人Ⅱ型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达
作者：田 梅① 金宁一 王秀清② 郭志儒 李体远 李宗株 方厚华 范洪学① 殷 震
单位：解放军农牧大学军事兽医研究所，长春130062)
关键词：人Ⅱ型免疫缺陷病毒；gag基因；大肠杆菌；表达
中国免疫学杂志/990606 摘 要 目的：表达HIV-2型基因工程gag抗原。方法：将编码HIV-2型gag的部分和全部p55gag1/2基因，克隆到载体pET-17b后，分别在E.Coli BL21(DE3)中表达。结果：表达产物为51和61 kD融合蛋白，并可与HIV-2病人血清发生特异性反应。表达量分别为菌体总蛋白的12.2%和6.2%。结论：上述两种gag重组蛋白可在E.Coli中得到表达，且有良好的抗原性。
中国图书分类号 Q78
Expression of the HIV-2 gag gene in E.coli
, 百拇医药
TIAN Mei①,JIN Ning-Yi,WANG Xiu-Qing et al.
Changchun University of Agriculture and Animal Sciences,Changchun 130062. Prevention Medical Institute, Norman Bethune University of Medical,Changchun 130021
Abstract Objective:To express HIV-2 gag protein in E.coli.Methods:Insert the entire and truncated gag gene into the expressing vector pET-17b respectively,then transform and culture E.coli BL21(DE3).Results:Expressed fusion proteins of 51,61 kD could be recognized by serum from HIV-2 infected patients. They occupied 12.2% and 6.2% of the expressing host's total proteins respectively.Conclusion:The HIV-2 gag recombinant protein could be expressed in E.coli. The expressed gag protein has perfect antigenicity.
, 百拇医药
Key words Human immunodeficiency virus type Ⅱ gag gene E.coli Expresion
艾滋病是目前对全球健康威胁最大的一种病毒病，引起艾滋病的主要病原为HIV-1和HIV-2。HIV-2与HIV-1相比，具有潜伏期长、病情较轻、存活时间长的特点，在HIV-2的高发地区，HIV-1的感染率大大降低[1]。但对HIV-2尚没有特异的诊断方法。HIV-2核心蛋白(gag，group antigen gene)基因产物为未经拼接的mRNA翻译的55 kD的gag蛋白前体[1，2]，裂解为成熟的病毒粒子p16、p26和p12,HIV-2 gag蛋白含有大量的高度保守的功能区。许多研究结果表明，在HIV-2gag基因中发现了HIV-2的特异性CTL反应抗原决定簇[1，3]，可与感染者淋巴细胞发生CTL反应，感染早期，诱导机体产生高水平的中和抗体。可作为艾滋病早期诊断的指标。
, 百拇医药
本文利用高效表达载体pET-17b在大肠杆菌中表达了gag基因产物，为进一步制备抗gag抗体及早期诊断抗原奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 E.coli HB101.BL21(DE3)均由本室保存。质粒pCRTMII-TAgag1(含1.282 kb的部分p55gag基因)和pCRTMII-TAgag2(含1.56 kb的全部p55gag基因,包括280 bp的gag:pol重叠区)。均由本室金宁一博士保存，中间载体pBluescript KS(-)和表达载体pET-17b(3.3 kb含T7噬菌体启动子)购自Novagen公司。
1.1.2 工具酶和生化试剂 限制性内切酶和其它工具酶及主要试剂均购自华美生物工程公司和美国Sigma公司产品，HIV-2感染者全血清由北京高达生物技术研究所提供。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 一般方法 均参考文献[4]有关章节。
1.2.2 重组质粒的构建
1.2.2.1 重组中间质粒的构建 用限制性内切酶BglII消化质粒pCRTMII-TAgag1、pCRTMII-TAgag2,回收所需的编码部分gag基因的p55gag1(简称G1,nt546 bp～nt1 828 bp)和编码全部gag基因的p55gag2(简称G2,nt546 bp～nt2 114 bp,其中从nt1 828 bp～2 114 bp为gag、pol重叠区)基因序列。插入中间载体质粒pBluescript KS(简称KS)的BamHI位点中，使其符合正确的读码框架,筛选正向重组质粒。
