中国人中HLA-DPB1外显子3序列保守性的初步研究
作者：黄象艳 克丙申 徐 军 齐法莲 杨道理
单位：济南军区总医院免疫科，济南250031
关键词：
中国免疫学杂志990713 中国图书分类号 R392.13
人类主要组织相容性复合体(MHC)包含一组与机体免疫功能介导相关的基因群。人的MHC又称为人类白细胞抗原(HLA)，包括Ⅰ类和Ⅱ类抗原[1]。HLA存在广泛的多态性[2]。一般认为Ⅱ类抗原在外显子2具有多态性[3]，而外显子3相对保守，目前有关序列资料多为外国提供，对于中国人的这段基因尚未见报道。本文利用终止剂标记循环测序技术，对HLA-DPB1外显子3进行序列分析，初步探讨了在中国人中这段序列的保守性。
1 村料与方法
, http://www.100md.com
1.1 研究材料 中国汉族人外周血白细胞DNA，10例(T01～T10)。白细胞DNA的抽提方法参照文献[4]。
1.2 试剂和仪器 试剂购自P.E.公司和Pharmacia公司。310型全自动遗传分析仪购自P.E.公司。
1.3 PCR扩增及纯化 在外显子3两侧设计了2个引物。KP1：GAAGGACAATCTCAAATTCTA，KP2：TGGGGTCTAGAGGGTCATCA。PCR扩增引物结合温度采用48.5℃。由Sephaglas胶纯化试剂盒纯化PCR产物。
1.4 测序反应及纯化 使用P.E.公司测序反应试剂盒进行测序反应，测序反应产物经乙醇沉淀纯化。
1.5 序列资料分析 测序反应产物于全自动遗传分析仪上进行毛细管电泳。收集软件及分析软件自动处理信号，得到HLA-DPB1外显子3的序列分析资料。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HLA-DPB1外显子3的序列分析 经全自动遗传分析仪电泳分析得到10例标本HLA-DPB1，外显子3的序列结果(图略)。
2.2 HLA-DPB1外显子3序列保守性的分析 实验中10个序列资料与国外报道的HLA-DPB1外显子3的序列资料比较，绝大多数位点均一致。仅个别标本在极少数位点有差异。
3 讨论
本文描述了通过自动测序进行HLA-DPB1外显子3序列分析的方法。实验中，采用标记dNTP的循环测序技术。与引物标记染色技术相比，引物标记染色技术通常可得到最好的结果，因为峰非常均匀，容易判读[5]。但这一技术费时费力，因为每一样品需要4个反应，并要进行引物标记。我们使用了标记终止剂的测序技术，通常会得到不均匀的峰，但使用改进的酶(FS酶)，测序质量可以得到显著的提高，也可得到较好的测序结果。通过实验中测序结果间的比较，以及它们与国外报道的序列间的比较，可以看出，在这段序列中相似性极高，多态性很少。无论是在中国人的几例标本之间或是中国人与白种人之间均可看到这段序列的保守性。因此可以初步认为在中国人中HLA-DPB1外显子3同样具有高度保守性。
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作者简介：黄象艳，女，26岁，分子生物学硕士，主要从事HLA基因定型研究
4 参考文献
1 Gustafsson K,Widmark E,Jonsson A K et al.Evolution of DP region as deduced from nucleotide sequences of the four gene.The Journal of Biological Chemistry,1987;262(18):8778
2 Petersdorf E W,Hansen J A. A comprehensive approach for typing the alleles of the HLA-B locus by automated sequencing. Tissue Antigens,1995;46:73
, 百拇医药
3 Norgaard L,Fugger L,Jakobsen B K et al.Sequencing-based typing of HLA-A locus using mRNA and a single locus-specific PCR followed by cycle sequencing with Ampli Taq DNA polymerase,FS.Tissue Antigens,1997;49:455
4 林万明.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993：33-34
5 Kotsch K,Wehling J,Kohler S et al.Sequencing of HLA class Ⅰgenes based on the conserved diversity of the noncoding regions:sequencing-based typing of the HLA-A gene.Tissue Antigens,1997;50:178
收稿1998-12-21 修回1999-03-16, http://www.100md.com
单位：济南军区总医院免疫科，济南250031
