抗人VEGF单抗的研制及对肿瘤生长及转移的抑制作用
作者：杨治华 石瑜琳 冉宇靓 王贵齐 刘 军 董志伟
单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所，北京100021
关键词：VEGF；单克隆抗体；抑瘤试验
中国免疫学杂志990913 摘 要 目的：为了确定人血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在肿瘤生长及转移中的作用。方法：利用DNA重组技术表达人VEGF，以其为抗原免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术获得14株稳定分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株。结果：ELISA测定所分泌的单抗只与VEGF特异结合，与EGF、FGF、PDGF、TGFα及TNF等均无交叉反应。以豚鼠皮肤血管通透性实验(Miles)、鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验(CAM)及人脐带静脉血管内皮细胞增殖实验(HuVEC)鉴定单抗的中和活性，其中9株具有中和活性。在小鼠自发乳癌肺转移模型中进行的抑瘤试验显示，单抗D11对乳癌原发瘤的抑制率达83.4%，对肺转移的抑制率为71.9%。结论：具有中和活性的VEGF单抗能抑制肿瘤的生长和转移。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392-33
Generation and characterization of monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor 165 and the effect on primary and metastatic tumor growth of breast tumor
YANG Zhi-Hua，SHI Yu-Lin ，RAN Yu-Liang et al.
Cancer Institute, CAMS and PUMC, Beijing 100021
Abstract Objective: Monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor (VEGF) were established and characterized to determine the role of VEGF in tumor and metastasis. Methods: Balb/c mice were immunized with recombinant hVEGF165 and the immunized spleen cells were fused with SP2/0-Ag14. Hybridomas cells secreting anti-VEGF McAbs were screened and characterized by ELISA, Western blot, and RIA. Neutralizing activity of anti-VEGF McAbs were identified by miles permeability assay (Miles), chicken chorioallantoic membranes angiogenesis assay (CAM) and human umbilical vein endothelial cell growth assay (HuVEC). The effect of neutralizing McAb-D11 on tumor growth was determined in IVT2MA-891 mouse model. Results: 14 hybridomas secreting anti-VEGF McAbs were established and 9 of the 14 hybridomas were neutralizing McAbs against hVEGF. Neutralizing McAb-D11 significantly inhibited both primary and metastatic tumor growth of mouse breast .Conclusion: These anti-VEGF McAbs provide a useful tool to study structure of VEGF and the role in tumor angiogenesis. These neutralizing McAbs against-VEGF may be potentially useful for clinical treatment of cancer.
, 百拇医药
Key words Tumor angiogenesis Vascular endothelial growth factor Neutralizing Monoclonal antibody