1.2.2.2 重组表达质粒的构建 用限制性内切酶XbaI酶切正向重组中间质粒，经Klenow大片段补平，用限制性内切酶EcoRI消化回收后，定向插入到表达质粒pET-17b的EcoRI-EcoRV位点间。构建重组表达质粒。
, 百拇医药
1.2.3 IPTG诱导后融合蛋白的表达 将上述重组表达质粒分别转化受体菌E.Coli BL21(DE3)中，以只含质粒pET-17b的大肠杆菌为对照菌株作诱导表达。分别挑取转化菌落,接种到5 ml含200 μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中,37℃剧烈振荡培养至OD600=0.6～1.0,其中诱导表达组加入IPTG(400 mmol/L)至终浓度为1 mmol/L,37℃振摇培养3 h,对照组同样37℃振荡培养3 h,4℃5 000 r/min离心5 min收集菌体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.2.4 包含体纯化 诱导方法同上,5 000 r/min离心收集菌体,用1/10培养基体积的贮存液(50 mmol/L Tris.Cl pH8.0,2 mmol/L EDTA)重悬,加入溶菌酶至终浓度100 μg/ml,再加1/10体积1%的TritonX-100,30℃温育15 min,置冰浴中超声波处理,或加DNA酶至终浓度20 μg/ml,室温10 min放置使其不再粘稠,12 000 r/min离心15 min,上清液中含有可溶性蛋白,加入等体积2×SDS上样缓冲液,沉淀为不溶性部分(包含体部分),重悬于1×SDS加样缓冲液中,室温下电泳。
, 百拇医药
1.2.5 重组质粒表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 参照文献[4]方法，以含质粒pET-17b的细菌和标准蛋白分子量作对照，进行12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后观察。
1.2.6 表达产物的Western blot检测 经1.2.5分离的蛋白,转移到硝酸纤维素膜上封闭1 h,以HIV-2病人全血清作为第一抗体,以碱性磷酸酶标记的抗人IgG为第二抗体,分别在室温感作2 h,用BCIP/NBT进行显色。
1.2.7 目的蛋白表达量的测定 分别取40 μl溶菌悬液和沉淀加样溶液作SDS-PAGE，经考马斯亮蓝R250染色、脱色干燥后，用CS-9000型薄层扫描仪测定其560 nm波长下的吸收值，测定目的蛋白的相对含量。
2 结果
2.1 中间质粒、重组质粒的构建(图1)，中间质粒命名为pKSG1和pKSG2，重组质粒分别命名为pG1和pG2。
, 百拇医药
图1 重组质粒的构建示意图
Fig.1 Construction of the recombinant expression plasmids
2.2 SDS-PAGE分析及Western blot 表明含pET-17b的对照菌体,在51和61 kD处均未见明显蛋白带,表达pG1、pG2的菌体相应位置各多出一条蛋白条带如图2。将含表达质粒pG1的 E.coli BL21(DE3)诱导菌体表达产物转移至硝酸纤维素膜后，经HIV-2病人全血清检测表明,在51 kD处显现特异性反应显色带，对照菌体未见反应显色带。同样，pG2经Western blot检测后，在表达受体菌体61 kD处也出现特异性反应显色带，其分子量与预计相符。但在比61 kD小的50～60 kD处亦有一条较弱的特异性显色带,与pG1表达的蛋白大小相符。pG1和pG2经与健康全血清反应后均未见特异显色带，制备pG1和pG2的包含体后, 进行了Western blot仍然得到同样结果。
, 百拇医药
图2 pG1和pG2的SDS-PAGE试验
Fig.2 SDS-PAGE of recombinant protein
Note:1.pG2;2.pET-17b;3.pET-17b；4.pG1；5.Marker
2.3 目的蛋白表达量的测定 经薄层扫描,可见pG1、pG2表达量分别占菌体总蛋白的12.2%和6.2%。
3 讨论
pET表达载体系统是理想的原核表达系统，其T7噬菌体启动子只能被T7噬菌体RNA聚合酶特异识别,本试验所用的表达宿主菌是与表达载体pET-17b相匹配的E.Coli BL21的DE3噬菌体溶源菌，DE3有噬菌体免疫区域的λ衍生体，带有lacI基因DNA片段，lacUV5启动子、lacZ基因起始区和T7RNA聚合酶基因，直接转录T7RNA聚合酶基因的启动子lacUV5可被IPTG诱导，使其产生T7RNA聚合酶,识别pET-17b所带的T7启动子，启动转录并使其下游的外源基因表达，同时BL21(DE3)缺失了可致外源基因降解的Lon基因和OmpT外源蛋白酶基因，所以本实验所表达的两种外源基因在E.Coli BL21(DE3)中表达量较高且较稳定,并易形成包含体。
