创伤后巨噬细胞抑制T细胞功能的分子机制研究
作者：梁华平 王正国 朱佩芳 罗艳 耿波 徐祥
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆400042
关键词：创伤；巨噬细胞；T淋巴细胞
中国免疫学杂志990804 摘 要 目的：研究创伤后巨噬细胞抑制T细胞功能的分子机制。方法：将创伤小鼠的巨噬细胞，加入至正常小鼠T细胞培养系统中，测定T细胞功能及细胞内信使分子。结果：创伤后巨噬细胞在体外可明显抑制经ConA刺激的正常T淋巴细胞转化、白介素2(IL-2)的生成、IL-2受体α(IL-2α)的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平，可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量、游离钙([Ca2+]i)浓度及蛋白激酶C(PKC)活性。去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，可不同程度地逆转T细胞功能的受抑状态，并降低cAMP含量，增加cGMP含量、[Ca2+]i浓度及PKC活性。结论：创伤后巨噬细胞可通过改变活化T细胞内信使分子水平，进而抑制T细胞功能。
, 百拇医药
中国图书分类号 R 640.3
Molecular mechanism of suppressive effect of macrophages from traumatized mice on T cell functions
LIANG Hua-Ping, WANG Zheng-Guo, ZHU Pei-Fang et al. Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042
Abstract Objective:To study molecular mechanism of suppressive effect of macrophages from traumatized mice on T cell functions. Methods:Macrophages from traumatized mice were added into the culture system of normal T cells and then T cell functions and intracellular messenger molecules were determined. Results:Macrophages from traumatized mice could obviously suppress transformation of normal T lymphocyte stimulated with ConA, interleukin 2(IL-2) production, IL-2 receptor α(IL-2Rα) expression ,IL-2 mRNA and IL-2R mRNA levels, and could elevate cAMP contents of activated normal T cells while decreasing cGMP contents, free calcium([Ca2+]i) concentration and protein kinase C(PKC) activity. Removal of macrophages from splenocytes of traumatized mice could at various degree reverse the suppression of T cell functions, decrease cAMP contents while increasing cGMP contents, [Ca2+]i concentration and PKC activity. Conclusions:Macrophages from traumatized mice may suppress T cell functions via altering messenger molecule levels in activated T cells.
, 百拇医药
Key words Trauma Macrophage T lymphocyte
严重创伤后巨噬细胞免疫抑制活性增强是导致T细胞功能受抑的重要原因之一。以往研究证实，创伤后巨噬细胞可通过分泌大量的PGE2及直接的细胞接触方式发挥其对T淋巴细胞功能的抑制效应[1，2]。但对其抑制T细胞功能的分子机制尚不清楚，本研究对此进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物及致伤模型 Balb/c小鼠(本校动物所提供)，雌雄各半，6～8周龄，18～22 g。随机分为正常对照、伤后1、2、4、7、10 d共6组，每组10只动物。参照文献[2]制备小鼠双后肢闭合性创伤模型。
1.2 T淋巴细胞的分离与活化 按常规制备脾细胞悬液，采用尼龙毛柱法[3]分离脾细胞中的T细胞。酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)染色法鉴定T细胞纯度>92%，台盼蓝拒染试验证明分离出的T细胞活力>95%。将T细胞以RPMI1640培养液(Gibco公司)调成5×106 ml-1，加入终浓度为10 μg/ml的ConA(Sigma公司)，于37℃、5%CO2培养箱中孵育以活化T细胞。
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1.3 活化T细胞指标测定
1.3.1 T淋巴细胞转化、IL-2活性、IL-2Rα测定 参照文献[4]进行。3H-TdR由中国科学院上海原子能研究所提供，IL-2标准品及CTLL2细胞株由第三军医大学免疫教研室提供，大鼠抗小鼠IL-2Rα单克隆抗体由Boehringer Mannheim公司提供，FITC标记兔抗大鼠IgG单克隆抗体由华美生物工程公司提供。
1.3.2 IL-2 mRNA，IL-2Rα mRNA测定 T细胞经活化10 h后收集细胞，以异硫氰酸胍-苯酚-氯仿/异戊醇法提取细胞总RNA，参照文献[4，5]测定IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA水平。所用的cDNA探针包括：1.0 kb片段的IL-2 cDNA和0.92 kb片段的IL-2Rα cDNA(ATCC公司)。地高辛随机引物标记药盒由Boehringer Mannheim公司提供。
, 百拇医药
1.3.3 cAMP、cGMP含量、游离钙([Ca2+]i)浓度、蛋白激酶C(PKC)活性测定 T细胞经活化2 h后收集细胞，参照文献[6-8]处理细胞并测定cAMP、cGMP含量、[Ca2+]i浓度及PKC活性。
