gp130分子在树突状细胞上表达及其意义①
作者：顾宗江 王月丹 邱玉华 周照华 谢炜 朱华亭 张学光
单位：顾宗江 王月丹 邱玉华 周照华 谢炜 朱华亭 张学光(苏州医学院免疫研究室，苏州 215007)
关键词：单核细胞；树突状细胞；gp130；表达
中国免疫学杂志/990102 摘 要 目的：探讨单核细胞向树突状细胞(DC)分化成熟时，gp130分子在细胞膜上的表达及其意义。方法：人外周血分离得到的单核细胞在含有DC分化成熟所需的各种因子的培养液中分别培养4 d和7 d，然后用流式细胞术测定DC上gp130分子的表达。结果：gp130分子在单核细胞上低表达，经培养分化成熟成为DC后，DC上的gp130分子表达被上调，特别是在TNFα和抗CD40刺激型单克隆抗体存在下。结论：gp130分子表达于DC前体细胞(单核细胞)并随其分化成熟而增加。
中国图书分类号 R392.11
, 百拇医药
Study of significant expression of gp130 molecule on dendritic cells
GU Zong-Jiang, WANG Yue-Dan, QIU Yu-Hua et al.
Immunology Research Unit, Suzhou Medical College, Suzhou 215007
Abstract Objective: To investigate expression of gp130 molecule on dendritic cells (DC) when monocytes differentiated and matured into DC. Methods: Monocytes isolated from human peripheral blood were cultured with different combination of cytokines required for DC differentiation and maturation for 4 days and 7 days respectively, the expression of gp130 molecule on DC was analyzed by cytometry. Results: gp130 molecule was low expression on monocytes, and up-regulated expression on DC after monocytes were grown and induced into mature DC, especially in the presence of TNFα and CD40 stimulating monoclonal antibody. Conclusion: gp130 molecule is present on monocytes and is increased on mature DC generated from monocytes.
, 百拇医药
Key words Monocyte Dendritic cell gp130 Expression
gp130分子是白介素-6(IL-6)的信号传导链，同时也是白介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素(OM)、睫状神经营养因子(CNTF)和心肌神经营养因子-1(CT-1)的共用信号传导链。它表达于机体的大部分组织细胞包括造血干细胞上，有着重要的生理功能[1]。从造血干细胞分化发育而来的树突状细胞(dendritic cell,DC)具有摄取、加工和递呈抗原，是目前已知机体内功能最强的抗原递呈细胞。它能在体内外激发初始型T细胞(naive T)，促进细胞毒性细胞(CTL)和辅助细胞的生成，是免疫应答强有力的启动者和参与者[2]。由于DC在机体内所占比例极少，往往需在体外对其前体细胞扩增培养来研究DC在分化成熟过程中，细胞膜上各种分子表达的情况。本研究报道DC前体细胞(单核细胞)在体外培养成为 DC 时，细胞膜上gp130分子的表达。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂 细胞因子rhGM-CSF购自美国的Amagen公司。rhTNFα和rhIL-4购自法国的Diaclone公司。抗CD1a、CD14、CD80和HLA-DR以及同亚型对照抗体由法国Immunotech公司提供。羊抗鼠IgG荧光抗体购自卫生部武汉生物制品研究所。抗CD40刺激型单抗由本室研制，可起着类似于配体(CD40L)的作用，激发CD40分子。抗gp130单克隆抗体B-T2由本室研制[3]。淋巴细胞分层液购自上海试剂二厂。RPMI1640为美国Gibco公司产品。
1.2 树突状细胞(DC)的体外培养 正常健康人外周血经肝素抗凝，用淋巴细胞分层液进行常规密度梯度离心取单个核细胞(PBMC)，洗涤后，以含10%FCS的RPMI1640调整细胞浓度至3.5×106 ml-1，加6孔板中(2 ml/孔)，5%CO2、37℃培养3 h，吸去非粘附细胞，获得贴壁单核细胞，然后将贴壁单核细胞分成4个组，分别加入培养液。第1组中加入DC的培养液I(GM-CSF 100 ng/ml,IL-4 50 ng/ml)；第2组中加入DC的培养液II(GM-CSF 100 ng/ml,IL-4 50 ng/ml和TNFα 20 ng/ml)；第3组中加入DC的培养液I和抗CD40单抗(100 ng/ml)；第4组中加入DC的培养液II和抗CD40单抗(100 ng/ml)。然后将这4组细胞置于37℃, 5%CO2的培养箱中进行培养。在培养4 d和7 d后，分别收取这4组细胞，进行DC的表型分析和gp130分子表达的分析。