, 百拇医药
除此之外，本实验结果进行部分gag基因的表达(pG1)与预计分子量相符，而进行全部gag基因表达(pG2)时，则可见两条特异显色带，其中61 kD与预计分子量相符，而较小的一条蛋白带分子量则与部分gag基因的表达分子量相同。这可能与gag基因下游存在280 bp的gag∶pol基因重叠区有关[5],可能为pol所编码的蛋白酶区域，故表达蛋白pG2可能被蛋白酶降解，或者是被大肠杆菌中所含的蛋白酶降解所致(E.coli内有8种以上的蛋白酶)。pol基因无起始密码子,它的转录和翻译是靠gag基因读框移位来实现的,所以pG2可能在pol读框移位时,使翻译部分地终止而出现低分子量蛋白带。
本实验所表达的全部p55gag蛋白与部分p55gag蛋白均可与HIV-2病人全血清发生特异的显色反应。具有很强的反应原性。HIV-2gag蛋白是HIV-2的主要结构蛋白，含有诱导机体体液免疫和细胞免疫的高度保守的多区抗原决定簇，其所产生的特异的CTL反应是机体抗HIV的主要机制。有资料显示，HIV-2无症状的感染期，HIV复制就很活跃，此时，抗HIV-2p26gag抗体及CTL应答则早于其它抗体的出现[6]。因而通过对gag基因的原核表达为今后的抗体制备，HIV-2感染的早期诊断和监测，为建立HIV-2感染的特异性诊断方法奠定了基础。
, http://www.100md.com
①白求恩医科大学预防医学院卫生毒理教研室，长春130021
②白求恩医科大学应用基础研究所，长春130021
作者简介：田 梅, 女, 29岁, 卫生毒理专业硕士生;
指导教师, 范洪学,男, 教授，博士生导师，主要研究辐射血液学;
金宁一, 男, 教授, 主要研究分子病毒学及传染病学
4 参考文献
1 Hiroyoshi K, Hideki T. Viral RNA-binding activity of HIV-2 nucleocapsid pretein is inhibited by a synthetic peptide containing the frist zinc finger motif of HIV-2. AIDS, 1992; 8: 1227-1235
, 百拇医药
2 Mireille G, Michacl E, Pierre S et al. Genome organization and transactivation of the Human immunodeficience virus type 2. NATURE, 1987; 326: 662-669
3 Niedrig M, Rabanus J P, Lagestehr J et al. Monoclonal antibodies directed against human immunodificience virus gag proteins with specificity for conserved epitopes in HIV-1,HIV-2 and simian immunodificiency virus. J.Gen. Virol,1988, 69: 2109-2114
4 Sambrook J,Fritsch E F 著.金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：北京科学出版社,1992： 16-68
5 Akira H,Hajzme T,Noboru M et al. Genomic divergence of HIV-2 from Ghane.Aids Res Hum Retroviruses, 1989;5:593-604
6 Francois S, Sophie M, Catherine T et al. Celluar and plasma viral load in patients infected with HIV-2. AIDS, 1993; 7: 1411-1417
〔收稿1997-09-11 修回1998-03-11〕, 百拇医药
单位：解放军农牧大学军事兽医研究所，长春130062)
关键词：人Ⅱ型免疫缺陷病毒；gag基因；大肠杆菌；表达
中国免疫学杂志/990606 摘 要 目的：表达HIV-2型基因工程gag抗原。方法：将编码HIV-2型gag的部分和全部p55gag1/2基因，克隆到载体pET-17b后，分别在E.Coli BL21(DE3)中表达。结果：表达产物为51和61 kD融合蛋白，并可与HIV-2病人血清发生特异性反应。表达量分别为菌体总蛋白的12.2%和6.2%。结论：上述两种gag重组蛋白可在E.Coli中得到表达，且有良好的抗原性。
中国图书分类号 Q78
Expression of the HIV-2 gag gene in E.coli
, 百拇医药
TIAN Mei①,JIN Ning-Yi,WANG Xiu-Qing et al.