1.4 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T细胞上述指标的影响 在正常T细胞活化培养的同时，加入各组巨噬细胞(占细胞总数10%)，测定各指标变化情况。
1.5 去除脾细胞中巨噬细胞对上述指标的影响 按常规制备脾细胞悬液，置于塑料平皿中，于培养箱中孵育2 h使巨噬细胞贴壁，收集非粘附细胞并调至原浓度，参照活化T细胞的方法，活化脾细胞及非粘附细胞，测定上述指标的变化。
1.6 统计学处理 结果以平均值±标准差(
±s)表示，用t检验进行显著性分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用 于正常小鼠T细胞培养系统中，加入正常对照组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有轻微刺激作用，但加入创伤各组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有不同程度的抑制作用，以伤后1、2、4 d 的抑制作用最为明显，伤后10 d尚未完全恢复至正常对照水平(表1)。
2.2 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响 与正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外对正常T淋巴细胞IL-2的生成、IL-2Rα表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均具有明显的抑制作用(表2)。
2.3 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响 和正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP/cGMP比值，并明显降低细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性(表3)。
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2.4 去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响 去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对脾细胞IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使4项指标的水平明显升高，但并不能使之完全恢复至正常(表4)。
2.5 去除脾细胞中巨噬细胞后对活化脾细胞内信使分子的影响 去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对活化脾细胞内cAMP、cGMP含量，[Ca2+]i浓度及PKC活性无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可明显降低其cAMP含量、增加cGMP含量，升高细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性(表5)。
表1 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用(±s，n=10)
, 百拇医药
Tab.1 In vitro suppressive effects of macrophages from each group on T lymphocyte transformation of normal mice (±s,n=10) Groups
T lymphocyte transformation(cpm)
Suppressive rate(%)
Normal T cells
15 210±2 245
0
+MΦ of normal control
, 百拇医药
16 427±2 032
-8±4
+MΦ on day 1 posttrauma
12 016±1 6481)
21±4
+MΦ on day 2 posttrauma
9 582±8652)
37±7
+MΦ on day 4 posttrauma
8 670±9402)
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43±4
+MΦ on day 7 posttrauma
12 472±2 156
18±3
+MΦ on day 10 posttrauma
12 320±1 274
19±3
Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs normal control表2 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响(±s，n=10)
Tab.2 In vitro effects of macrophages from each group on T lymphocyte functions of normal mice(±s,n=10) Groups
, 百拇医药
IL-2(U/ml)
IL-2Rα(%)
IL-2 mRNA(%)
IL-2Rα mRNA(%)
Normal T cells
67±11
59±9
100±9
10±11
+MΦ of normal control
71±10
, http://www.100md.com 58±7
109±8
110±12
+MΦ on day 4 posttrauma
45±71)
36±52)
56±82)
59±72)
Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs normal control表3 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响(±s，n=10)
, 百拇医药
Tab.3 In vitro effects of macrophages from each group on messenger molecules of activated T cells from normal mice (±s,n=10) Groups
cAMP
(pmol/107cell)
cGMP
(pmol/107cell)
cAMP/cGMP
[Ca2+]i
, 百拇医药
(nmol/L)
PKC
[pmol/(mg*p*min)]
Normal T cells
23.3±3.3
20.8±3.1
1.1±0.2
237±33
158±27
+MΦ of normal control
22.8±3.5
, 百拇医药 21.2±2.4
1.1±0.3
289±38
156±21
+MΦ on day 4 posttrauma
30.1±4.71)
15.0±2.11)
