于Balb/c小鼠腹腔中制备腹水。
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    1.5 单克隆抗体亚类的鉴定 将单抗培养上清液浓缩,与抗鼠IgG亚类血清作双扩散试验。

    1.6 免疫转印 APT经SDS-PAGE分离,在电转移系统中将凝胶蛋白转移至硝酸纤维素膜上,分别与各株单抗反应,浸入辣根过氧化物酶标记的IgG,最终以联苯二胺系统显色[见:顾方舟主编.淋巴细胞杂交瘤技术的应用.北京:人民卫生出版社,1985:23-25]。

    2 结果

    2.1 杂交瘤细胞株的建立 含阳性血清小鼠的脾脏细胞与NS-1细胞融合,悬于HAT选择性培养基中接种于24孔和96孔板,5 d左右见有明显的克隆生长,取上清用间接ELISA法重复筛选后,克隆化,获3株阳性细胞。将培养上清液浓缩后进行亚类鉴定,3株细胞系皆为IgG1,染色体计数结果为80~110(每细胞系统计10个细胞),杂交瘤细胞染色体数均超过其亲本染色体数,为二者之和。
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    2.2 单克隆抗体的纯化 小鼠腹水中除含有单抗外,还含有清蛋白、小鼠自身Ig及其他血清蛋白、脂肪,故纯化腹水中的单抗十分必要。我们采用辛酸法[见:叶群瑞.一种简便、快速、量大的辛酸纯化单抗法.生物化学与生物物理进展,1991;18(1):60],通过硫酸铵沉淀,获得纯度较高的单抗,通过SDS-PAGE检测,由两个亚基组成,分子量分别为26 kD 和50 kD。

    2.3 单克隆抗体活性的鉴定 抗原APT经过SDS-PAGE后,进行转移电泳,用丽春红S染色硝酸纤维素膜,证实抗原已转移到膜上并呈现出单一蛋白带,与3种单抗反应后,膜上出现棕色的与抗原APT特异结合的单克隆抗体带,与正常凝血酶原及其他血浆蛋白无交叉反应。

    3 讨论

    APT作为一种新的肝癌标志物对肝癌的早期诊断及预后具有重要的意义,对甲胎蛋白(AFP)低浓度或阴性的肝癌患者有较好的诊断价值,二者的联合应用可进一步提高肝癌的检测率。单克隆抗体是抗单一抗原决定簇,可避免与其他抗原产生交叉反应,因此用单抗所建立的APT检测方法具有特异、灵敏、准确的优点,避免假阳性及假阴性,适于临床诊断。本文所建立的抗APT单抗方法,周期短,从细胞融合到小鼠产生腹水仅需52d,抗体效价高,阳性结果稳定,重复性高,为进一步建立灵敏的APT检测方法奠定了基础。

    作者简介:曹纯章,女,30岁,生物化学在职博士生;

    王维忠,男,教授,博士生导师,主要从事分子免疫学研究

    〔收稿1997-08-16 修回1998-03-20〕, http://www.100md.com