血管形成即一个微血管床的形成及发展是许多重要生理过程所必需的[1]，其在多种疾病的发生发展中也起着重要的作用[2]。近年来随着血管形成机制的逐渐阐明及各种血管因子的分子克隆，通过阻断血管形成治疗这些疾病的研究引起了广泛的关注。血管形成受多种血管形成因子的调节，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板原生长因子和转化生长因子 [3] 等，其中VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管形成，同时增加血管通透性，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供基质，在肿瘤的生长和转移中发挥较为重要的作用[4]。因此本文用原核表达的人VEGF为抗原研制抗VEGF单抗，并初步探讨了该单抗在肿瘤生长及转移中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂、动物及细胞 PEG4000，HAT， Protein A Sepharose-Fast Flow胶，均为Sigma产品。 胎牛血清为Hyclone产品。125I同位素为New England公司产品。6～8周龄Balb/c小鼠及IVT2MA-891津白II小鼠自发乳癌肺转移模型均由中国医学科学院肿瘤所动物室提供。豚鼠及九日龄鸡胚购自卫生部生物制品研究所。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14为本室保存培养。
1.2 杂交瘤的制备 将含有人VEGF165基因的重组原核表达质粒转化E.coli POP-2136菌，诱导表达，分离，纯化，纯度达95%以上。经Miles、CAM和HuVEC实验鉴定具有生物活性。以此蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠。按常规杂交瘤制备法，获得阳性杂交瘤克隆。应用标准抗鼠抗体以免疫双扩散法进行单抗亚类分析。
, 百拇医药
1.3 腹水的制备及抗体的纯化 按常规方法用Balb/c小鼠制备腹水。属IgG类单抗，用Protein A Sepharose-4B Fast Flow柱纯化；属IgM类单抗，用交联有VEGF165 Sepharose 4B的亲和层析柱(本室自制)纯化。纯化后的单抗经SDS-PAGE胶电泳分析鉴定纯度。
1.4 Western blot分析 复性的VEGF蛋白在15%PAGE胶中分别进行非还原和还原电泳。将电泳分离的样品电转移至Immobilon-p膜上(millipore公司产品)，与纯化的VEGF单抗4℃反应2 h，洗涤后与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温反应2 h，底物显色、漂洗。
1.5 放射免疫竞争抑制实验 用Iodogen法125I标记纯化的VEGF单抗，标记率为90%以上。用纯化的VEGF165抗原包被反应管后，加1×106cpm的125I标记的某一VEGF单抗，再加入过量的(标记抗体的100倍)其余未标记的纯化VEGF单抗，每一浓度的未标记抗体设3个平行管。4℃孵育过夜，洗涤后测cpm值，取其均值。
, 百拇医药
1.6 中和活性测定 HuVEC测定按杨小平法[5]，Miles豚鼠皮肤血管通透性实验[6]加以改进，鸡胚绒毛尿囊膜促血管形成实验(CAM)按参考文献[7]方法进行。
1.7 肿瘤生长及转移动物实验 将IVT2MA-891肿瘤研磨制成单个细胞悬液接种于TA2×165F1小鼠后腿皮下，1×105细胞/只。3 d后随机分组，并给予抗体治疗，每组6只，设抗体治疗组和PBS组。抗体治疗组腹腔注射VEGF单抗D11每只 200 μg/次，每天1次，PBS组每天注射PBS1次，连续20 d。触及肿瘤后，每3天测肿瘤大小。停药5 d后处死动物，称取瘤重并计肺转移结节数。
2 结 果
2.1 重组VEGF165蛋白的表达及生物活性分析 SDS-PAGE胶电泳结果表明pkpl-3b-VEGF165克隆表达分子量为43 kD的同源二聚体VEGF蛋白，目的蛋白表达量占细菌蛋白的30%左右，纯度达95%以上。所表达的VEGF165蛋白使Miles实验呈明显的皮肤蓝斑阳性反应，注射PBS的部位无蓝斑出现，表明注射VEGF抗原可引起局部皮肤血管通透性增加。HuVEC增殖测定和CAM血管形成实验也证实表达的VEGF具有促血管内皮细胞增殖和血管形成的生物活性，以此抗原制备单抗。
, 百拇医药
2.2 VEGF单抗的基本特性 经过3～4轮亚克隆，间接ELISA法筛选出14株分泌VEGF单抗的杂交瘤细胞株，在体外传代3～6个月后抗体分泌仍很稳定。经过反复冻存复苏后的杂交瘤细胞仍持续稳定地分泌抗体。14株杂交瘤的抗体滴度、亚型分析与VEGF抗原结合等特性列于表1。ELISA结果还显示这些单抗只与VEGF165抗原特异结合，与FGF、EGF、PDGF、TGFα、TNF等均无交叉反应。Western blot检测显示14株单抗在原核表达的总蛋白中只在43 kD的目的蛋白带出现单一免疫染色带。单抗中和活性分析显示，14株单抗中有9株1:1稀释的上清能完全抑制VEGF的促血管渗漏活性。1:10稀释的上清也有不同的抑制作用(表1)。CAM实验中能明显诱导血管形成的VEGF抗原量(10 ng)与10 μl 1×106细胞/ml的杂交瘤培养上清共同孵育后，重复CAM实验，9株具有抑制血管渗漏活性的单抗均不同程度地抑制血管形成。3H-TdR掺入法测定结果显示这9株单抗都有抑制HuVEC细胞增殖的作用，且呈剂量依赖关系(资料略)。当抗体量大于10 μg/ml时，各单抗对HuVEC细胞生长的抑制率达60%～85%，其中单抗D11抑制作用最明显，达85%(表1)。
