血小板提取液NPY与NT在血液透析中的表达及意义
作者：罗南萍 杨道理 孟建中① 武翠华 齐法莲 孔立新② 刘文渊①
单位：济南军区总医院免疫科，济南250031
关键词：神经肽Y；神经降压素；血小板；血浆；血液透析
中国免疫学杂志/990616 摘 要 目的：探讨血液透析(HD)过程血小板中神经肽Y(NPY)与神经降压素(NT)的含量变化及意义。方法：HD患者35例，对照组30例。采用放射免疫分析法测定血小板提取液和血浆中NPY及NT的含量。结果：与对照组比较，HD患者血小板提取液NPY含量明显降低，血浆中NPY含量明显增高，血小板提取液与血浆NT含量均显著升高。与HD前比较，HD后血浆NT与血小板NPY均明显增高，血小板中NT与血浆NPY明显降低，两者具有显著相关性。结论：在HD过程中，血小板释放的NPY可能是造成肾性高血压和肾血管痉挛的重要病理因素。
中国图书分类号 R446.6
, 百拇医药
Expression of the platelet extract's neuropeptide and
neurotensin in hemodialysis
LUO Nan-Ping, YANG Dao-Li, MENG Jian-Zhong et al.
Department of Immunology, General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031
Abstract Objective: To study the changes of neuropeptide Y(NPY) and neurotensin (NT) in platelet extract and plasma in hemodialysis (HD).Methods:There were 35 HD patients and 30 controls.NPY and NT in platelet extract and in plasma were measured by radio-immunity analysis. Results:When compared with control group, NPY was significantly higher in platelet extact and lower in the plasma, while NT was higher both in platelet extract and in plasma in HD patients. When compared with those before HD,NT in plasma and NPY in platelet extract signficantly increased,while NT in platelet extract and NPY in plasma significantly decreased after HD. NPY related to NT significantly. Conclusion:NPY,secreted by platelets, may play an important role in the pathogenesis of renal hypertension and renal vasospasm in HD.
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Key words Neuropeptide Y Neurotensin Platelet Plasma Hemodialysis
1987年Ericsson首先发现大鼠等巨核细胞具有合成NPY的能力，并储存于血小板，在血小板聚集时释放[1]。至今对血小板储存、释放NPY和NT的功能以及在人体机能紊乱时的病理生理作用了解甚少。本工作从慢性肾功能衰竭(CRF)时血液透析(HD)患者血浆中分离出血小板，采用放射免疫分析法观察分析了血小板提取液和不含血小板的血浆中NPY与NT的含量变化，探讨血小板释放的生物活性多肽调节血管收缩、舒张活性以及相互拮抗作用对CRF患者的影响。
1 材料与方法
1.1 临床资料 维持性HD患者35例，其中男19例，女16例，平均年龄46.5±5.5岁，均来自本院血液净化中心。原发病分别为慢性肾衰21例、肾小球动脉硬化4例、糖尿病肾病5例、肾盂肾炎3例、多囊肾2例。血透时间为6～74个月(平均39个月)。全部患者内生肌酐清除率Ccr<10 ml/min，均采用醋酸盐透析液，中空纤维透析器透析膜截留分子量(即允许通过溶质的最大分子量)为12 000。每周透析3次，每次4.0～5.0 h。选择30例健康献血员作为对照组。男17例，女13例，平均年龄为32.5±12.0岁。
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1.2 方法
1.2.1 血小板提取液的制备 分别于HD前、后即刻抽取患者静脉血(对照组抽取空腹静脉血)3 ml，立即注入含有40 mmol/L的EDTA2Na 80 μl的试管中，轻轻摇匀，于4℃500 r/min离心30 min后，吸取所有血浆于另一硅化塑料试管中，4℃ 2 000 r/min离心30 min，将上清倾入另一试管中，作为不含血小板的血浆标本，沉淀即为血小板。以生理盐水洗涤沉淀一次，离心倾去上清，于沉淀中加入1 ml生理盐水，充分混匀后，在F800血球计数仪上行血小板计数。调整血小板数为1×109 L-1。将血浆与血小板混悬液置于-30℃以下待测。
