琼脂集落形成实验检测造血生长因子集落刺激活性方法的改进①
作者：孙 凯 金伯泉 张新海 冯 琦 朱华峰
单位：孙 凯 第四军医大学西京医院肝胆外科，西安710032)；金伯泉 张新海 第四军医大学免疫学教研室，西安710032；冯 琦 朱华峰 西京医院血液内科，西安710032
关键词：造血生长因子；集落形成实验；方法
中国免疫学杂志990909 摘 要 目的：改进经典的集落形成实验，使造血生长因子集落刺激活性的检测方法更加简便易行。方法：在24孔板中培养，采用琼脂半固体培养，根据培养体系中细胞因子的不同适合于多种造血因子集落刺激活性的检测。固定制片后适于多种染色并可长期保存。结果：经实验及应用证实本文介绍的方法能准确地反映造血生长因子的集落刺激活性，方法简便易行。结论：在研究造血及造血生长因子生物学活性时，经典的集落形成实验由于实验方法复杂而受到限制，本法使造血因子集落刺激活性的检测更加方便。
, 百拇医药
中国图书分类号 R577.1
Improved colony forming experiments: an easily method in detection of hematopoietic factors
SUN Kai, JIN Bo-Quan, ZHANG Xin-Hai et al.
Department of Hepatobiliary, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Objective: In order to improve the traditional colony forming experiment and made it more convenient for testing of hematopoietic factor. Methods: The improved colony forming experiment was performed in 24 well culture plate by semi-solid agar culture system. And it could be used in testing of different hematopoietic factor colony-stimulating activity. Results: This method was proved to be available, easily and useful by different expreiment and application in our laboratory. Conclusion: Method introduced in this paper made it easier to test colony-forming ablility compared with traditional method.
, 百拇医药
Key words Hematopoietic factor Colony forming experiment Method
造血生长因子是一类主要作用于造血系统的细胞因子的总称。造血细胞的存活、增殖及分化离不开造血微环境中的造血生长因子。因此，在研究造血过程时，对造血生长因子的检测是必不可少的。集落形成实验同ELISA及细胞增殖实验相比较，不但能反映细胞因子水平，还能反应不同生长因子对集落形成类别的影响。我们经过摸索，使经典琼脂集落形成实验方法更加简便易行[1，2]。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI 1640培养液、淋巴细胞分离液、1.2%(W/V)琼脂、胎牛血清(FCS)、3%戊二醛固定液、Hank′s液、瑞氏-吉姆萨染液等。实验动物为8～12周龄Balb/c小鼠。
1.2 骨髓单个核细胞的制备 Balb/c小鼠，拉颈处死，无菌取股骨，剪去股骨两端，用4号针头，吸5 ml RPMI 1640洗液反复冲洗骨髓腔。收集细胞悬液用4号针头过滤以制备单细胞悬液。而后用RPMI 1640洗涤1遍，2 000 r/min离心10 min。细胞重悬于4 ml RPMI 1640中，沿管壁缓慢加入装有4 ml淋巴细胞分离液的10 ml离心管中，2 000 r/min离心15 min。用弯头吸管小心吸取界面处富含单个核细胞层，用RPMI 1640 洗液再洗涤1遍，悬于20%FCS RPMI 1640培养基中置塑料培养瓶中，在37℃、5%CO2孵箱中培养2 h，回收悬浮单个核细胞备用。
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1.3 软琼脂集落形成实验 1.2%琼脂加热溶化，置46℃水浴中备用。计数已制备的骨髓单个核细胞，悬于40℃预热的40%FCS RPMI 1640培养基中，24孔培养板中每孔加325 μl上述细胞悬液(含细胞1×105)，加入待检样品50 μl，混匀。吸取预热的1.2%琼脂125 μl，轻柔而迅速地与上述细胞悬液和待检样品混合液于24孔板中混匀，注意勿产生气泡。自然凝固后，置37℃、5% CO2孵箱中培养，至8～10 d后，于倒置显微镜下观察。