2.0±0.22)
149±172)
101±162)
, 百拇医药
Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs normal control表4 去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响(±s，n=10)
Tab.4 Effect of removal of macrophages from splenocytes on T cell functions (±s,n=10) Groups
IL-2(U/ml)
IL-2Rα(%)
IL-2 mRNA(%)
IL-2Rα mRNA(%)
, 百拇医药
Normal control:
total splenocytes
52±8
64±13
100±11
100±13
removal of MΦ
48±7
63±10
93±9
91±8
Day 4 posttrauma:
, http://www.100md.com
total splenocytes
22±71)
37±81)
56±81)
52±91)
removal of MΦ
42±63)
58±62)
87±72)
92±73)
, http://www.100md.com
Note:1)P<0.05 vs normal control；2)P<0.05；3)P<0.01 vs total splenocytes subgroup on 4 day posttrauma表5 去除脾细胞中巨噬细胞后对活化脾细胞内信使分子的影响(±s，n=10)
Tab.5 Effect of removal of macrophages from splenocytes on messenger molecules of activated splenocytes(±s,n=10) Groups
cAMP
(pmol/107cell)
, 百拇医药
cGMP
(pmol/107cell)
cAMP/cGMP
[Ca2+]i
(nmol/L)
PKC
[pmol/(mg*p*min)]
Normal control:
total splenocytes
32.8±4.0
30.7±5.0
, 百拇医药
1.1±0.3
224±31
147±19
removal of MΦ
30.4±4.2
32.4±4.4
0.9±0.2
231±22
142±21
Day 4 posttrauma:
total splenocytes
39.7±4.71)
, 百拇医药
16.1±3.52)
2.4±0.51)
143±162)
101±211)
removal of MΦ
30.8±3.23)
28.9±3.03)
1.1±0.44)
207±274)
143±183)
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Note:1)P<0.05；2)P<0.01 vs normal control；3)P<0.05；4)P<0.01 vs total splenocytes subgroup on 4 day posttrauma
3 讨论
严重创伤可致机体的免疫功能紊乱，以T细胞介导的细胞免疫功能受抑制现象表现得尤为突出[1]。而创伤后巨噬细胞抗原呈递功能减弱、抑制型亚群数目增多及抑制活性增强是导致T细胞功能降低的重要原因之一[9]。本研究观察到，创伤小鼠巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化、IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2α mRNA水平均具有明显的抑制作用，去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使T细胞功能得以不同程度的逆转。表明创伤后巨噬细胞确可抑制T细胞功能。这可能与创伤后巨噬细胞可分泌大量的免疫抑制成分(如PGE2)和对T细胞具有直接的细胞-细胞接触免疫抑制作用有关[1，2]。
, 百拇医药
cAMP、cGMP是发现较早的细胞内信使分子。对于免疫细胞而言，cAMP常介导免疫抑制效应。其对T细胞的作用主要表现为：抑制T细胞的活化与增殖；抑制IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及活化T细胞对IL-2的反应性；降低IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA的水平。与cAMP相反，cGMP则有利于促进T淋巴细胞的功能[5，10]。说明cAMP、cGMP含量及其比值的变化均可影响T淋巴细胞的功能。有证据表明，细胞内[Ca2+]i浓度增加、PKC活性增强是T细胞活化的必需事件[10]，而T细胞的活化又导致IL-2的合成及IL-2R的表达，进而引起T细胞的克隆性增殖。可见活化T细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性的高低也可影响T细胞的功能。创伤后巨噬细胞对T细胞功能的抑制效应是否可通过调节T细胞内信使分子水平而介导?尚鲜见文献报道。本研究观察到，创伤后巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP/cGMP比值，并明显降低细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性，去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可明显降低其cAMP含量，增加cGMP含量，升高细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性。表明创伤后巨噬细胞可参与调节T细胞的活化过程，并改变活化T细胞内信使分子水平。这可能是创伤后巨噬细胞发挥对T细胞免疫抑制效应的重要分子机制之一。
, 百拇医药
已知创伤后巨噬细胞产生PGE2的能力明显增强[1，9]。而PGE2可增加T细胞内cAMP含量，进而提高cAMP/cGMP比值[5]。增高的cAMP又可干扰T细胞膜上磷脂酶C的活化及磷脂酰肌醇代谢，降低细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性，从而抑制T细胞的活化[10]。推测创伤后巨噬细胞对T细胞活化过程中信使分子的调节作用可能与此有关。关于创伤后巨噬细胞调节T细胞功能的详细作用机理尚需深入研究。
国家自然科学基金资助项目(No.39170744)
作者简介：梁华平，男，32岁，医学博士，副研究员，主要从事创伤感染与免疫的研究；
王正国，男，62岁，中国工程院院士，主要研究创伤外科学
, 百拇医药 4 参考文献
