应用液相放大酶免分析检测特异性IgE的方法学研究①
作者：陈东松 范淑娟 王 苏 潘洪涛 高红丽 李 岩 曲 颖 蔡颖华 阮承迈 杨振国
单位：陈东松 范淑娟 王 苏 潘洪涛 高红丽 李 岩 曲 颖 蔡颖华(中国人民解放军第208医院，长春130062)；阮承迈 杨振国 (中国人民解放军农牧大学，长春130062)
关键词：
中国免疫学杂志/990614 中国图书分类号 R446.61
应用体外免疫分析检测血清中特异性IgE(SIgE)是诊断过敏性疾病的关键技术。液相放大的酶免分析方法(L-BA-EIA)的优点是：能够克服固相酶免法中的低反应动力学问题以及由于增加固相包被量所致的“空间位阻”(Steric hindrance, SH)和“高剂量挂钩效应”(High dose hook effect, HDHE)[1-3]。本研究化学修饰了我国常见的几种变应原，建立了L-BA-EIA检测SIgE的方法。
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1 材料与方法
1.1 材料 葡聚糖(分子量 6 000～80 000)；羰酰二咪唑(CDI)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、EDC、NHS-Biotin、链亲和素、BSA均为Sigma产品；Sephacryl-300是Pharmacia产品。各种变应原：尘螨、豚草、屋尘、眣草、蒿粉均由北京协和医院提供。抗人IgE单克隆抗体酶结合物由中国医学科学院免疫室提供。特异性IgE的参考血清及标准，由DPC公司提供，标准血清浓度为0.0、1.5、3.0、15.0、30.0 U/ml。
1.2 方法
1.2.1 5种变应原的化学修饰 按以下方法制备：将124 nmol/L的葡聚糖溶解在2 ml含10 mg CDI的二甲基亚砜溶剂中，15～25℃反应30 min；并将溶解在2 ml二甲基亚砜中的770 nmol/L的聚谷氨酸加入上述反应体系。室温(15～25℃)振荡24 h。经Sephacryl-300层析过柱，收集葡聚糖-聚谷氨酸复合物，用水透析，进一步用pH 5.0， 0.1 mol/L ABS透析10 h，将10 mg变应原加入到透析过的葡聚糖-聚谷氨酸复合物中，并加入0.15 mol/L EDC在4℃振荡反应24 h。再用pH 8.1，0.1 mol/L的碳酸盐缓冲液4℃透析12 h。将葡聚糖-聚谷氨酸-变应原复合物与溶解在1 ml二甲基甲酰胺内的NHS-biotin 4℃反应过夜。再经层析分离、收集生物素-聚谷氨酸-葡聚糖-变应原复合物。
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1.2.2 用BSA-Biotin包被聚苯乙烯试管(12×75 mm，管底内表面呈星状) 参照文献[4，5]制备。
1.2.3 特异性IgE的检测方法 参照文献[2]进行。
1.2.4 RAST法检测特异IgE试剂盒 由美国GREER公司提供。
2 结果
2.1 L-BA-EIA最适工作条件的选择 生物素化牛血清白蛋白(Biotin-BSA)最适包被浓度为2 μg/ml；链亲和素最适工作浓度为5 μg/ml；抗人IgE单克隆抗体酶结合物最佳工作浓度为1∶ 3 000；经修饰后的5种变应原(尘螨、豚草、蒿粉、眣草、屋尘)蛋白浓度可调整至25 μg/ml。
2.2 精密度实验 取经标准皮内试验及应用DPC体外过敏检测系统确认了5种过敏物：分别是尘螨、屋尘、豚草、蒿粉、眣草。取患者血清(-20℃保存)重复测定20次，其检验的平均值(U/ml)分别为7.6、12.0、21.0、15.0、26.0；标准差分别为0.32、0.44、0.51、0.40、0.31；变异系数分别为4.2%、3.6%、2.4%、2.6%、1.1%。
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2.3 L-BA-EIA法与RAST法检测SIgE的相关分析 28例外源性哮喘病人，其中过敏物分别为：尘螨9例、屋尘10例、豚草3例、蒿粉6例血清。用DPC标准，分别用两种方法检测血清SIgE含量，结果表明两种方法具有高度的相关性(r=0.993，P<0.01)。
2.4 抑制实验 应用RAST法对尘螨、豚草、蒿粉、屋尘、眣草做抑制实验，方法是分别取25 μl不同稀释度的浸液(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、1.200、2.400 μg/ml)与25 μl相对应的阳性血清作用1 h，然后用RAST检测特异性IgE含量，结果显示随着变应原浓度的增加血清中特异性IgE被抑制。
2.5 L-BA-EIA检测SlgE平行实验 分别取尘螨、蒿粉、阳性血清做平行实验(原倍，1∶2～1∶8)，尘螨实测值(U/ml)分别为22.0、12.0、5.7、2.9；期望值(U/ml)为11.0、5.5、2.8；实测值/期望值(%)为109、104、104，蒿粉实测值(U/ml)为29.5、15.1、7.6、3.9，期望值(U/ml)为14.8，7.4，3.6；实测值/期望值(%)为102、103、108。
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3 讨论