关键词：
中国免疫学杂志990713 中国图书分类号 R392.13
人类主要组织相容性复合体(MHC)包含一组与机体免疫功能介导相关的基因群。人的MHC又称为人类白细胞抗原(HLA)，包括Ⅰ类和Ⅱ类抗原[1]。HLA存在广泛的多态性[2]。一般认为Ⅱ类抗原在外显子2具有多态性[3]，而外显子3相对保守，目前有关序列资料多为外国提供，对于中国人的这段基因尚未见报道。本文利用终止剂标记循环测序技术，对HLA-DPB1外显子3进行序列分析，初步探讨了在中国人中这段序列的保守性。
1 村料与方法
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1.1 研究材料 中国汉族人外周血白细胞DNA，10例(T01～T10)。白细胞DNA的抽提方法参照文献[4]。
1.2 试剂和仪器 试剂购自P.E.公司和Pharmacia公司。310型全自动遗传分析仪购自P.E.公司。
1.3 PCR扩增及纯化 在外显子3两侧设计了2个引物。KP1：GAAGGACAATCTCAAATTCTA，KP2：TGGGGTCTAGAGGGTCATCA。PCR扩增引物结合温度采用48.5℃。由Sephaglas胶纯化试剂盒纯化PCR产物。
1.4 测序反应及纯化 使用P.E.公司测序反应试剂盒进行测序反应，测序反应产物经乙醇沉淀纯化。
1.5 序列资料分析 测序反应产物于全自动遗传分析仪上进行毛细管电泳。收集软件及分析软件自动处理信号，得到HLA-DPB1外显子3的序列分析资料。
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2 结果
2.1 HLA-DPB1外显子3的序列分析 经全自动遗传分析仪电泳分析得到10例标本HLA-DPB1，外显子3的序列结果(图略)。
2.2 HLA-DPB1外显子3序列保守性的分析 实验中10个序列资料与国外报道的HLA-DPB1外显子3的序列资料比较，绝大多数位点均一致。仅个别标本在极少数位点有差异。
3 讨论
本文描述了通过自动测序进行HLA-DPB1外显子3序列分析的方法。实验中，采用标记dNTP的循环测序技术。与引物标记染色技术相比，引物标记染色技术通常可得到最好的结果，因为峰非常均匀，容易判读[5]。但这一技术费时费力，因为每一样品需要4个反应，并要进行引物标记。我们使用了标记终止剂的测序技术，通常会得到不均匀的峰，但使用改进的酶(FS酶)，测序质量可以得到显著的提高，也可得到较好的测序结果。通过实验中测序结果间的比较，以及它们与国外报道的序列间的比较，可以看出，在这段序列中相似性极高，多态性很少。无论是在中国人的几例标本之间或是中国人与白种人之间均可看到这段序列的保守性。因此可以初步认为在中国人中HLA-DPB1外显子3同样具有高度保守性。
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作者简介：黄象艳，女，26岁，分子生物学硕士，主要从事HLA基因定型研究
4 参考文献
1 Gustafsson K,Widmark E,Jonsson A K et al.Evolution of DP region as deduced from nucleotide sequences of the four gene.The Journal of Biological Chemistry,1987;262(18):8778
2 Petersdorf E W,Hansen J A. A comprehensive approach for typing the alleles of the HLA-B locus by automated sequencing. Tissue Antigens,1995;46:73
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3 Norgaard L,Fugger L,Jakobsen B K et al.Sequencing-based typing of HLA-A locus using mRNA and a single locus-specific PCR followed by cycle sequencing with Ampli Taq DNA polymerase,FS.Tissue Antigens,1997;49:455
4 林万明.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993：33-34
5 Kotsch K,Wehling J,Kohler S et al.Sequencing of HLA class Ⅰgenes based on the conserved diversity of the noncoding regions:sequencing-based typing of the HLA-A gene.Tissue Antigens,1997;50:178
收稿1998-12-21 修回1999-03-16, http://www.100md.com