Changchun University of Agriculture and Animal Sciences,Changchun 130062. Prevention Medical Institute, Norman Bethune University of Medical,Changchun 130021
Abstract Objective:To express HIV-2 gag protein in E.coli.Methods:Insert the entire and truncated gag gene into the expressing vector pET-17b respectively,then transform and culture E.coli BL21(DE3).Results:Expressed fusion proteins of 51,61 kD could be recognized by serum from HIV-2 infected patients. They occupied 12.2% and 6.2% of the expressing host's total proteins respectively.Conclusion:The HIV-2 gag recombinant protein could be expressed in E.coli. The expressed gag protein has perfect antigenicity.
, 百拇医药
Key words Human immunodeficiency virus type Ⅱ gag gene E.coli Expresion
艾滋病是目前对全球健康威胁最大的一种病毒病，引起艾滋病的主要病原为HIV-1和HIV-2。HIV-2与HIV-1相比，具有潜伏期长、病情较轻、存活时间长的特点，在HIV-2的高发地区，HIV-1的感染率大大降低[1]。但对HIV-2尚没有特异的诊断方法。HIV-2核心蛋白(gag，group antigen gene)基因产物为未经拼接的mRNA翻译的55 kD的gag蛋白前体[1，2]，裂解为成熟的病毒粒子p16、p26和p12,HIV-2 gag蛋白含有大量的高度保守的功能区。许多研究结果表明，在HIV-2gag基因中发现了HIV-2的特异性CTL反应抗原决定簇[1，3]，可与感染者淋巴细胞发生CTL反应，感染早期，诱导机体产生高水平的中和抗体。可作为艾滋病早期诊断的指标。
, 百拇医药
本文利用高效表达载体pET-17b在大肠杆菌中表达了gag基因产物，为进一步制备抗gag抗体及早期诊断抗原奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 E.coli HB101.BL21(DE3)均由本室保存。质粒pCRTMII-TAgag1(含1.282 kb的部分p55gag基因)和pCRTMII-TAgag2(含1.56 kb的全部p55gag基因,包括280 bp的gag:pol重叠区)。均由本室金宁一博士保存，中间载体pBluescript KS(-)和表达载体pET-17b(3.3 kb含T7噬菌体启动子)购自Novagen公司。
1.1.2 工具酶和生化试剂 限制性内切酶和其它工具酶及主要试剂均购自华美生物工程公司和美国Sigma公司产品，HIV-2感染者全血清由北京高达生物技术研究所提供。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 一般方法 均参考文献[4]有关章节。
1.2.2 重组质粒的构建
1.2.2.1 重组中间质粒的构建 用限制性内切酶BglII消化质粒pCRTMII-TAgag1、pCRTMII-TAgag2,回收所需的编码部分gag基因的p55gag1(简称G1,nt546 bp～nt1 828 bp)和编码全部gag基因的p55gag2(简称G2,nt546 bp～nt2 114 bp,其中从nt1 828 bp～2 114 bp为gag、pol重叠区)基因序列。插入中间载体质粒pBluescript KS(简称KS)的BamHI位点中，使其符合正确的读码框架,筛选正向重组质粒。
1.2.2.2 重组表达质粒的构建 用限制性内切酶XbaI酶切正向重组中间质粒，经Klenow大片段补平，用限制性内切酶EcoRI消化回收后，定向插入到表达质粒pET-17b的EcoRI-EcoRV位点间。构建重组表达质粒。