1.4 标本的固定、制片及染色 24孔板中加入Hank′s液，室温放置15 min。小心吸去Hank′s液，加入3%戊二醛固定液覆盖琼脂层，室温固定10 min，吸去固定液，将24孔板轻轻放入蒸馏水中浸没(防止水流将琼脂层冲出)，除去盐和固定液。轻轻取出软琼脂层，置于载玻片上，用预先湿润的醋酸纤维素膜或少纤维滤纸覆盖其上，待室温自然干燥后，用蒸馏水湿润覆盖其上的纤维素膜后，将纤维素膜轻轻揭去，完成制片。平放玻片，滴加瑞氏-吉姆萨染液5～8滴，染色1 min。滴加磷酸盐缓冲液5～12滴，染色15 min，放置低倍镜下观察，如染色适度，核浆染色分明，即可以流水冲洗。干燥后镜检。
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1.5 集落鉴定、计数 镜下可根据典型的形态学特征鉴定GM-CFU，E-CFU和M-CFU，50个细胞以上确认为一个GM-CFU。4个以上聚集的巨核细胞确认为一个M-CFU，集落中含有2个或2个以上不同系造血细胞时确认为混合集落(Mix-CFU，包括GMM-CFU，GEMM-CFU)，巨核细胞集落可用乙酰胆碱酯酶染色确定。
2 结 果
我们将这种改进的方法应用于造血因子的生物学活性测定及造血调节的研究中，证实这种方法是简单，易行，可靠的[3，4]。培育5 d后即可在倒置显微镜下对集落生长做初步的观察；培育10 d后，在倒置显微镜下可以观察到多种典型集落形成。经固定制片后，可以经瑞氏-吉姆萨染色或乙酰胆碱酯酶染色对集落的性质进行进一步的鉴定(见图1及图2)。
图1 倒置显微镜下集落生长情况(第10天，200×)
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Fig.1 Colony observed under reverse-phase microscope(10th day,200×)
图2 瑞氏-吉姆萨染色后光镜下观察(40×)
Fig.2 Colony observed under microscope after Giemsa stain(40×)
3 讨 论
同传统的琼脂集落实验相比，本文介绍的方法有如下几个优点：①不需特殊的器材和设备，培养体积小，易于操作。②制片方法简单，可长期保存，封片保存效果更佳。③固定后的玻片适合于多种染色，效果好，易于计数。④易于对集落进行鉴定：在瑞氏-吉姆萨染色方法下即可辨识GM-CSF，E-CSF，M-CSF及Mix-CSF。也可通过特异性染色方法鉴定。⑤检测多能或定向造血生长因子可直接采用本法。在加入亚适剂量的IL-3或其替代物的情况下，可以检测其它与IL-3有协同作用的造血生长因子。⑥此方法适用于人及小鼠的实验系统，除反映造血生长因子的活性外，还可反映不同患者骨髓造血干细胞对造血生长因子的反应性，以指导临床治疗。本文介绍的琼脂集落形成实验为实验室及临床检测造血生长因子的活性提供了一种简便易行的实验方法。
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①国家自然科学基金资助项目(39700065)
作者简介：孙 凯，男，29岁，讲师，主治医师，主要从事肿瘤的基础与临床研究
4 参考文献
1 Du X X, Neben T, Goldan S et al. Effects of recombinat human interleukin-Ⅱ on hematopoietic reconstitution in transplant mice: acceleration of recovery of peripheral blood neutrophils and platelets. Blood, 1993;81:27
2 Sydney E S,Ronald N B. Preparation of permantent slides of intactsoft-agar colony cultures of hematopoietic and tumor cells. Can Res, 1979;39:1133
3 孙 凯，金伯泉，朱 勇 et al. 重组IL-Ⅱ对小鼠骨髓集落形成的影响.单克隆抗体通讯，1995；11(1)：31
4 张新海，金伯泉，孙 凯 et al. rHuIL-3 mAb在rHuIL-3促人骨髓干细胞集落形成中的中和作用.细胞与分子免疫学，1996；12(2)：42
〔收稿日期：1998-07-20 修稿日期：1999-04-27〕, http://www.100md.com
单位：孙 凯 第四军医大学西京医院肝胆外科，西安710032)；金伯泉 张新海 第四军医大学免疫学教研室，西安710032；冯 琦 朱华峰 西京医院血液内科，西安710032
关键词：造血生长因子；集落形成实验；方法
中国免疫学杂志990909 摘 要 目的：改进经典的集落形成实验，使造血生长因子集落刺激活性的检测方法更加简便易行。方法：在24孔板中培养，采用琼脂半固体培养，根据培养体系中细胞因子的不同适合于多种造血因子集落刺激活性的检测。固定制片后适于多种染色并可长期保存。结果：经实验及应用证实本文介绍的方法能准确地反映造血生长因子的集落刺激活性，方法简便易行。结论：在研究造血及造血生长因子生物学活性时，经典的集落形成实验由于实验方法复杂而受到限制，本法使造血因子集落刺激活性的检测更加方便。
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中国图书分类号 R577.1
Improved colony forming experiments: an easily method in detection of hematopoietic factors
SUN Kai, JIN Bo-Quan, ZHANG Xin-Hai et al.