, 百拇医药
表1 VEGF单抗杂交瘤的基本特性
Tab.1 Characteristics of VEGF hybridomas Hybridoma cell line
F2
G8
F7
G1
D7
D11
F3
G5
, 百拇医药
E5
C11
H5
G7
B11
C5
Isotype
IgG2a
IgG2a
IgG2a
IgG2a
, 百拇医药 IgG2a
IgG2a
IgG2a
IgG2a
IgG3
IgG2a
IgG2b
IgM
IgG2a
Binding-titer1)(ELISA)
10 240
20 480
, http://www.100md.com
20 480
20 480
20 480
20 480
10 240
2 560
160
640
160
2 560
160
2 560
Immuno-blot
, 百拇医药
native Ag
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
reduce Ag
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
+
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+
-
Neutralizing activity
Miles
-
-
-
++
++
+++
-
-
++
, http://www.100md.com
++
+++
+++
+++
+++
CAM
ND
ND
ND
+++
++
+++
ND
, 百拇医药 ND
+
+++
+++
++
++
++
HuVEC(%)2)
ND
ND
ND
77
76
, 百拇医药
85
ND
ND
73
66
68
60
63
72
Note:1)Dilution fold of cultured supernatant of hibridomas (1×106cells/ml);2)Inhibitory percentage of the in vitro growth of HuVEC cells induced by VEGF when 20 μg/ml anti-VEGF McAbs were used表2 VEGF单抗D11对小鼠乳癌肺转移灶的影响
, http://www.100md.com
Tab.2 The effect of McAb-D11on metastatic tumors in lung Group
Incidence of
metastasis
No.of metastasis
No.of metastasis
(Size>0.5 mm)
Lung weight
Primary tumor weight
±s
, 百拇医药
Inhibition
(%)±s
Inhibition
(%)±s
Inhibition
(%)±s
Inhibition
(%)
PBS
, 百拇医药
6/6
54.05±14.51
-
15.5±3.35
-
0.45±0.05
-
2.05±0.34
-
McAb-D11
6/6
15.25±2.03
, http://www.100md.com
71.9
0
100.0
0.22±0.05
50.1
0.34±0.13
83.4
P
<0.001
<0.001
<0.005
<0.001
, 百拇医药
图1 VEGF单抗识别不同抗原表位分析
Fig.1 Epitope analysis of anti-VEGF McAb by competitive binding RIA
2.3 单抗识别抗原表位分析 如图1所示，当用125I标记的D11单抗与其他各株未标记单抗进行放射免疫竞争抑制实验时，标记单抗D11与D11、G1、D7、B11、C5，各株单抗的竞争抑制率均在95%以上，与C11、G7的竞争抑制率均低于30%，与H5、E5的竞争抑制率在60%～80%。用125I标记其他各株单抗分别与各株未标记单抗的竞争抑制实验获得了相似的结果(资料略)。
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2.4 单抗D11的抑瘤活性 腹腔注射VEGF单抗D11(200 μg/d)对乳癌原发瘤的生长有明显的抑制作用(图2)。对照组平均于肿瘤细胞接种后6 d触及肿瘤而抗体治疗组迟至12 d，肿瘤生长速度明显慢于对照组(P<0.001)。26 d后处死动物称取瘤重，计肺转移灶数，结果如表2，D11单抗对原发瘤的抑制率达83.4%，对肺转移灶数量及大小的抑制率分别为71.9%和100.0%。
图2 VEGF单抗D11对小鼠乳癌原发瘤生长的影响
Fig.2 The effect of McAb D11on primary tumor growth of murine breast tumors
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3 讨 论