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1.3 细胞表型分析 将细胞调整浓度为5×106ml-1，加入eppendorf离心管，每管100 μl。离心后吸去上清，加入50 μl单抗，单抗的标记浓度为20 μg/ml，置于4℃,30 min，用含1%FCS的PBS洗涤2遍，加入荧光标记二抗，4℃置于暗处30 min，洗涤2遍，用流式细胞仪(Coulter，核医学生物技术重点实验室)检测表型。
2 结果
2.1 gp130分子在单核细胞上的表达 从外周血获取的PBMC，贴壁培养3 h后，去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞。部分单核细胞经胰酶处理，悬浮后，立即用FCS中和胰酶活性，离心洗涤后，测定其细胞膜上的gp130分子(见图1A)，gp130分子在单核细胞上呈弱表达，仅为15.9%。
2.2 gp130分子在DC上的表达 以GM-CSF和IL-4培养单核细胞使其分化成为DC。培养7 d后，DC上的gp130分子表达增加(见图1B)。目前已知GM-CSF和IL-4是DC的主要增殖分化因子，TNFα是DC的成熟因子之一。近有文献报道，通过CD40配体(CD40L)激发DC前体细胞上的CD40分子也可促使其向DC分化、增殖和成熟[4]。本室制备的刺激型抗CD40单抗，可取代CD40L，起着激发CD40分子的作用。根据上述这些因子的作用特点，我们进一步将单核细胞置于上述因子的不同组合之下，分别经过4 d和7 d的培养，动态观察在诱导DC过程中，DC上CD1a、CD14、CD80和HLA-DR表达的情况，同时也观察gp130分子表达的变化，其结果见表1和表2。在GM-CSF和IL-4的作用下，随着培养时间的延长，DC上的gp130分子的表达在增加，在成熟因子TNFα作用下，gp130分子的表达可进一步增加。在刺激型抗CD40单抗的作用下，DC的数量有了明显的增加，约增加28.9%，而gp130分子的表达也显著增加，但抗CD40单抗和TNFα合用后，gp130分子的表达未见比单用时有明显的增加。
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图1 单核细胞和树突状细胞上gp130分子的表达
Fig.1 Expression of gp130 molecule on monocytes and dendritic cells
Note：A.Monocytes;B.Dendritic cells
表1 培养 4 d 的DC上gp130和DC相关分子的表达(%)
Tab.1 Expression of gp130 molecule and DC-associated molecule on DC after 4 days culture(%) Cytokines
CD1a
CD14
, 百拇医药
CD80
HLA-DR
gp130
GM-CSF/IL-4
92.1
28.3
79.4
88.9
31.6
GM-CSF/IL-4/TNFα
90.8
24.7
, 百拇医药 85.3
90.0
34.2
GM-CSF/IL-4/
90.3
25.6
84.6
91.5
39.7
CD40 McAb
GM-CSF/IL-4/
89.6
23.0
, http://www.100md.com
83.7
91.8
41.1
TNFα/CD40 McAb
Note: McAb:monoclonal antibody表2 培养 7 d 的DC上gp130和DC相关分子的表达(%)
Tab.2 Expression of gp130 molecule and DC-associated molecule on DC after 7 days culture(%) Cytokines
CD1a
CD14
CD80
, http://www.100md.com
HLA-DR
gp130
GM-CSF/IL-4
90.2
12.6
88.6
96.2
48.4
GM-CSF/IL-4/TNFα
88.0
10.1
94.8
, http://www.100md.com 97.5
65.6
GM-CSF/IL-4/
90.5
11.5
93.2
96.3
67.1
CD40 McAb
GM-CSF/IL-4/
87.3
8.5
93.8
, 百拇医药
98.6
68.6
TNFα/CD40 McAb
3 讨论