Department of Hepatobiliary, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Objective: In order to improve the traditional colony forming experiment and made it more convenient for testing of hematopoietic factor. Methods: The improved colony forming experiment was performed in 24 well culture plate by semi-solid agar culture system. And it could be used in testing of different hematopoietic factor colony-stimulating activity. Results: This method was proved to be available, easily and useful by different expreiment and application in our laboratory. Conclusion: Method introduced in this paper made it easier to test colony-forming ablility compared with traditional method.
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Key words Hematopoietic factor Colony forming experiment Method
造血生长因子是一类主要作用于造血系统的细胞因子的总称。造血细胞的存活、增殖及分化离不开造血微环境中的造血生长因子。因此，在研究造血过程时，对造血生长因子的检测是必不可少的。集落形成实验同ELISA及细胞增殖实验相比较，不但能反映细胞因子水平，还能反应不同生长因子对集落形成类别的影响。我们经过摸索，使经典琼脂集落形成实验方法更加简便易行[1，2]。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI 1640培养液、淋巴细胞分离液、1.2%(W/V)琼脂、胎牛血清(FCS)、3%戊二醛固定液、Hank′s液、瑞氏-吉姆萨染液等。实验动物为8～12周龄Balb/c小鼠。
1.2 骨髓单个核细胞的制备 Balb/c小鼠，拉颈处死，无菌取股骨，剪去股骨两端，用4号针头，吸5 ml RPMI 1640洗液反复冲洗骨髓腔。收集细胞悬液用4号针头过滤以制备单细胞悬液。而后用RPMI 1640洗涤1遍，2 000 r/min离心10 min。细胞重悬于4 ml RPMI 1640中，沿管壁缓慢加入装有4 ml淋巴细胞分离液的10 ml离心管中，2 000 r/min离心15 min。用弯头吸管小心吸取界面处富含单个核细胞层，用RPMI 1640 洗液再洗涤1遍，悬于20%FCS RPMI 1640培养基中置塑料培养瓶中，在37℃、5%CO2孵箱中培养2 h，回收悬浮单个核细胞备用。
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1.3 软琼脂集落形成实验 1.2%琼脂加热溶化，置46℃水浴中备用。计数已制备的骨髓单个核细胞，悬于40℃预热的40%FCS RPMI 1640培养基中，24孔培养板中每孔加325 μl上述细胞悬液(含细胞1×105)，加入待检样品50 μl，混匀。吸取预热的1.2%琼脂125 μl，轻柔而迅速地与上述细胞悬液和待检样品混合液于24孔板中混匀，注意勿产生气泡。自然凝固后，置37℃、5% CO2孵箱中培养，至8～10 d后，于倒置显微镜下观察。