VEGF是一个高度糖基化的碱性蛋白，由于mRNA剪接不同，有VEGF121、165、189和206四种形式[8]。体内以VEGF165最常见，表达最丰富。而且其表达与多种疾病相关，因此本研究用DNA重组技术表达的VEGF165蛋白为抗原研制并获得了14株稳定传代和稳定分泌VEGF单抗的杂交瘤细胞株。其中9株是具有抑制VEGF促HuVEC细胞增殖、血管形成及血管渗漏活性的中和抗体。放射免疫竞争抑制实验分析的结果显示，9株中和抗体至少识别3种不同的抗原表位。Western blot和ELISA检测这些单抗与变性和天然形式VEGF的结合能力显示，14株单抗中5株只能与天然形式的VEGF结合，不能与变性的VEGF结合，表明这些单抗识别的抗原位点是不连续的。另外9株单抗能同时与天然和变性两种形式的VEGF结合，提示它们所识别的抗原位点是连续的。综合放射免疫竞争抑制实验的结果发现， 在识别同一抗原表位的单抗中，有的单抗识别的抗原位点是连续的，如D11、G1、D7、B11、G7等，有的识别的抗原位点是不连续的，如单抗C5 、C11、H5、E5等。VEGF具有促血管内皮细胞增殖、血管形成及血管通透性增加等多种功能。VEGF基因有8个外显子。这种功能的多样性可能是与该抗原的基因结构有关，也许不同外显子表达不同活性的蛋白所致，或者是一种蛋白具有不同的功能活性，本文所获得的这些识别不同抗原表位和表位结构的VEGF单抗，为研究VEGF的结构、功能以及相互关系奠定了重要的基础。有关这方面的研究，目前正在进行。
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最近的研究资料表明，多种肿瘤都高表达VEGF，正常组织极少表达，而且肿瘤组织VEGF的表达水平与肿瘤复发、转移及预后密切相关。Brown等报道VEGF阳性的胃癌病人中50%有肝转移，VEGF阴性者无1例有肝转移[7]。Hoshima报告，VEGF高表达的乳腺癌病人比VEGF表达低的预后差，且与乳腺癌的复发密切相关[9]。本文研制的14株单抗为临床检测分析各种肿瘤VEGF的表达及其与临床复发、转移、预后的关系提供了重要的工具，以期进一步探讨VEGF的表达能否作为肿瘤复发、转移及预后判定的生物指标。
几乎所有实体瘤的生长及转移均依赖于肿瘤血管形成[1]，因此通过阻断肿瘤血管形成可抑制肿瘤的生长和转移。本文用具中和活性的VEGF单抗D11治疗小鼠自发乳癌及肺转移，结果显示该单抗对原发瘤的生长及肺转移形成均有明显的抑制作用，其抑制率分别达83.4%和71.9%。有报道，采用该动物模型接种肿瘤后3 d，分别给予7种不同化疗药物进行治疗，这些化疗药物对原发瘤的抑制率在52%～89%，但对肺转移的抑制率除平阳霉素为42%外，其余6种化疗药物的抑制率均低于30%[10]。显然VEGF单抗抗肿瘤转移的作用优于这些化疗药物。这些资料提示具有中和活性的VEGF单抗在抗肿瘤生长及转移的治疗中有着潜在的应用价值。
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作者简介：杨治华，女，52岁，研究员，博士生导师，主要研究肿瘤免疫
4 参考文献
1 Folkman J, Klaysburn M. Angiogenetic factor. Science, 1987：235-442
2 Kim K J, Bing L, Jane W et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature, 1993;362(29)：841
3 Leung D W, Cacgianes G, Kuang W J et al. Vascular endothelial growth factor in a secreted angiogenic mitogen. Scinece, 1989;241:1306
, 百拇医药
4 Connoly D T, Hauvelman D M, Nelson R et al. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest, 1989;84:1470
5 杨小平，陈国穷，张英珊 et al.人脐静脉内皮细胞培养及形态观察.中国心血管病杂志，1988 ;16(4): 298
6 Miles A A, Miles E M. Vascular reactions to histamine histamine-liberator and leukotaxine in the skin of guinea pigs. J Physiol, 1952; 118: 228
7 Brown L F, Berse B, Jackman R W et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinal tract. Cancer Res, 1993;53: 4727
, http://www.100md.com
8 Tischer E, Mitchell R, Hartma T et al. The human gene for vascular endothelial growth factor multiple protein forms are ecoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991; 266:26031