1.2.2 样本NPY与NT测定 将血小板混悬液于-30℃～37℃反复冻融3～4次，镜下观察血小板形态大部分裂解、破碎，再以抽干机浓缩抽干后，取1 ml生理盐水复溶，待充分溶解后进行NPY与NT放射免疫测定。人工合成的NPY、NT与相应抗体均为Sigma公司产品(美国进口)。NPY碘标记物为美国Amersham公司产品，125I-NPY稀释后为14 000 cpm/min。125I-NT稀释后为18 000 cpm/min。本抗血清与7种常见多肽类化合物交叉反应小于1%。采用放射免疫非平衡法进行标准曲线及样品和复管检测。此方法两步温育，延长抗原、抗体温育时间，提高方法灵敏度。以上NPY与NT试剂均由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。测量仪器由中国核工业部北京核仪器厂提供的FT-630G微机多探头γ-计数仪。样本浓度按下式计算：
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1.2.3 统计学处理 所有数据以(
±s) 表示，均数之间比较采用t检验，以P<0.05为显著性大小的标志。
2 结果
2.1 血小板提取液中NPY与NT水平 与30例正常人比较，HD前NPY水平明显降低，而NT明显增高，均有显著性差异(P<0.01)。与HD前比较，HD后NPY明显增高，NT则明显降低，并具显著性差异(P<0.05)，见表1。
表1 血小板提取液及血浆中NPY与NT在HD过程中的表达(±s)
Tab.1 Expressions of NPY and NT in the platelet extract and plasma during HD (±s) Groups
, http://www.100md.com
n
Platelet (ng/109)
Plasma (ng/L)
NPY
P
NT
P
NPY
P
NT
P
Normal
30
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58.18±21.29
25.38±13.63
144.06±33.83
70.66±24.72
Pre-HD
35
33.97±19.80
<0.01
40.47±23.99
<0.05
423.26±54.97
<0.01
, 百拇医药
133.83±92.23
<0.01
Post-HD
35
65.57±28.571)
>0.05
15.76±13.22
<0.05
315.49±50.192)
<0.01
205.06±134.09
, 百拇医药
<0.05
Note:1)compare with pre-HD, P<0.01；2)compare with pre-HD, P<0.01
2.2 血浆中NPY与NT水平 与对照组比较，HD前血浆NPY升高极为显著(t=23.36，P<0.01)。NT水平亦明显升高(P<0.01)。HD后血浆NPY明显降低，与HD前比较差异十分显著(P<0.05)，NT则在HD后明显增高(P<0.05)，见表1。
2.3 样本相关分析 见表2。
表2 血小板提取液和血浆中NPY与NT相关性
Tab.2 The correlation between NPY and NT in the platelet extract and plasma
, 百拇医药
Platelet-Plasma
Platelet
Plasma
NPY-NPY
NT-NT
NPY-NT
NPY-NT
r
t
P
r
t
P
, 百拇医药
r
t
p
r
t
p
Pre-HD
-0.67
4.08
<0.01
-0.40
2.84
<0.05
, 百拇医药
-0.38
2.87
<0.05
0.68
2.98
<0.01
Post-HD
-0.41
2.73
<0.05
-0.18
0.88
>0.05
, 百拇医药
0.59
2.95
<0.01
0.39
2.64
<0.05
3 讨论
NPY与NT是一组具有拮抗作用的生物活性多肽，它们广泛分布于机体组织内，对机体多种生理活动起重要的调节作用。自1982年发现以来，一直被认为仅存于神经系统中[2]。1987年Ericsson提出血小板中也含有NPY。1991年又进一步证实大鼠血小板中存在与NPY合成相关联的mRNA，表明血小板是合成NPY的主要细胞[3]。本组实验结果发现，在CRF患者血浆分离出血小板提取液中，能测出一定浓度的与NPY、NT特异性抗体相结合的相应抗原，其中NPY水平明显低于对照组，而NT含量则较正常人明显增高。同时检测血浆中NPY与NT的含量均处于高水平状态。这一发现证实了在血小板上可能存在NPY与NT受体，而CRF患者血小板中NPY与NT的代谢紊乱表明血小板不仅参与了凝血机制，可能还参与了肾脏疾病的发病过程。其致病机理可能是由于CRF患者体内毒素聚集作用、凝血机制障碍等原因诱导、活化并释放大量NPY及NT入血浆，致使血浆中NPY与NT浓度增高，这一结果与报道相一致[4]。
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结果显示，CRF患者HD后血小板提取液中NPY水平较HD前明显增高，而血浆中NPY水平降低，可能是由于①血液透析作为一种中等强度刺激使病人应激，交感神经处于兴奋状态而使血小板合成释放增加。②HD过程机械性损伤，血小板随血循环与透析膜接触从而被激活的过程。③通过透析患者体内毒素作用减轻，血小板释放入血减少，而血小板中含量大大增加。同时表明透析除能滤出Cr、Bun等有毒物质外，还能清除NPY等中分子多肽类物质，以减少对血管的收缩作用，缓解HD患者以缩血管为主的病理过程。
从相关分析中看出，血小板和血浆中NPY与NT之间关系十分密切，充分证实血浆中大量增加的NPY与NT均来自血小板的释放。有关实验证明，NT的降血压作用是促进肥大细胞释放组织胺等生物活性物质引起[5]。而血小板释放NPY、NT可作为血小板与血管间的一种传递者，直接或与其它缩血管物质(如5-羟色胺等)协同作用，发挥缩血管效应[6]。NPY与NT是一组生物学活性相拮抗的多肽。在HD发病过程中起重要作用。在HD过程增强NT舒血管作用，以拮抗由病理及物理因素造成血小板聚集时NPY大量释放，与5-羟色胺等对血管的强烈收缩作用，是防止HD过程中的严重并发症，进一步提高透析质量，延长患者生命的重要环节。