, 百拇医药
1.2.3 IPTG诱导后融合蛋白的表达 将上述重组表达质粒分别转化受体菌E.Coli BL21(DE3)中，以只含质粒pET-17b的大肠杆菌为对照菌株作诱导表达。分别挑取转化菌落,接种到5 ml含200 μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中,37℃剧烈振荡培养至OD600=0.6～1.0,其中诱导表达组加入IPTG(400 mmol/L)至终浓度为1 mmol/L,37℃振摇培养3 h,对照组同样37℃振荡培养3 h,4℃5 000 r/min离心5 min收集菌体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.2.4 包含体纯化 诱导方法同上,5 000 r/min离心收集菌体,用1/10培养基体积的贮存液(50 mmol/L Tris.Cl pH8.0,2 mmol/L EDTA)重悬,加入溶菌酶至终浓度100 μg/ml,再加1/10体积1%的TritonX-100,30℃温育15 min,置冰浴中超声波处理,或加DNA酶至终浓度20 μg/ml,室温10 min放置使其不再粘稠,12 000 r/min离心15 min,上清液中含有可溶性蛋白,加入等体积2×SDS上样缓冲液,沉淀为不溶性部分(包含体部分),重悬于1×SDS加样缓冲液中,室温下电泳。
, 百拇医药
1.2.5 重组质粒表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 参照文献[4]方法，以含质粒pET-17b的细菌和标准蛋白分子量作对照，进行12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后观察。
1.2.6 表达产物的Western blot检测 经1.2.5分离的蛋白,转移到硝酸纤维素膜上封闭1 h,以HIV-2病人全血清作为第一抗体,以碱性磷酸酶标记的抗人IgG为第二抗体,分别在室温感作2 h,用BCIP/NBT进行显色。
1.2.7 目的蛋白表达量的测定 分别取40 μl溶菌悬液和沉淀加样溶液作SDS-PAGE，经考马斯亮蓝R250染色、脱色干燥后，用CS-9000型薄层扫描仪测定其560 nm波长下的吸收值，测定目的蛋白的相对含量。
2 结果
2.1 中间质粒、重组质粒的构建(图1)，中间质粒命名为pKSG1和pKSG2，重组质粒分别命名为pG1和pG2。
, 百拇医药
图1 重组质粒的构建示意图
Fig.1 Construction of the recombinant expression plasmids
2.2 SDS-PAGE分析及Western blot 表明含pET-17b的对照菌体,在51和61 kD处均未见明显蛋白带,表达pG1、pG2的菌体相应位置各多出一条蛋白条带如图2。将含表达质粒pG1的 E.coli BL21(DE3)诱导菌体表达产物转移至硝酸纤维素膜后，经HIV-2病人全血清检测表明,在51 kD处显现特异性反应显色带，对照菌体未见反应显色带。同样，pG2经Western blot检测后，在表达受体菌体61 kD处也出现特异性反应显色带，其分子量与预计相符。但在比61 kD小的50～60 kD处亦有一条较弱的特异性显色带,与pG1表达的蛋白大小相符。pG1和pG2经与健康全血清反应后均未见特异显色带，制备pG1和pG2的包含体后, 进行了Western blot仍然得到同样结果。
, 百拇医药
图2 pG1和pG2的SDS-PAGE试验
Fig.2 SDS-PAGE of recombinant protein
Note:1.pG2;2.pET-17b;3.pET-17b；4.pG1；5.Marker
2.3 目的蛋白表达量的测定 经薄层扫描,可见pG1、pG2表达量分别占菌体总蛋白的12.2%和6.2%。
3 讨论