1.4 标本的固定、制片及染色 24孔板中加入Hank′s液，室温放置15 min。小心吸去Hank′s液，加入3%戊二醛固定液覆盖琼脂层，室温固定10 min，吸去固定液，将24孔板轻轻放入蒸馏水中浸没(防止水流将琼脂层冲出)，除去盐和固定液。轻轻取出软琼脂层，置于载玻片上，用预先湿润的醋酸纤维素膜或少纤维滤纸覆盖其上，待室温自然干燥后，用蒸馏水湿润覆盖其上的纤维素膜后，将纤维素膜轻轻揭去，完成制片。平放玻片，滴加瑞氏-吉姆萨染液5～8滴，染色1 min。滴加磷酸盐缓冲液5～12滴，染色15 min，放置低倍镜下观察，如染色适度，核浆染色分明，即可以流水冲洗。干燥后镜检。
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1.5 集落鉴定、计数 镜下可根据典型的形态学特征鉴定GM-CFU，E-CFU和M-CFU，50个细胞以上确认为一个GM-CFU。4个以上聚集的巨核细胞确认为一个M-CFU，集落中含有2个或2个以上不同系造血细胞时确认为混合集落(Mix-CFU，包括GMM-CFU，GEMM-CFU)，巨核细胞集落可用乙酰胆碱酯酶染色确定。
2 结 果
我们将这种改进的方法应用于造血因子的生物学活性测定及造血调节的研究中，证实这种方法是简单，易行，可靠的[3，4]。培育5 d后即可在倒置显微镜下对集落生长做初步的观察；培育10 d后，在倒置显微镜下可以观察到多种典型集落形成。经固定制片后，可以经瑞氏-吉姆萨染色或乙酰胆碱酯酶染色对集落的性质进行进一步的鉴定(见图1及图2)。
图1 倒置显微镜下集落生长情况(第10天，200×)
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Fig.1 Colony observed under reverse-phase microscope(10th day,200×)
图2 瑞氏-吉姆萨染色后光镜下观察(40×)
Fig.2 Colony observed under microscope after Giemsa stain(40×)
3 讨 论
同传统的琼脂集落实验相比，本文介绍的方法有如下几个优点：①不需特殊的器材和设备，培养体积小，易于操作。②制片方法简单，可长期保存，封片保存效果更佳。③固定后的玻片适合于多种染色，效果好，易于计数。④易于对集落进行鉴定：在瑞氏-吉姆萨染色方法下即可辨识GM-CSF，E-CSF，M-CSF及Mix-CSF。也可通过特异性染色方法鉴定。⑤检测多能或定向造血生长因子可直接采用本法。在加入亚适剂量的IL-3或其替代物的情况下，可以检测其它与IL-3有协同作用的造血生长因子。⑥此方法适用于人及小鼠的实验系统，除反映造血生长因子的活性外，还可反映不同患者骨髓造血干细胞对造血生长因子的反应性，以指导临床治疗。本文介绍的琼脂集落形成实验为实验室及临床检测造血生长因子的活性提供了一种简便易行的实验方法。
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①国家自然科学基金资助项目(39700065)
作者简介：孙 凯，男，29岁，讲师，主治医师，主要从事肿瘤的基础与临床研究
4 参考文献
1 Du X X, Neben T, Goldan S et al. Effects of recombinat human interleukin-Ⅱ on hematopoietic reconstitution in transplant mice: acceleration of recovery of peripheral blood neutrophils and platelets. Blood, 1993;81:27
2 Sydney E S,Ronald N B. Preparation of permantent slides of intactsoft-agar colony cultures of hematopoietic and tumor cells. Can Res, 1979;39:1133
3 孙 凯，金伯泉，朱 勇 et al. 重组IL-Ⅱ对小鼠骨髓集落形成的影响.单克隆抗体通讯，1995；11(1)：31
4 张新海，金伯泉，孙 凯 et al. rHuIL-3 mAb在rHuIL-3促人骨髓干细胞集落形成中的中和作用.细胞与分子免疫学，1996；12(2)：42
〔收稿日期：1998-07-20 修稿日期：1999-04-27〕, http://www.100md.com