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致谢：感谢解放军总医院李振甲教授给予本研究的指导与帮助。
①济南军区血液净化中心，济南250031
②济南军区总医院检验科，济南250031
作者简介：罗南萍，女，47岁，副主任技师，主要从事神经肽及细胞因子方面的研究
4 参考文献
1 Ericsson A, Schalling M, Mcintyre K R et al. Detection of neuropeptide Y and its mRNA in megakaryocytes: Enhanced levels in artain autoimmune mice. Propc Natl Acad Sci USA,1987;84:5585
, http://www.100md.com
2 Ailen J M, Bloom S R. Neuropeptide Y: a putative neurotramsmitter. Neurochem,1986;8:8
3 Ericsson A, Hemsen A, Lundberg J M et al. Detection of neuropeptide Y -Like immunoreactivity and messenger RNA in rat platelets: The effects of vinblastine reserpine, and dexamethasone on NPY expession in bloold cells. Exp Cell Res,1991;192:604
4 Myets A K, Farhat M Y, Vaz C A et al. Releasa of immunoreactive-neuropeptide by rat platelets. Bionchem Biophys Res Commun,1988;155:158
5 蔡 强.神经降压素.国外医学*消化系统疾病分册，1986；6(3)：129
6 杨耀芳，杨丽华，施广璞.大鼠血小板中的神经肽Y及其对血管收缩的影响.生理学报，1993；45(4)：400
〔收稿1998-02-18 修回1998-11-29〕, 百拇医药
单位：济南军区总医院免疫科，济南250031
关键词：神经肽Y；神经降压素；血小板；血浆；血液透析
中国免疫学杂志/990616 摘 要 目的：探讨血液透析(HD)过程血小板中神经肽Y(NPY)与神经降压素(NT)的含量变化及意义。方法：HD患者35例，对照组30例。采用放射免疫分析法测定血小板提取液和血浆中NPY及NT的含量。结果：与对照组比较，HD患者血小板提取液NPY含量明显降低，血浆中NPY含量明显增高，血小板提取液与血浆NT含量均显著升高。与HD前比较，HD后血浆NT与血小板NPY均明显增高，血小板中NT与血浆NPY明显降低，两者具有显著相关性。结论：在HD过程中，血小板释放的NPY可能是造成肾性高血压和肾血管痉挛的重要病理因素。
中国图书分类号 R446.6
, 百拇医药
Expression of the platelet extract's neuropeptide and
neurotensin in hemodialysis
LUO Nan-Ping, YANG Dao-Li, MENG Jian-Zhong et al.
Department of Immunology, General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031
Abstract Objective: To study the changes of neuropeptide Y(NPY) and neurotensin (NT) in platelet extract and plasma in hemodialysis (HD).Methods:There were 35 HD patients and 30 controls.NPY and NT in platelet extract and in plasma were measured by radio-immunity analysis. Results:When compared with control group, NPY was significantly higher in platelet extact and lower in the plasma, while NT was higher both in platelet extract and in plasma in HD patients. When compared with those before HD,NT in plasma and NPY in platelet extract signficantly increased,while NT in platelet extract and NPY in plasma significantly decreased after HD. NPY related to NT significantly. Conclusion:NPY,secreted by platelets, may play an important role in the pathogenesis of renal hypertension and renal vasospasm in HD.