gp130分子是一个重要的分子。它已被发现在机体的大部分组织细胞上都有表达，提示它可能参与机体的许多重要功能[1]。在造血功能方面， gp130分子在胚胎发育的早期，就已在胚胎造血干细胞上有所表达[5]。在已敲除gp130基因的小鼠(gp130-/-)体内，胚肝中多能造血干细胞池受到严重破坏，定向造血干细胞的数量急剧减少，严重影响各个造血系列和淋巴系列的细胞生成[5]。在体外， gp130分子与干细胞因子(SCF) 和Flt3配体参与造血干细胞的扩增[6，7]。对于从造血干细胞分化发育而来的DC，对其在分化发育和功能成熟的过程中，已知有些因子如GM-CSF、IL-4、TNFα和CD40分子等在其中起着重要作用，而且在这过程中，DC上表达出一些DC有关的分子，这对成熟的DC发挥其生理功能是必不可少的，但是否还有其他因子对DC在分化成熟过程中也起着重要作用。Larregina曾系统研究了DC上所表达的多种细胞因子的受体，包括gp130分子[8]。本文的结果表明，在DC的前体细胞单核细胞上，gp130分子低表达，但在GM-CSF、IL-4、TNFα和CD40分子作用下，在分化成熟成为DC的过程中，gp130分子的表达逐步增强。尽管本文首次报道了gp130分子在DC上的动态表达，但在造血系统中起重要作用的gp130分子本身在DC细胞分化发育和成熟过程中起何种作用，目前在国际上仍属空白，值得进一步探索和研究。由于对DC研究的历史较短，其分化发育和功能成熟方面仍有不少未知问题。如果从新的角度，探索一些新的因子，包括gp130分子的作用，可能会有新的发现和认识。
, 百拇医药
①本课题受国家教委留学回国人员基金资助(97-436)和国家自然科学基金杰出人才基金资助(39625024)
作者简介：顾宗江，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫、免疫调节等研究
4 参考文献
[1] Kishmoto T, Akira S, Narazaki M et al. Interleukin-6 family of cytokines and gp130. Blood, 1995；86:1243
[2] Banchereau J, Steinman R M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998;392:245
[3] Gu Z J, Wildenes J, Zhang X G et al. Anti-gp130 transducer monoclonal antibodies specifically inhibiting ciliary neurotrophic factor, interleukin-6, interleukin-11, leukemia inhibitory factor or oncostatin M. J Immunol Methods, 1996； 190:21
, 百拇医药
[4] Brossart P, Grunebach F, Stuhler G et al. Generation of functional human cells from adherent peripheral blood monocytes by CD40 ligation in the absence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood, 1998; 92:4238
[5] Akira S, Yoshida K, Tanaka T et al. Targeted disruption of the IL-6 related genes: gp130 and NF-IL-6. Immunol Rev, 1995; 148:221
[6] Sui X, Tsuji K, Tajima S et al. gp130 and c-kit signallings synergize ex vivo expansion of human primitive hematopoietic progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995; 92:2859
, 百拇医药
[7] Ebihara Y, Tsuji K, Lyman S D et al. Synergistic action flt3 and gp130 signalings in human hematopoiesis. Blood, 1997; 90:4363
[8] Larregina A T, Morelli A E, Kolkowski E et al. Pattern of cytokine receptors expressed by human dendritic cells migrated from dermal explants. Immunology, 1997; 91:303
[收稿 1999-03-01], http://www.100md.com
单位：顾宗江 王月丹 邱玉华 周照华 谢炜 朱华亭 张学光(苏州医学院免疫研究室，苏州 215007)
关键词：单核细胞；树突状细胞；gp130；表达
中国免疫学杂志/990102 摘 要 目的：探讨单核细胞向树突状细胞(DC)分化成熟时，gp130分子在细胞膜上的表达及其意义。方法：人外周血分离得到的单核细胞在含有DC分化成熟所需的各种因子的培养液中分别培养4 d和7 d，然后用流式细胞术测定DC上gp130分子的表达。结果：gp130分子在单核细胞上低表达，经培养分化成熟成为DC后，DC上的gp130分子表达被上调，特别是在TNFα和抗CD40刺激型单克隆抗体存在下。结论：gp130分子表达于DC前体细胞(单核细胞)并随其分化成熟而增加。
中国图书分类号 R392.11
, 百拇医药
Study of significant expression of gp130 molecule on dendritic cells
GU Zong-Jiang, WANG Yue-Dan, QIU Yu-Hua et al.