1 Grbic J T, Mannick J A, Cough D B et al. The role of prostaglandin E2 in immune suppression following injury. Ann Surg, 1991;214(3):253
2 梁华平，王正国，耿 波et al.创伤后巨噬细胞对T细胞白介素2及白介素2受体α基因表达的直接接触抑制作用.细胞生物学杂志，1995；17(2)：86
3 李绍康，沈瑞珍.用国产尼龙毛纤维分离小鼠T淋巴细胞及T细胞鉴定.上海免疫学杂志，1981；1(1)：10
4 Horgan A F, mendez M V, O'Riordain D S et al. Altered gene transcription after burn injury results in depressed T-lymphocyte activation. Ann Surg,1994;220(3):342
, 百拇医药
5 Anastassiou E D, Paliogianni F, Balow J P et al. Prostaglandin E2 and other cyclic AMP-elevating agents modulate IL-2 and IL-2R gene expression at multiple levels. J Immunol,1992;148(9):2845
6 陈海鑫，李振甲.组织中cAMP，cGMP放免分析法的改进.生物化学与生物物理进展，1986；13(5)：28
7 Hoyt D B, Ozkan A N, Frevert J et al. Alteration in Ca2+ homeostasis by a trauma peptide. J Surg Res, 1991;51:477
8 Christiansen N O, Juhl H.Purification and properties of protein kinase C from bovine polymorphonuclear leukocytes. Biochem Biophys Acta, 1986;885:170
, 百拇医药
9 Miller-Graziano C L, Szabo G,Kodvs K et al. Alterations in posttrauma monocyte subpopulation: Role in septic shock syndrome. J Trauma,1990;30(S12):S86
10 Hadden J W. Transmembrane signals in the activation of T lymphocytes by mitogenic antigens. Immunol Today, 1988;9:235
〔收稿1997-05-12 修回1998-02-04〕, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆400042
关键词：创伤；巨噬细胞；T淋巴细胞
中国免疫学杂志990804 摘 要 目的：研究创伤后巨噬细胞抑制T细胞功能的分子机制。方法：将创伤小鼠的巨噬细胞，加入至正常小鼠T细胞培养系统中，测定T细胞功能及细胞内信使分子。结果：创伤后巨噬细胞在体外可明显抑制经ConA刺激的正常T淋巴细胞转化、白介素2(IL-2)的生成、IL-2受体α(IL-2α)的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平，可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量、游离钙([Ca2+]i)浓度及蛋白激酶C(PKC)活性。去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，可不同程度地逆转T细胞功能的受抑状态，并降低cAMP含量，增加cGMP含量、[Ca2+]i浓度及PKC活性。结论：创伤后巨噬细胞可通过改变活化T细胞内信使分子水平，进而抑制T细胞功能。
, 百拇医药
中国图书分类号 R 640.3
Molecular mechanism of suppressive effect of macrophages from traumatized mice on T cell functions
LIANG Hua-Ping, WANG Zheng-Guo, ZHU Pei-Fang et al. Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042
Abstract Objective:To study molecular mechanism of suppressive effect of macrophages from traumatized mice on T cell functions. Methods:Macrophages from traumatized mice were added into the culture system of normal T cells and then T cell functions and intracellular messenger molecules were determined. Results:Macrophages from traumatized mice could obviously suppress transformation of normal T lymphocyte stimulated with ConA, interleukin 2(IL-2) production, IL-2 receptor α(IL-2Rα) expression ,IL-2 mRNA and IL-2R mRNA levels, and could elevate cAMP contents of activated normal T cells while decreasing cGMP contents, free calcium([Ca2+]i) concentration and protein kinase C(PKC) activity. Removal of macrophages from splenocytes of traumatized mice could at various degree reverse the suppression of T cell functions, decrease cAMP contents while increasing cGMP contents, [Ca2+]i concentration and PKC activity. Conclusions:Macrophages from traumatized mice may suppress T cell functions via altering messenger molecule levels in activated T cells.