变应原的化学修饰是L-BA-EIA检测变应原SIgE的核心技术，其基本过程是：将生物素以多价的结合形式连接在可溶性大分子骨架上(如：Ficoll,dextran)，它可称为液相支持物。而变应原则依次以NH2-、OH-、COOH-、SH- 键与大分子骨架相联，由此确保了SIgE在变应原上的结合位点。实验表明经修饰后的变应原首先与血样中SIgE在液相中的反应，在短时间内即可达到平衡，由此提高了反应的动力学。在免疫分离过程中，固相载体(聚苯乙烯)则包被有BSA-Biotin；并以链亲和素作为桥臂，通过配体与抗配体的高度亲和力完成了分离过程，增加了实验的灵敏度。提高了固相免疫复合物的量，此法全过程只需3.5 h。并且L-BA-EIA的免疫分离模式有利于实现免疫分析的自动化。实验结果表明：该方法灵敏度为0.2 U/ml，其余各项指标均能够满足临床需要。本方法改进了变应原的修饰线路[2]，其优点是中间产物少、产率高。应用本文方法可标记国人常见的过敏物，有利于国产化，另外本文应用链亲和素替代亲和素作为桥臂，进一步降低了背景信号，效果满意。
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①本课题受全军九五医药卫生科研基金资助(96D006)
作者简介：陈东松，男，39岁，主管技师，从事变态反应学免疫分析研究
4 参考文献
1 陈东松，阮承迈，刘卫林 et al.液相放大酶免分析检测血清总IgE的方法学建立.中华医学检验杂志，1999;22(3):160
2 El Shami As, Alaba O. Liquid phase in vitro allergen specific IgE assay with in situ immobilization. Adv Biosciences, 1989;74：191
3 Nolte H, Dubuske L M. Performance characteristics of a new automated enzyme immunoassay for the measurement of allergen-specific IgE. Summary of the probability outcomes of allergen testing to results obtained with the HYTEC system and CAP system. Ann Allergy Asthma Immunol,1997;79:27,65,191,337
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4 Haun M, Wasi S. Biotinylated antibodies bound to streptavidin beads: a versatile solid matrix for immunoassays. Anal Biochem,1990;191:337
5 Olivieri V, Beccarini I, Galluccu G et al. Capture assay for specific IgE. An improved quantitative method. J Immunol Methods,1993;157：65
〔收稿1998-08-07 修回1998-11-23〕, 百拇医药
单位：陈东松 范淑娟 王 苏 潘洪涛 高红丽 李 岩 曲 颖 蔡颖华(中国人民解放军第208医院，长春130062)；阮承迈 杨振国 (中国人民解放军农牧大学，长春130062)
关键词：
中国免疫学杂志/990614 中国图书分类号 R446.61
应用体外免疫分析检测血清中特异性IgE(SIgE)是诊断过敏性疾病的关键技术。液相放大的酶免分析方法(L-BA-EIA)的优点是：能够克服固相酶免法中的低反应动力学问题以及由于增加固相包被量所致的“空间位阻”(Steric hindrance, SH)和“高剂量挂钩效应”(High dose hook effect, HDHE)[1-3]。本研究化学修饰了我国常见的几种变应原，建立了L-BA-EIA检测SIgE的方法。
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1 材料与方法
1.1 材料 葡聚糖(分子量 6 000～80 000)；羰酰二咪唑(CDI)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、EDC、NHS-Biotin、链亲和素、BSA均为Sigma产品；Sephacryl-300是Pharmacia产品。各种变应原：尘螨、豚草、屋尘、眣草、蒿粉均由北京协和医院提供。抗人IgE单克隆抗体酶结合物由中国医学科学院免疫室提供。特异性IgE的参考血清及标准，由DPC公司提供，标准血清浓度为0.0、1.5、3.0、15.0、30.0 U/ml。
1.2 方法
1.2.1 5种变应原的化学修饰 按以下方法制备：将124 nmol/L的葡聚糖溶解在2 ml含10 mg CDI的二甲基亚砜溶剂中，15～25℃反应30 min；并将溶解在2 ml二甲基亚砜中的770 nmol/L的聚谷氨酸加入上述反应体系。室温(15～25℃)振荡24 h。经Sephacryl-300层析过柱，收集葡聚糖-聚谷氨酸复合物，用水透析，进一步用pH 5.0， 0.1 mol/L ABS透析10 h，将10 mg变应原加入到透析过的葡聚糖-聚谷氨酸复合物中，并加入0.15 mol/L EDC在4℃振荡反应24 h。再用pH 8.1，0.1 mol/L的碳酸盐缓冲液4℃透析12 h。将葡聚糖-聚谷氨酸-变应原复合物与溶解在1 ml二甲基甲酰胺内的NHS-biotin 4℃反应过夜。再经层析分离、收集生物素-聚谷氨酸-葡聚糖-变应原复合物。
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1.2.2 用BSA-Biotin包被聚苯乙烯试管(12×75 mm，管底内表面呈星状) 参照文献[4，5]制备。
1.2.3 特异性IgE的检测方法 参照文献[2]进行。