Immunology Research Unit, Suzhou Medical College, Suzhou 215007
Abstract Objective: To investigate expression of gp130 molecule on dendritic cells (DC) when monocytes differentiated and matured into DC. Methods: Monocytes isolated from human peripheral blood were cultured with different combination of cytokines required for DC differentiation and maturation for 4 days and 7 days respectively, the expression of gp130 molecule on DC was analyzed by cytometry. Results: gp130 molecule was low expression on monocytes, and up-regulated expression on DC after monocytes were grown and induced into mature DC, especially in the presence of TNFα and CD40 stimulating monoclonal antibody. Conclusion: gp130 molecule is present on monocytes and is increased on mature DC generated from monocytes.
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Key words Monocyte Dendritic cell gp130 Expression
gp130分子是白介素-6(IL-6)的信号传导链，同时也是白介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素(OM)、睫状神经营养因子(CNTF)和心肌神经营养因子-1(CT-1)的共用信号传导链。它表达于机体的大部分组织细胞包括造血干细胞上，有着重要的生理功能[1]。从造血干细胞分化发育而来的树突状细胞(dendritic cell,DC)具有摄取、加工和递呈抗原，是目前已知机体内功能最强的抗原递呈细胞。它能在体内外激发初始型T细胞(naive T)，促进细胞毒性细胞(CTL)和辅助细胞的生成，是免疫应答强有力的启动者和参与者[2]。由于DC在机体内所占比例极少，往往需在体外对其前体细胞扩增培养来研究DC在分化成熟过程中，细胞膜上各种分子表达的情况。本研究报道DC前体细胞(单核细胞)在体外培养成为 DC 时，细胞膜上gp130分子的表达。
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1 材料与方法
1.1 试剂 细胞因子rhGM-CSF购自美国的Amagen公司。rhTNFα和rhIL-4购自法国的Diaclone公司。抗CD1a、CD14、CD80和HLA-DR以及同亚型对照抗体由法国Immunotech公司提供。羊抗鼠IgG荧光抗体购自卫生部武汉生物制品研究所。抗CD40刺激型单抗由本室研制，可起着类似于配体(CD40L)的作用，激发CD40分子。抗gp130单克隆抗体B-T2由本室研制[3]。淋巴细胞分层液购自上海试剂二厂。RPMI1640为美国Gibco公司产品。
1.2 树突状细胞(DC)的体外培养 正常健康人外周血经肝素抗凝，用淋巴细胞分层液进行常规密度梯度离心取单个核细胞(PBMC)，洗涤后，以含10%FCS的RPMI1640调整细胞浓度至3.5×106 ml-1，加6孔板中(2 ml/孔)，5%CO2、37℃培养3 h，吸去非粘附细胞，获得贴壁单核细胞，然后将贴壁单核细胞分成4个组，分别加入培养液。第1组中加入DC的培养液I(GM-CSF 100 ng/ml,IL-4 50 ng/ml)；第2组中加入DC的培养液II(GM-CSF 100 ng/ml,IL-4 50 ng/ml和TNFα 20 ng/ml)；第3组中加入DC的培养液I和抗CD40单抗(100 ng/ml)；第4组中加入DC的培养液II和抗CD40单抗(100 ng/ml)。然后将这4组细胞置于37℃, 5%CO2的培养箱中进行培养。在培养4 d和7 d后，分别收取这4组细胞，进行DC的表型分析和gp130分子表达的分析。