, 百拇医药
Key words Trauma Macrophage T lymphocyte
严重创伤后巨噬细胞免疫抑制活性增强是导致T细胞功能受抑的重要原因之一。以往研究证实，创伤后巨噬细胞可通过分泌大量的PGE2及直接的细胞接触方式发挥其对T淋巴细胞功能的抑制效应[1，2]。但对其抑制T细胞功能的分子机制尚不清楚，本研究对此进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物及致伤模型 Balb/c小鼠(本校动物所提供)，雌雄各半，6～8周龄，18～22 g。随机分为正常对照、伤后1、2、4、7、10 d共6组，每组10只动物。参照文献[2]制备小鼠双后肢闭合性创伤模型。
1.2 T淋巴细胞的分离与活化 按常规制备脾细胞悬液，采用尼龙毛柱法[3]分离脾细胞中的T细胞。酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)染色法鉴定T细胞纯度>92%，台盼蓝拒染试验证明分离出的T细胞活力>95%。将T细胞以RPMI1640培养液(Gibco公司)调成5×106 ml-1，加入终浓度为10 μg/ml的ConA(Sigma公司)，于37℃、5%CO2培养箱中孵育以活化T细胞。
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1.3 活化T细胞指标测定
1.3.1 T淋巴细胞转化、IL-2活性、IL-2Rα测定 参照文献[4]进行。3H-TdR由中国科学院上海原子能研究所提供，IL-2标准品及CTLL2细胞株由第三军医大学免疫教研室提供，大鼠抗小鼠IL-2Rα单克隆抗体由Boehringer Mannheim公司提供，FITC标记兔抗大鼠IgG单克隆抗体由华美生物工程公司提供。
1.3.2 IL-2 mRNA，IL-2Rα mRNA测定 T细胞经活化10 h后收集细胞，以异硫氰酸胍-苯酚-氯仿/异戊醇法提取细胞总RNA，参照文献[4，5]测定IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA水平。所用的cDNA探针包括：1.0 kb片段的IL-2 cDNA和0.92 kb片段的IL-2Rα cDNA(ATCC公司)。地高辛随机引物标记药盒由Boehringer Mannheim公司提供。
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1.3.3 cAMP、cGMP含量、游离钙([Ca2+]i)浓度、蛋白激酶C(PKC)活性测定 T细胞经活化2 h后收集细胞，参照文献[6-8]处理细胞并测定cAMP、cGMP含量、[Ca2+]i浓度及PKC活性。
1.4 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T细胞上述指标的影响 在正常T细胞活化培养的同时，加入各组巨噬细胞(占细胞总数10%)，测定各指标变化情况。
1.5 去除脾细胞中巨噬细胞对上述指标的影响 按常规制备脾细胞悬液，置于塑料平皿中，于培养箱中孵育2 h使巨噬细胞贴壁，收集非粘附细胞并调至原浓度，参照活化T细胞的方法，活化脾细胞及非粘附细胞，测定上述指标的变化。
1.6 统计学处理 结果以平均值±标准差(
±s)表示，用t检验进行显著性分析。, 百拇医药
2 结果
2.1 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用 于正常小鼠T细胞培养系统中，加入正常对照组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有轻微刺激作用，但加入创伤各组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有不同程度的抑制作用，以伤后1、2、4 d 的抑制作用最为明显，伤后10 d尚未完全恢复至正常对照水平(表1)。
2.2 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响 与正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外对正常T淋巴细胞IL-2的生成、IL-2Rα表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均具有明显的抑制作用(表2)。
2.3 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响 和正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP/cGMP比值，并明显降低细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性(表3)。
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2.4 去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响 去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对脾细胞IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使4项指标的水平明显升高，但并不能使之完全恢复至正常(表4)。
2.5 去除脾细胞中巨噬细胞后对活化脾细胞内信使分子的影响 去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对活化脾细胞内cAMP、cGMP含量，[Ca2+]i浓度及PKC活性无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可明显降低其cAMP含量、增加cGMP含量，升高细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性(表5)。