pET表达载体系统是理想的原核表达系统，其T7噬菌体启动子只能被T7噬菌体RNA聚合酶特异识别,本试验所用的表达宿主菌是与表达载体pET-17b相匹配的E.Coli BL21的DE3噬菌体溶源菌，DE3有噬菌体免疫区域的λ衍生体，带有lacI基因DNA片段，lacUV5启动子、lacZ基因起始区和T7RNA聚合酶基因，直接转录T7RNA聚合酶基因的启动子lacUV5可被IPTG诱导，使其产生T7RNA聚合酶,识别pET-17b所带的T7启动子，启动转录并使其下游的外源基因表达，同时BL21(DE3)缺失了可致外源基因降解的Lon基因和OmpT外源蛋白酶基因，所以本实验所表达的两种外源基因在E.Coli BL21(DE3)中表达量较高且较稳定,并易形成包含体。
, 百拇医药
除此之外，本实验结果进行部分gag基因的表达(pG1)与预计分子量相符，而进行全部gag基因表达(pG2)时，则可见两条特异显色带，其中61 kD与预计分子量相符，而较小的一条蛋白带分子量则与部分gag基因的表达分子量相同。这可能与gag基因下游存在280 bp的gag∶pol基因重叠区有关[5],可能为pol所编码的蛋白酶区域，故表达蛋白pG2可能被蛋白酶降解，或者是被大肠杆菌中所含的蛋白酶降解所致(E.coli内有8种以上的蛋白酶)。pol基因无起始密码子,它的转录和翻译是靠gag基因读框移位来实现的,所以pG2可能在pol读框移位时,使翻译部分地终止而出现低分子量蛋白带。
本实验所表达的全部p55gag蛋白与部分p55gag蛋白均可与HIV-2病人全血清发生特异的显色反应。具有很强的反应原性。HIV-2gag蛋白是HIV-2的主要结构蛋白，含有诱导机体体液免疫和细胞免疫的高度保守的多区抗原决定簇，其所产生的特异的CTL反应是机体抗HIV的主要机制。有资料显示，HIV-2无症状的感染期，HIV复制就很活跃，此时，抗HIV-2p26gag抗体及CTL应答则早于其它抗体的出现[6]。因而通过对gag基因的原核表达为今后的抗体制备，HIV-2感染的早期诊断和监测，为建立HIV-2感染的特异性诊断方法奠定了基础。
, http://www.100md.com
①白求恩医科大学预防医学院卫生毒理教研室，长春130021
②白求恩医科大学应用基础研究所，长春130021
作者简介：田 梅, 女, 29岁, 卫生毒理专业硕士生;
指导教师, 范洪学,男, 教授，博士生导师，主要研究辐射血液学;
金宁一, 男, 教授, 主要研究分子病毒学及传染病学
4 参考文献
1 Hiroyoshi K, Hideki T. Viral RNA-binding activity of HIV-2 nucleocapsid pretein is inhibited by a synthetic peptide containing the frist zinc finger motif of HIV-2. AIDS, 1992; 8: 1227-1235
, 百拇医药
2 Mireille G, Michacl E, Pierre S et al. Genome organization and transactivation of the Human immunodeficience virus type 2. NATURE, 1987; 326: 662-669
3 Niedrig M, Rabanus J P, Lagestehr J et al. Monoclonal antibodies directed against human immunodificience virus gag proteins with specificity for conserved epitopes in HIV-1,HIV-2 and simian immunodificiency virus. J.Gen. Virol,1988, 69: 2109-2114
4 Sambrook J,Fritsch E F 著.金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：北京科学出版社,1992： 16-68
5 Akira H,Hajzme T,Noboru M et al. Genomic divergence of HIV-2 from Ghane.Aids Res Hum Retroviruses, 1989;5:593-604
6 Francois S, Sophie M, Catherine T et al. Celluar and plasma viral load in patients infected with HIV-2. AIDS, 1993; 7: 1411-1417
〔收稿1997-09-11 修回1998-03-11〕, 百拇医药