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1.3 细胞表型分析 将细胞调整浓度为5×106ml-1，加入eppendorf离心管，每管100 μl。离心后吸去上清，加入50 μl单抗，单抗的标记浓度为20 μg/ml，置于4℃,30 min，用含1%FCS的PBS洗涤2遍，加入荧光标记二抗，4℃置于暗处30 min，洗涤2遍，用流式细胞仪(Coulter，核医学生物技术重点实验室)检测表型。
2 结果
2.1 gp130分子在单核细胞上的表达 从外周血获取的PBMC，贴壁培养3 h后，去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞。部分单核细胞经胰酶处理，悬浮后，立即用FCS中和胰酶活性，离心洗涤后，测定其细胞膜上的gp130分子(见图1A)，gp130分子在单核细胞上呈弱表达，仅为15.9%。
2.2 gp130分子在DC上的表达 以GM-CSF和IL-4培养单核细胞使其分化成为DC。培养7 d后，DC上的gp130分子表达增加(见图1B)。目前已知GM-CSF和IL-4是DC的主要增殖分化因子，TNFα是DC的成熟因子之一。近有文献报道，通过CD40配体(CD40L)激发DC前体细胞上的CD40分子也可促使其向DC分化、增殖和成熟[4]。本室制备的刺激型抗CD40单抗，可取代CD40L，起着激发CD40分子的作用。根据上述这些因子的作用特点，我们进一步将单核细胞置于上述因子的不同组合之下，分别经过4 d和7 d的培养，动态观察在诱导DC过程中，DC上CD1a、CD14、CD80和HLA-DR表达的情况，同时也观察gp130分子表达的变化，其结果见表1和表2。在GM-CSF和IL-4的作用下，随着培养时间的延长，DC上的gp130分子的表达在增加，在成熟因子TNFα作用下，gp130分子的表达可进一步增加。在刺激型抗CD40单抗的作用下，DC的数量有了明显的增加，约增加28.9%，而gp130分子的表达也显著增加，但抗CD40单抗和TNFα合用后，gp130分子的表达未见比单用时有明显的增加。
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图1 单核细胞和树突状细胞上gp130分子的表达
Fig.1 Expression of gp130 molecule on monocytes and dendritic cells
Note：A.Monocytes;B.Dendritic cells
表1 培养 4 d 的DC上gp130和DC相关分子的表达(%)
Tab.1 Expression of gp130 molecule and DC-associated molecule on DC after 4 days culture(%) Cytokines
CD1a
CD14
, 百拇医药
CD80
HLA-DR
gp130
GM-CSF/IL-4
92.1
28.3
79.4
88.9
31.6
GM-CSF/IL-4/TNFα
90.8
24.7
, 百拇医药 85.3
90.0
34.2
GM-CSF/IL-4/
90.3
25.6
84.6
91.5
39.7
CD40 McAb
GM-CSF/IL-4/
89.6
23.0
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83.7
91.8
41.1
TNFα/CD40 McAb
Note: McAb:monoclonal antibody表2 培养 7 d 的DC上gp130和DC相关分子的表达(%)
Tab.2 Expression of gp130 molecule and DC-associated molecule on DC after 7 days culture(%) Cytokines
CD1a
CD14
CD80
, http://www.100md.com
HLA-DR
gp130
GM-CSF/IL-4
90.2
12.6
88.6
96.2
48.4
GM-CSF/IL-4/TNFα
88.0
10.1
94.8
, http://www.100md.com 97.5
65.6
GM-CSF/IL-4/
90.5
11.5
93.2
96.3
67.1
CD40 McAb
GM-CSF/IL-4/
87.3
8.5
93.8
, 百拇医药
98.6
68.6
TNFα/CD40 McAb
3 讨论