表1 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用(
±s，n=10), 百拇医药
Tab.1 In vitro suppressive effects of macrophages from each group on T lymphocyte transformation of normal mice (
±s,n=10) GroupsT lymphocyte transformation(cpm)
Suppressive rate(%)
Normal T cells
15 210±2 245
0
+MΦ of normal control
, 百拇医药
16 427±2 032
-8±4
+MΦ on day 1 posttrauma
12 016±1 6481)
21±4
+MΦ on day 2 posttrauma
9 582±8652)
37±7
+MΦ on day 4 posttrauma
8 670±9402)
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43±4
+MΦ on day 7 posttrauma
12 472±2 156
18±3
+MΦ on day 10 posttrauma
12 320±1 274
19±3
Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs normal control表2 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响(
±s，n=10)Tab.2 In vitro effects of macrophages from each group on T lymphocyte functions of normal mice(
±s,n=10) Groups, 百拇医药
IL-2(U/ml)
IL-2Rα(%)
IL-2 mRNA(%)
IL-2Rα mRNA(%)
Normal T cells
67±11
59±9
100±9
10±11
+MΦ of normal control
71±10
, http://www.100md.com 58±7
109±8
110±12
+MΦ on day 4 posttrauma
45±71)
36±52)
56±82)
59±72)
Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs normal control表3 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响(
±s，n=10), 百拇医药
Tab.3 In vitro effects of macrophages from each group on messenger molecules of activated T cells from normal mice (
±s,n=10) GroupscAMP
(pmol/107cell)
cGMP
(pmol/107cell)
cAMP/cGMP
[Ca2+]i
, 百拇医药
(nmol/L)
PKC
[pmol/(mg*p*min)]
Normal T cells
23.3±3.3
20.8±3.1
1.1±0.2
237±33
158±27
+MΦ of normal control
22.8±3.5
, 百拇医药 21.2±2.4
1.1±0.3
289±38
156±21
+MΦ on day 4 posttrauma
30.1±4.71)
15.0±2.11)
2.0±0.22)
149±172)
101±162)
, 百拇医药
Note:1)P<0.05，2)P<0.01 vs normal control表4 去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响(
±s，n=10)Tab.4 Effect of removal of macrophages from splenocytes on T cell functions (
±s,n=10) GroupsIL-2(U/ml)
IL-2Rα(%)
IL-2 mRNA(%)
IL-2Rα mRNA(%)
, 百拇医药
Normal control:
total splenocytes
52±8
64±13
100±11
100±13
removal of MΦ
48±7
63±10
93±9
91±8
Day 4 posttrauma:
, http://www.100md.com
total splenocytes
22±71)
37±81)
56±81)
52±91)
removal of MΦ
42±63)
58±62)
87±72)
92±73)
, http://www.100md.com
Note:1)P<0.05 vs normal control；2)P<0.05；3)P<0.01 vs total splenocytes subgroup on 4 day posttrauma表5 去除脾细胞中巨噬细胞后对活化脾细胞内信使分子的影响(
±s，n=10)Tab.5 Effect of removal of macrophages from splenocytes on messenger molecules of activated splenocytes(
±s,n=10) GroupscAMP
(pmol/107cell)
, 百拇医药
cGMP