9 Hoshima T M, Takayanagi S, Tominaga T et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer. J Cancer Res, 1994; 85: 1045
10 高朋根，苏蕴咸，高友春 et al.津白II小鼠自发性乳癌(IVTA2MA-891)高自发肺转移模型.中国医学科学院报，1994；16(2):147
〔收稿日期：1998-03-16 修稿日期：1998-08-24〕, http://www.100md.com
单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所，北京100021
关键词：VEGF；单克隆抗体；抑瘤试验
中国免疫学杂志990913 摘 要 目的：为了确定人血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在肿瘤生长及转移中的作用。方法：利用DNA重组技术表达人VEGF，以其为抗原免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术获得14株稳定分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株。结果：ELISA测定所分泌的单抗只与VEGF特异结合，与EGF、FGF、PDGF、TGFα及TNF等均无交叉反应。以豚鼠皮肤血管通透性实验(Miles)、鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验(CAM)及人脐带静脉血管内皮细胞增殖实验(HuVEC)鉴定单抗的中和活性，其中9株具有中和活性。在小鼠自发乳癌肺转移模型中进行的抑瘤试验显示，单抗D11对乳癌原发瘤的抑制率达83.4%，对肺转移的抑制率为71.9%。结论：具有中和活性的VEGF单抗能抑制肿瘤的生长和转移。
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中国图书分类号 R392-33
Generation and characterization of monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor 165 and the effect on primary and metastatic tumor growth of breast tumor
YANG Zhi-Hua，SHI Yu-Lin ，RAN Yu-Liang et al.
Cancer Institute, CAMS and PUMC, Beijing 100021
Abstract Objective: Monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor (VEGF) were established and characterized to determine the role of VEGF in tumor and metastasis. Methods: Balb/c mice were immunized with recombinant hVEGF165 and the immunized spleen cells were fused with SP2/0-Ag14. Hybridomas cells secreting anti-VEGF McAbs were screened and characterized by ELISA, Western blot, and RIA. Neutralizing activity of anti-VEGF McAbs were identified by miles permeability assay (Miles), chicken chorioallantoic membranes angiogenesis assay (CAM) and human umbilical vein endothelial cell growth assay (HuVEC). The effect of neutralizing McAb-D11 on tumor growth was determined in IVT2MA-891 mouse model. Results: 14 hybridomas secreting anti-VEGF McAbs were established and 9 of the 14 hybridomas were neutralizing McAbs against hVEGF. Neutralizing McAb-D11 significantly inhibited both primary and metastatic tumor growth of mouse breast .Conclusion: These anti-VEGF McAbs provide a useful tool to study structure of VEGF and the role in tumor angiogenesis. These neutralizing McAbs against-VEGF may be potentially useful for clinical treatment of cancer.