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Key words Neuropeptide Y Neurotensin Platelet Plasma Hemodialysis
1987年Ericsson首先发现大鼠等巨核细胞具有合成NPY的能力，并储存于血小板，在血小板聚集时释放[1]。至今对血小板储存、释放NPY和NT的功能以及在人体机能紊乱时的病理生理作用了解甚少。本工作从慢性肾功能衰竭(CRF)时血液透析(HD)患者血浆中分离出血小板，采用放射免疫分析法观察分析了血小板提取液和不含血小板的血浆中NPY与NT的含量变化，探讨血小板释放的生物活性多肽调节血管收缩、舒张活性以及相互拮抗作用对CRF患者的影响。
1 材料与方法
1.1 临床资料 维持性HD患者35例，其中男19例，女16例，平均年龄46.5±5.5岁，均来自本院血液净化中心。原发病分别为慢性肾衰21例、肾小球动脉硬化4例、糖尿病肾病5例、肾盂肾炎3例、多囊肾2例。血透时间为6～74个月(平均39个月)。全部患者内生肌酐清除率Ccr<10 ml/min，均采用醋酸盐透析液，中空纤维透析器透析膜截留分子量(即允许通过溶质的最大分子量)为12 000。每周透析3次，每次4.0～5.0 h。选择30例健康献血员作为对照组。男17例，女13例，平均年龄为32.5±12.0岁。
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1.2 方法
1.2.1 血小板提取液的制备 分别于HD前、后即刻抽取患者静脉血(对照组抽取空腹静脉血)3 ml，立即注入含有40 mmol/L的EDTA2Na 80 μl的试管中，轻轻摇匀，于4℃500 r/min离心30 min后，吸取所有血浆于另一硅化塑料试管中，4℃ 2 000 r/min离心30 min，将上清倾入另一试管中，作为不含血小板的血浆标本，沉淀即为血小板。以生理盐水洗涤沉淀一次，离心倾去上清，于沉淀中加入1 ml生理盐水，充分混匀后，在F800血球计数仪上行血小板计数。调整血小板数为1×109 L-1。将血浆与血小板混悬液置于-30℃以下待测。
1.2.2 样本NPY与NT测定 将血小板混悬液于-30℃～37℃反复冻融3～4次，镜下观察血小板形态大部分裂解、破碎，再以抽干机浓缩抽干后，取1 ml生理盐水复溶，待充分溶解后进行NPY与NT放射免疫测定。人工合成的NPY、NT与相应抗体均为Sigma公司产品(美国进口)。NPY碘标记物为美国Amersham公司产品，125I-NPY稀释后为14 000 cpm/min。125I-NT稀释后为18 000 cpm/min。本抗血清与7种常见多肽类化合物交叉反应小于1%。采用放射免疫非平衡法进行标准曲线及样品和复管检测。此方法两步温育，延长抗原、抗体温育时间，提高方法灵敏度。以上NPY与NT试剂均由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。测量仪器由中国核工业部北京核仪器厂提供的FT-630G微机多探头γ-计数仪。样本浓度按下式计算：
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1.2.3 统计学处理 所有数据以(
±s) 表示，均数之间比较采用t检验，以P<0.05为显著性大小的标志。2 结果
2.1 血小板提取液中NPY与NT水平 与30例正常人比较，HD前NPY水平明显降低，而NT明显增高，均有显著性差异(P<0.01)。与HD前比较，HD后NPY明显增高，NT则明显降低，并具显著性差异(P<0.05)，见表1。
表1 血小板提取液及血浆中NPY与NT在HD过程中的表达(
±s)Tab.1 Expressions of NPY and NT in the platelet extract and plasma during HD (
±s) Groups, http://www.100md.com
n
Platelet (ng/109)
Plasma (ng/L)
NPY
P
NT
P
NPY
P
NT
P
Normal
30
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58.18±21.29
25.38±13.63
144.06±33.83
70.66±24.72
Pre-HD
35
33.97±19.80
<0.01
40.47±23.99
<0.05
423.26±54.97
<0.01
, 百拇医药
133.83±92.23
<0.01
Post-HD
35
65.57±28.571)
>0.05
15.76±13.22
<0.05
315.49±50.192)
<0.01
205.06±134.09
, 百拇医药
<0.05
Note:1)compare with pre-HD, P<0.01；2)compare with pre-HD, P<0.01
2.2 血浆中NPY与NT水平 与对照组比较，HD前血浆NPY升高极为显著(t=23.36，P<0.01)。NT水平亦明显升高(P<0.01)。HD后血浆NPY明显降低，与HD前比较差异十分显著(P<0.05)，NT则在HD后明显增高(P<0.05)，见表1。
2.3 样本相关分析 见表2。
表2 血小板提取液和血浆中NPY与NT相关性