(pmol/107cell)
cAMP/cGMP
[Ca2+]i
(nmol/L)
PKC
[pmol/(mg*p*min)]
Normal control:
total splenocytes
32.8±4.0
30.7±5.0
, 百拇医药
1.1±0.3
224±31
147±19
removal of MΦ
30.4±4.2
32.4±4.4
0.9±0.2
231±22
142±21
Day 4 posttrauma:
total splenocytes
39.7±4.71)
, 百拇医药
16.1±3.52)
2.4±0.51)
143±162)
101±211)
removal of MΦ
30.8±3.23)
28.9±3.03)
1.1±0.44)
207±274)
143±183)
, http://www.100md.com
Note:1)P<0.05；2)P<0.01 vs normal control；3)P<0.05；4)P<0.01 vs total splenocytes subgroup on 4 day posttrauma
3 讨论
严重创伤可致机体的免疫功能紊乱，以T细胞介导的细胞免疫功能受抑制现象表现得尤为突出[1]。而创伤后巨噬细胞抗原呈递功能减弱、抑制型亚群数目增多及抑制活性增强是导致T细胞功能降低的重要原因之一[9]。本研究观察到，创伤小鼠巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化、IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2α mRNA水平均具有明显的抑制作用，去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使T细胞功能得以不同程度的逆转。表明创伤后巨噬细胞确可抑制T细胞功能。这可能与创伤后巨噬细胞可分泌大量的免疫抑制成分(如PGE2)和对T细胞具有直接的细胞-细胞接触免疫抑制作用有关[1，2]。
, 百拇医药
cAMP、cGMP是发现较早的细胞内信使分子。对于免疫细胞而言，cAMP常介导免疫抑制效应。其对T细胞的作用主要表现为：抑制T细胞的活化与增殖；抑制IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及活化T细胞对IL-2的反应性；降低IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA的水平。与cAMP相反，cGMP则有利于促进T淋巴细胞的功能[5，10]。说明cAMP、cGMP含量及其比值的变化均可影响T淋巴细胞的功能。有证据表明，细胞内[Ca2+]i浓度增加、PKC活性增强是T细胞活化的必需事件[10]，而T细胞的活化又导致IL-2的合成及IL-2R的表达，进而引起T细胞的克隆性增殖。可见活化T细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性的高低也可影响T细胞的功能。创伤后巨噬细胞对T细胞功能的抑制效应是否可通过调节T细胞内信使分子水平而介导?尚鲜见文献报道。本研究观察到，创伤后巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP/cGMP比值，并明显降低细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性，去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可明显降低其cAMP含量，增加cGMP含量，升高细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性。表明创伤后巨噬细胞可参与调节T细胞的活化过程，并改变活化T细胞内信使分子水平。这可能是创伤后巨噬细胞发挥对T细胞免疫抑制效应的重要分子机制之一。
, 百拇医药
已知创伤后巨噬细胞产生PGE2的能力明显增强[1，9]。而PGE2可增加T细胞内cAMP含量，进而提高cAMP/cGMP比值[5]。增高的cAMP又可干扰T细胞膜上磷脂酶C的活化及磷脂酰肌醇代谢，降低细胞内[Ca2+]i浓度及PKC活性，从而抑制T细胞的活化[10]。推测创伤后巨噬细胞对T细胞活化过程中信使分子的调节作用可能与此有关。关于创伤后巨噬细胞调节T细胞功能的详细作用机理尚需深入研究。
国家自然科学基金资助项目(No.39170744)
作者简介：梁华平，男，32岁，医学博士，副研究员，主要从事创伤感染与免疫的研究；
王正国，男，62岁，中国工程院院士，主要研究创伤外科学
, 百拇医药 4 参考文献
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2 梁华平，王正国，耿 波et al.创伤后巨噬细胞对T细胞白介素2及白介素2受体α基因表达的直接接触抑制作用.细胞生物学杂志，1995；17(2)：86
3 李绍康，沈瑞珍.用国产尼龙毛纤维分离小鼠T淋巴细胞及T细胞鉴定.上海免疫学杂志，1981；1(1)：10
4 Horgan A F, mendez M V, O'Riordain D S et al. Altered gene transcription after burn injury results in depressed T-lymphocyte activation. Ann Surg,1994;220(3):342
, 百拇医药
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, 百拇医药
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〔收稿1997-05-12 修回1998-02-04〕, 百拇医药