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Key words Tumor angiogenesis Vascular endothelial growth factor Neutralizing Monoclonal antibody
血管形成即一个微血管床的形成及发展是许多重要生理过程所必需的[1]，其在多种疾病的发生发展中也起着重要的作用[2]。近年来随着血管形成机制的逐渐阐明及各种血管因子的分子克隆，通过阻断血管形成治疗这些疾病的研究引起了广泛的关注。血管形成受多种血管形成因子的调节，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板原生长因子和转化生长因子 [3] 等，其中VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管形成，同时增加血管通透性，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供基质，在肿瘤的生长和转移中发挥较为重要的作用[4]。因此本文用原核表达的人VEGF为抗原研制抗VEGF单抗，并初步探讨了该单抗在肿瘤生长及转移中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂、动物及细胞 PEG4000，HAT， Protein A Sepharose-Fast Flow胶，均为Sigma产品。 胎牛血清为Hyclone产品。125I同位素为New England公司产品。6～8周龄Balb/c小鼠及IVT2MA-891津白II小鼠自发乳癌肺转移模型均由中国医学科学院肿瘤所动物室提供。豚鼠及九日龄鸡胚购自卫生部生物制品研究所。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14为本室保存培养。
1.2 杂交瘤的制备 将含有人VEGF165基因的重组原核表达质粒转化E.coli POP-2136菌，诱导表达，分离，纯化，纯度达95%以上。经Miles、CAM和HuVEC实验鉴定具有生物活性。以此蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠。按常规杂交瘤制备法，获得阳性杂交瘤克隆。应用标准抗鼠抗体以免疫双扩散法进行单抗亚类分析。
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1.3 腹水的制备及抗体的纯化 按常规方法用Balb/c小鼠制备腹水。属IgG类单抗，用Protein A Sepharose-4B Fast Flow柱纯化；属IgM类单抗，用交联有VEGF165 Sepharose 4B的亲和层析柱(本室自制)纯化。纯化后的单抗经SDS-PAGE胶电泳分析鉴定纯度。
1.4 Western blot分析 复性的VEGF蛋白在15%PAGE胶中分别进行非还原和还原电泳。将电泳分离的样品电转移至Immobilon-p膜上(millipore公司产品)，与纯化的VEGF单抗4℃反应2 h，洗涤后与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温反应2 h，底物显色、漂洗。
1.5 放射免疫竞争抑制实验 用Iodogen法125I标记纯化的VEGF单抗，标记率为90%以上。用纯化的VEGF165抗原包被反应管后，加1×106cpm的125I标记的某一VEGF单抗，再加入过量的(标记抗体的100倍)其余未标记的纯化VEGF单抗，每一浓度的未标记抗体设3个平行管。4℃孵育过夜，洗涤后测cpm值，取其均值。
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1.6 中和活性测定 HuVEC测定按杨小平法[5]，Miles豚鼠皮肤血管通透性实验[6]加以改进，鸡胚绒毛尿囊膜促血管形成实验(CAM)按参考文献[7]方法进行。
1.7 肿瘤生长及转移动物实验 将IVT2MA-891肿瘤研磨制成单个细胞悬液接种于TA2×165F1小鼠后腿皮下，1×105细胞/只。3 d后随机分组，并给予抗体治疗，每组6只，设抗体治疗组和PBS组。抗体治疗组腹腔注射VEGF单抗D11每只 200 μg/次，每天1次，PBS组每天注射PBS1次，连续20 d。触及肿瘤后，每3天测肿瘤大小。停药5 d后处死动物，称取瘤重并计肺转移结节数。
2 结 果
2.1 重组VEGF165蛋白的表达及生物活性分析 SDS-PAGE胶电泳结果表明pkpl-3b-VEGF165克隆表达分子量为43 kD的同源二聚体VEGF蛋白，目的蛋白表达量占细菌蛋白的30%左右，纯度达95%以上。所表达的VEGF165蛋白使Miles实验呈明显的皮肤蓝斑阳性反应，注射PBS的部位无蓝斑出现，表明注射VEGF抗原可引起局部皮肤血管通透性增加。HuVEC增殖测定和CAM血管形成实验也证实表达的VEGF具有促血管内皮细胞增殖和血管形成的生物活性，以此抗原制备单抗。