gp130分子是一个重要的分子。它已被发现在机体的大部分组织细胞上都有表达，提示它可能参与机体的许多重要功能[1]。在造血功能方面， gp130分子在胚胎发育的早期，就已在胚胎造血干细胞上有所表达[5]。在已敲除gp130基因的小鼠(gp130-/-)体内，胚肝中多能造血干细胞池受到严重破坏，定向造血干细胞的数量急剧减少，严重影响各个造血系列和淋巴系列的细胞生成[5]。在体外， gp130分子与干细胞因子(SCF) 和Flt3配体参与造血干细胞的扩增[6，7]。对于从造血干细胞分化发育而来的DC，对其在分化发育和功能成熟的过程中，已知有些因子如GM-CSF、IL-4、TNFα和CD40分子等在其中起着重要作用，而且在这过程中，DC上表达出一些DC有关的分子，这对成熟的DC发挥其生理功能是必不可少的，但是否还有其他因子对DC在分化成熟过程中也起着重要作用。Larregina曾系统研究了DC上所表达的多种细胞因子的受体，包括gp130分子[8]。本文的结果表明，在DC的前体细胞单核细胞上，gp130分子低表达，但在GM-CSF、IL-4、TNFα和CD40分子作用下，在分化成熟成为DC的过程中，gp130分子的表达逐步增强。尽管本文首次报道了gp130分子在DC上的动态表达，但在造血系统中起重要作用的gp130分子本身在DC细胞分化发育和成熟过程中起何种作用，目前在国际上仍属空白，值得进一步探索和研究。由于对DC研究的历史较短，其分化发育和功能成熟方面仍有不少未知问题。如果从新的角度，探索一些新的因子，包括gp130分子的作用，可能会有新的发现和认识。
, 百拇医药
①本课题受国家教委留学回国人员基金资助(97-436)和国家自然科学基金杰出人才基金资助(39625024)
作者简介：顾宗江，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫、免疫调节等研究
4 参考文献
[1] Kishmoto T, Akira S, Narazaki M et al. Interleukin-6 family of cytokines and gp130. Blood, 1995；86:1243
[2] Banchereau J, Steinman R M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998;392:245
[3] Gu Z J, Wildenes J, Zhang X G et al. Anti-gp130 transducer monoclonal antibodies specifically inhibiting ciliary neurotrophic factor, interleukin-6, interleukin-11, leukemia inhibitory factor or oncostatin M. J Immunol Methods, 1996； 190:21
, 百拇医药
[4] Brossart P, Grunebach F, Stuhler G et al. Generation of functional human cells from adherent peripheral blood monocytes by CD40 ligation in the absence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood, 1998; 92:4238
[5] Akira S, Yoshida K, Tanaka T et al. Targeted disruption of the IL-6 related genes: gp130 and NF-IL-6. Immunol Rev, 1995; 148:221
[6] Sui X, Tsuji K, Tajima S et al. gp130 and c-kit signallings synergize ex vivo expansion of human primitive hematopoietic progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995; 92:2859
, 百拇医药
[7] Ebihara Y, Tsuji K, Lyman S D et al. Synergistic action flt3 and gp130 signalings in human hematopoiesis. Blood, 1997; 90:4363
[8] Larregina A T, Morelli A E, Kolkowski E et al. Pattern of cytokine receptors expressed by human dendritic cells migrated from dermal explants. Immunology, 1997; 91:303
[收稿 1999-03-01], http://www.100md.com