Tab.2 The correlation between NPY and NT in the platelet extract and plasma
, 百拇医药
Platelet-Plasma
Platelet
Plasma
NPY-NPY
NT-NT
NPY-NT
NPY-NT
r
t
P
r
t
P
, 百拇医药
r
t
p
r
t
p
Pre-HD
-0.67
4.08
<0.01
-0.40
2.84
<0.05
, 百拇医药
-0.38
2.87
<0.05
0.68
2.98
<0.01
Post-HD
-0.41
2.73
<0.05
-0.18
0.88
>0.05
, 百拇医药
0.59
2.95
<0.01
0.39
2.64
<0.05
3 讨论
NPY与NT是一组具有拮抗作用的生物活性多肽，它们广泛分布于机体组织内，对机体多种生理活动起重要的调节作用。自1982年发现以来，一直被认为仅存于神经系统中[2]。1987年Ericsson提出血小板中也含有NPY。1991年又进一步证实大鼠血小板中存在与NPY合成相关联的mRNA，表明血小板是合成NPY的主要细胞[3]。本组实验结果发现，在CRF患者血浆分离出血小板提取液中，能测出一定浓度的与NPY、NT特异性抗体相结合的相应抗原，其中NPY水平明显低于对照组，而NT含量则较正常人明显增高。同时检测血浆中NPY与NT的含量均处于高水平状态。这一发现证实了在血小板上可能存在NPY与NT受体，而CRF患者血小板中NPY与NT的代谢紊乱表明血小板不仅参与了凝血机制，可能还参与了肾脏疾病的发病过程。其致病机理可能是由于CRF患者体内毒素聚集作用、凝血机制障碍等原因诱导、活化并释放大量NPY及NT入血浆，致使血浆中NPY与NT浓度增高，这一结果与报道相一致[4]。
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结果显示，CRF患者HD后血小板提取液中NPY水平较HD前明显增高，而血浆中NPY水平降低，可能是由于①血液透析作为一种中等强度刺激使病人应激，交感神经处于兴奋状态而使血小板合成释放增加。②HD过程机械性损伤，血小板随血循环与透析膜接触从而被激活的过程。③通过透析患者体内毒素作用减轻，血小板释放入血减少，而血小板中含量大大增加。同时表明透析除能滤出Cr、Bun等有毒物质外，还能清除NPY等中分子多肽类物质，以减少对血管的收缩作用，缓解HD患者以缩血管为主的病理过程。
从相关分析中看出，血小板和血浆中NPY与NT之间关系十分密切，充分证实血浆中大量增加的NPY与NT均来自血小板的释放。有关实验证明，NT的降血压作用是促进肥大细胞释放组织胺等生物活性物质引起[5]。而血小板释放NPY、NT可作为血小板与血管间的一种传递者，直接或与其它缩血管物质(如5-羟色胺等)协同作用，发挥缩血管效应[6]。NPY与NT是一组生物学活性相拮抗的多肽。在HD发病过程中起重要作用。在HD过程增强NT舒血管作用，以拮抗由病理及物理因素造成血小板聚集时NPY大量释放，与5-羟色胺等对血管的强烈收缩作用，是防止HD过程中的严重并发症，进一步提高透析质量，延长患者生命的重要环节。
, http://www.100md.com
致谢：感谢解放军总医院李振甲教授给予本研究的指导与帮助。
①济南军区血液净化中心，济南250031
②济南军区总医院检验科，济南250031
作者简介：罗南萍，女，47岁，副主任技师，主要从事神经肽及细胞因子方面的研究
4 参考文献
1 Ericsson A, Schalling M, Mcintyre K R et al. Detection of neuropeptide Y and its mRNA in megakaryocytes: Enhanced levels in artain autoimmune mice. Propc Natl Acad Sci USA,1987;84:5585
, http://www.100md.com
2 Ailen J M, Bloom S R. Neuropeptide Y: a putative neurotramsmitter. Neurochem,1986;8:8
3 Ericsson A, Hemsen A, Lundberg J M et al. Detection of neuropeptide Y -Like immunoreactivity and messenger RNA in rat platelets: The effects of vinblastine reserpine, and dexamethasone on NPY expession in bloold cells. Exp Cell Res,1991;192:604
4 Myets A K, Farhat M Y, Vaz C A et al. Releasa of immunoreactive-neuropeptide by rat platelets. Bionchem Biophys Res Commun,1988;155:158
5 蔡 强.神经降压素.国外医学*消化系统疾病分册，1986；6(3)：129
6 杨耀芳，杨丽华，施广璞.大鼠血小板中的神经肽Y及其对血管收缩的影响.生理学报，1993；45(4)：400
〔收稿1998-02-18 修回1998-11-29〕, 百拇医药