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2.2 VEGF单抗的基本特性 经过3～4轮亚克隆，间接ELISA法筛选出14株分泌VEGF单抗的杂交瘤细胞株，在体外传代3～6个月后抗体分泌仍很稳定。经过反复冻存复苏后的杂交瘤细胞仍持续稳定地分泌抗体。14株杂交瘤的抗体滴度、亚型分析与VEGF抗原结合等特性列于表1。ELISA结果还显示这些单抗只与VEGF165抗原特异结合，与FGF、EGF、PDGF、TGFα、TNF等均无交叉反应。Western blot检测显示14株单抗在原核表达的总蛋白中只在43 kD的目的蛋白带出现单一免疫染色带。单抗中和活性分析显示，14株单抗中有9株1:1稀释的上清能完全抑制VEGF的促血管渗漏活性。1:10稀释的上清也有不同的抑制作用(表1)。CAM实验中能明显诱导血管形成的VEGF抗原量(10 ng)与10 μl 1×106细胞/ml的杂交瘤培养上清共同孵育后，重复CAM实验，9株具有抑制血管渗漏活性的单抗均不同程度地抑制血管形成。3H-TdR掺入法测定结果显示这9株单抗都有抑制HuVEC细胞增殖的作用，且呈剂量依赖关系(资料略)。当抗体量大于10 μg/ml时，各单抗对HuVEC细胞生长的抑制率达60%～85%，其中单抗D11抑制作用最明显，达85%(表1)。
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表1 VEGF单抗杂交瘤的基本特性
Tab.1 Characteristics of VEGF hybridomas Hybridoma cell line
F2
G8
F7
G1
D7
D11
F3
G5
, 百拇医药
E5
C11
H5
G7
B11
C5
Isotype
IgG2a
IgG2a
IgG2a
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, 百拇医药 IgG2a
IgG2a
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IgG3
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Binding-titer1)(ELISA)
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Immuno-blot
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native Ag
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ND
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Note:1)Dilution fold of cultured supernatant of hibridomas (1×106cells/ml);2)Inhibitory percentage of the in vitro growth of HuVEC cells induced by VEGF when 20 μg/ml anti-VEGF McAbs were used表2 VEGF单抗D11对小鼠乳癌肺转移灶的影响
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Tab.2 The effect of McAb-D11on metastatic tumors in lung Group
Incidence of
metastasis
No.of metastasis
No.of metastasis
(Size>0.5 mm)
Lung weight
Primary tumor weight
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Inhibition
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(%)
±sInhibition
(%)
±sInhibition
(%)
PBS
, 百拇医药
6/6
54.05±14.51
-
15.5±3.35
-
0.45±0.05
-
2.05±0.34
-
McAb-D11
6/6
15.25±2.03
, http://www.100md.com
71.9
0
100.0
0.22±0.05
50.1
0.34±0.13
83.4
P
<0.001
<0.001
<0.005
<0.001
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图1 VEGF单抗识别不同抗原表位分析
Fig.1 Epitope analysis of anti-VEGF McAb by competitive binding RIA
2.3 单抗识别抗原表位分析 如图1所示，当用125I标记的D11单抗与其他各株未标记单抗进行放射免疫竞争抑制实验时，标记单抗D11与D11、G1、D7、B11、C5，各株单抗的竞争抑制率均在95%以上，与C11、G7的竞争抑制率均低于30%，与H5、E5的竞争抑制率在60%～80%。用125I标记其他各株单抗分别与各株未标记单抗的竞争抑制实验获得了相似的结果(资料略)。
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2.4 单抗D11的抑瘤活性 腹腔注射VEGF单抗D11(200 μg/d)对乳癌原发瘤的生长有明显的抑制作用(图2)。对照组平均于肿瘤细胞接种后6 d触及肿瘤而抗体治疗组迟至12 d，肿瘤生长速度明显慢于对照组(P<0.001)。26 d后处死动物称取瘤重，计肺转移灶数，结果如表2，D11单抗对原发瘤的抑制率达83.4%，对肺转移灶数量及大小的抑制率分别为71.9%和100.0%。