1.2.4 RAST法检测特异IgE试剂盒 由美国GREER公司提供。
2 结果
2.1 L-BA-EIA最适工作条件的选择 生物素化牛血清白蛋白(Biotin-BSA)最适包被浓度为2 μg/ml；链亲和素最适工作浓度为5 μg/ml；抗人IgE单克隆抗体酶结合物最佳工作浓度为1∶ 3 000；经修饰后的5种变应原(尘螨、豚草、蒿粉、眣草、屋尘)蛋白浓度可调整至25 μg/ml。
2.2 精密度实验 取经标准皮内试验及应用DPC体外过敏检测系统确认了5种过敏物：分别是尘螨、屋尘、豚草、蒿粉、眣草。取患者血清(-20℃保存)重复测定20次，其检验的平均值(U/ml)分别为7.6、12.0、21.0、15.0、26.0；标准差分别为0.32、0.44、0.51、0.40、0.31；变异系数分别为4.2%、3.6%、2.4%、2.6%、1.1%。
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2.3 L-BA-EIA法与RAST法检测SIgE的相关分析 28例外源性哮喘病人，其中过敏物分别为：尘螨9例、屋尘10例、豚草3例、蒿粉6例血清。用DPC标准，分别用两种方法检测血清SIgE含量，结果表明两种方法具有高度的相关性(r=0.993，P<0.01)。
2.4 抑制实验 应用RAST法对尘螨、豚草、蒿粉、屋尘、眣草做抑制实验，方法是分别取25 μl不同稀释度的浸液(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、1.200、2.400 μg/ml)与25 μl相对应的阳性血清作用1 h，然后用RAST检测特异性IgE含量，结果显示随着变应原浓度的增加血清中特异性IgE被抑制。
2.5 L-BA-EIA检测SlgE平行实验 分别取尘螨、蒿粉、阳性血清做平行实验(原倍，1∶2～1∶8)，尘螨实测值(U/ml)分别为22.0、12.0、5.7、2.9；期望值(U/ml)为11.0、5.5、2.8；实测值/期望值(%)为109、104、104，蒿粉实测值(U/ml)为29.5、15.1、7.6、3.9，期望值(U/ml)为14.8，7.4，3.6；实测值/期望值(%)为102、103、108。
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3 讨论
变应原的化学修饰是L-BA-EIA检测变应原SIgE的核心技术，其基本过程是：将生物素以多价的结合形式连接在可溶性大分子骨架上(如：Ficoll,dextran)，它可称为液相支持物。而变应原则依次以NH2-、OH-、COOH-、SH- 键与大分子骨架相联，由此确保了SIgE在变应原上的结合位点。实验表明经修饰后的变应原首先与血样中SIgE在液相中的反应，在短时间内即可达到平衡，由此提高了反应的动力学。在免疫分离过程中，固相载体(聚苯乙烯)则包被有BSA-Biotin；并以链亲和素作为桥臂，通过配体与抗配体的高度亲和力完成了分离过程，增加了实验的灵敏度。提高了固相免疫复合物的量，此法全过程只需3.5 h。并且L-BA-EIA的免疫分离模式有利于实现免疫分析的自动化。实验结果表明：该方法灵敏度为0.2 U/ml，其余各项指标均能够满足临床需要。本方法改进了变应原的修饰线路[2]，其优点是中间产物少、产率高。应用本文方法可标记国人常见的过敏物，有利于国产化，另外本文应用链亲和素替代亲和素作为桥臂，进一步降低了背景信号，效果满意。
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①本课题受全军九五医药卫生科研基金资助(96D006)
作者简介：陈东松，男，39岁，主管技师，从事变态反应学免疫分析研究
4 参考文献
1 陈东松，阮承迈，刘卫林 et al.液相放大酶免分析检测血清总IgE的方法学建立.中华医学检验杂志，1999;22(3):160
2 El Shami As, Alaba O. Liquid phase in vitro allergen specific IgE assay with in situ immobilization. Adv Biosciences, 1989;74：191
3 Nolte H, Dubuske L M. Performance characteristics of a new automated enzyme immunoassay for the measurement of allergen-specific IgE. Summary of the probability outcomes of allergen testing to results obtained with the HYTEC system and CAP system. Ann Allergy Asthma Immunol,1997;79:27,65,191,337
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4 Haun M, Wasi S. Biotinylated antibodies bound to streptavidin beads: a versatile solid matrix for immunoassays. Anal Biochem,1990;191:337
5 Olivieri V, Beccarini I, Galluccu G et al. Capture assay for specific IgE. An improved quantitative method. J Immunol Methods,1993;157：65
〔收稿1998-08-07 修回1998-11-23〕, 百拇医药