图2 VEGF单抗D11对小鼠乳癌原发瘤生长的影响
Fig.2 The effect of McAb D11on primary tumor growth of murine breast tumors
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3 讨 论
VEGF是一个高度糖基化的碱性蛋白，由于mRNA剪接不同，有VEGF121、165、189和206四种形式[8]。体内以VEGF165最常见，表达最丰富。而且其表达与多种疾病相关，因此本研究用DNA重组技术表达的VEGF165蛋白为抗原研制并获得了14株稳定传代和稳定分泌VEGF单抗的杂交瘤细胞株。其中9株是具有抑制VEGF促HuVEC细胞增殖、血管形成及血管渗漏活性的中和抗体。放射免疫竞争抑制实验分析的结果显示，9株中和抗体至少识别3种不同的抗原表位。Western blot和ELISA检测这些单抗与变性和天然形式VEGF的结合能力显示，14株单抗中5株只能与天然形式的VEGF结合，不能与变性的VEGF结合，表明这些单抗识别的抗原位点是不连续的。另外9株单抗能同时与天然和变性两种形式的VEGF结合，提示它们所识别的抗原位点是连续的。综合放射免疫竞争抑制实验的结果发现， 在识别同一抗原表位的单抗中，有的单抗识别的抗原位点是连续的，如D11、G1、D7、B11、G7等，有的识别的抗原位点是不连续的，如单抗C5 、C11、H5、E5等。VEGF具有促血管内皮细胞增殖、血管形成及血管通透性增加等多种功能。VEGF基因有8个外显子。这种功能的多样性可能是与该抗原的基因结构有关，也许不同外显子表达不同活性的蛋白所致，或者是一种蛋白具有不同的功能活性，本文所获得的这些识别不同抗原表位和表位结构的VEGF单抗，为研究VEGF的结构、功能以及相互关系奠定了重要的基础。有关这方面的研究，目前正在进行。
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最近的研究资料表明，多种肿瘤都高表达VEGF，正常组织极少表达，而且肿瘤组织VEGF的表达水平与肿瘤复发、转移及预后密切相关。Brown等报道VEGF阳性的胃癌病人中50%有肝转移，VEGF阴性者无1例有肝转移[7]。Hoshima报告，VEGF高表达的乳腺癌病人比VEGF表达低的预后差，且与乳腺癌的复发密切相关[9]。本文研制的14株单抗为临床检测分析各种肿瘤VEGF的表达及其与临床复发、转移、预后的关系提供了重要的工具，以期进一步探讨VEGF的表达能否作为肿瘤复发、转移及预后判定的生物指标。
几乎所有实体瘤的生长及转移均依赖于肿瘤血管形成[1]，因此通过阻断肿瘤血管形成可抑制肿瘤的生长和转移。本文用具中和活性的VEGF单抗D11治疗小鼠自发乳癌及肺转移，结果显示该单抗对原发瘤的生长及肺转移形成均有明显的抑制作用，其抑制率分别达83.4%和71.9%。有报道，采用该动物模型接种肿瘤后3 d，分别给予7种不同化疗药物进行治疗，这些化疗药物对原发瘤的抑制率在52%～89%，但对肺转移的抑制率除平阳霉素为42%外，其余6种化疗药物的抑制率均低于30%[10]。显然VEGF单抗抗肿瘤转移的作用优于这些化疗药物。这些资料提示具有中和活性的VEGF单抗在抗肿瘤生长及转移的治疗中有着潜在的应用价值。
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作者简介：杨治华，女，52岁，研究员，博士生导师，主要研究肿瘤免疫
4 参考文献
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6 Miles A A, Miles E M. Vascular reactions to histamine histamine-liberator and leukotaxine in the skin of guinea pigs. J Physiol, 1952; 118: 228
7 Brown L F, Berse B, Jackman R W et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinal tract. Cancer Res, 1993;53: 4727
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8 Tischer E, Mitchell R, Hartma T et al. The human gene for vascular endothelial growth factor multiple protein forms are ecoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991; 266:26031
9 Hoshima T M, Takayanagi S, Tominaga T et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer. J Cancer Res, 1994; 85: 1045
10 高朋根，苏蕴咸，高友春 et al.津白II小鼠自发性乳癌(IVTA2MA-891)高自发肺转移模型.中国医学科学院报，1994；16(2):147
〔收稿日期：1998-03-16 修稿日期：1998-08-24〕, http://www.100md.com