体外同种异体细胞刺激诱导出免疫抑制①
作者：富赛里 沈天伟 陆佩华 林其德 吕彩君
单位：富赛里 沈天伟 陆佩华 (上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海200025)；林其德 吕彩君 (上海第二医科大学附属仁济医院，上海200001)
关键词：主动免疫治疗；习惯性流产；免疫抑制
中国免疫学杂志990918 摘 要 目的：观察习惯性流产患者接受主动免疫治疗后免疫反应性的变化。方法：采用改良的体外混合淋巴细胞培养(MLC)模拟临床主动免疫治疗，刺激后的患者淋巴细胞的反应能力用ConA检测。结果：经患者丈夫单核细胞刺激后的患者淋巴细胞对ConA的反应能力显著下降，与未经刺激的细胞相比，P<0.001。同时，患者夫妇的MLC上清对无关个体间的MLC具有抑制作用，抑制率为36.7%。结论：表明同种异体细胞的刺激能诱导出免疫抑制，这一结果与临床习惯性流产患者主动免疫治疗的结果相一致。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.11
Immunosuppressions induced by the stimulations of allo-mononuclear cells in vitro
FU Sai-Li,SHEN Tian-Wei,LU Pei-Hua et al.
Shanghai Institute of Immunology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025
Abstract Objective:To observe the immune reactivities of patients with recurrent spontaneous abortions after immunotherapy.Methods:An improved mixed lymphocyte culture (MLC) was adopted to mimic the clinical immunotherapy. The reactivities of the patient′s lymphocytes after stimulated were tested with ConA.Results:The reactivities of patient′s lymphocytes to ConA were turned down significantly (P<0.001) after stimulated by their husband′s monocytes.And the MLC of unrelated donors could be inhibited by the supernate of MLC of patient′s couples.The suppressive rate was 36.7%.Conclusion:These results indicated that immunosuppression could be induced by the stimulations of allo-mononuclear cells.It coincided with the results of clinical immunotherapy of patients with recurrent spontaneous abortions.
, 百拇医药
Key words Immunotherapy Recurrent spontaneous abortion Immunosuppression
临床上采用丈夫或无关个体的淋巴细胞作主动免疫，治疗原因不明性习惯性流产，取得了良好的临床效果。近年来正被更多的人所认可和接受，与此同时，主动免疫治疗的机理亦越来越成为研究者关注的热点。本实验采用改良的混合淋巴细胞培养(MLC)，可以将反应细胞和刺激细胞分离。从而有可能通过体外MLC模拟体内主动免疫治疗，观察患者淋巴细胞受丈夫细胞刺激后所发生的变化。
1 材料与方法
1.1 研究对象 原因不明性习惯性流产患者由上海第二医科大学附属仁济医院妇产科提供，均为流产3次或3次以上，同时无死胎、死产及活产史，并排除其他常见病因的流产患者。
1.2 改良的MLC 用粘附的方法获取患者丈夫的单核细胞作为刺激细胞，患者的淋巴细胞作为反应细胞进行微量单向MLC试验[1]。具体方法是：用淋巴细胞分离液分离患者及其丈夫的外周血淋巴细胞(内含单核细胞)分别悬浮于含20%正常男性AB血清的RPMI1640培养液中，同时调节细胞浓度至1ⅹ106 ml-1，然后取患者丈夫淋巴细胞，以200 μl/孔的液量加入96孔培养板，经37℃5%CO2环境中培养2 h，单核细胞便粘附于孔底，吸弃上清，用纯RPMI1640液洗3次去除非粘附细胞后，加上患者的淋巴细胞100 μl/孔，于37℃5%CO2环境中培养6 d或2 h，然后吸出患者淋巴细胞备用。对照细胞在同样的培养液中单独培养6 d或2 h后吸出备用。
, http://www.100md.com
1.3 ConA淋转试验 取经丈夫单核细胞刺激过的患者淋巴细胞和患者对照淋巴细胞各1ⅹ105，分别加人ConA 5 μg，在200 μl含20%小牛血清的RPMI1640培养液中于37℃5%CO2环境中培养3 d。阴性对照为上述两种细胞不加ConA分别培养，所有实验组均设3复孔，培养终止前16 h，每孔加3H-TdR 1 μCi，然后收集细胞，测定并计算平均cpm值，最后结果以刺激指数SI
表示。
1.4 MLC上清抑制试验 取患者淋巴细胞为反应细胞，患者丈夫淋巴细胞经60Co 3 000 rad 照射后作刺激细胞，两者混合(各5ⅹ104)于含20%AB血清的RPMI1640(100 μl)培养液中，37℃5%CO2环境培养，6 d以后取其上清，以20 μl/孔的液量加至无关个体间的MLC，观察后者MLC的反应强度变化，并按下式计算上清抑制率。阴性对照为无关个体反应细胞加培养液。
, 百拇医药
上清抑制率=
2 结 果
2.1 患者淋巴细胞经丈夫单核细胞刺激后对ConA的反应 本实验在体外以丈夫单核细胞刺激患者淋巴细胞模拟临床上主动免疫治疗(治疗组)，用RPMI1640培养的患者淋巴细胞作阴性对照模拟未治疗组，然后观察二者对ConA的反应。表1结果显示：预先用丈夫单核细胞刺激患者细胞，无论培养6 d还是2 h，都能降低患者淋巴细胞对ConA的反应，两者与对照组相比均有非常显著的差异(P<0.001)。
表1 患者淋巴细胞经丈夫细胞刺激后对ConA的反应
Tab.1 The reactivities of patients′ lymphocytes to ConA after stimulated by their husbands′ monocytes Lymphocytes
, 百拇医药
of patients
Cultured in
1640 for
6 days
Cultured with
husbands′monocytes
for 6 days
Cultured in
1640 for
2 hours
Cultured with
, http://www.100md.com
husbands′monocytes
for 2 hours
Number
20
20
8
8
Reactivities
to ConA (SI)
10.4±7.1
5.5±3.1
40.1±14.1
, 百拇医药
16.8±9.4
P<0.01
P<0.002
表2 患者夫妇MLC上清对无关个体间MLC的抑制作用
Tab.2 The suppressive effects of superior liquids(SL) of MLC between patients and their husbands MLC of unrelated
donors (No)
Control
(cpm)
MLC
, 百拇医药
(cpm)
MLC in SL
(cpm)
Suppressions
of SL (%)
1
182
9 567
3 638
63.18
2
167
10 219
, http://www.100md.com
5 621
36.79
3
3 443
28 013
17 182
39.52
4
171
14 415
10 021
30.85
5
, http://www.100md.com
664
35 630
18 688
51.25
6
3 989
25 076
18 329
32.00
7
2 166
59 367
41 353
, http://www.100md.com
31.50
8
314
22 003
14 386
35.12
9
922
20 409
13 435
35.79
10
2 912
, 百拇医药
25 124
15 963
41.24
2.2 患者与丈夫MLC上清的抑制作用 用患者淋巴细胞作反应细胞，丈夫淋巴细胞作刺激细胞MLC的上清，加至无关个体的MLC中，可明显地抑制后者MLC反应，40例患者与丈夫MLC上清对无关个体间MLC的抑制率为36.7%±20.0%。表2显示其中10例的反应数据。
3 讨论
早在九十年代初期就有一些实验室发现细胞免疫参与主动免疫诱导的免疫抑制[2]。我们以往的研究结果亦显示了主动免疫治疗在习惯性流产患者中所诱发的免疫抑制现象，即表现为治疗后患者血清出现抑制作用且患者对丈夫和无关个体的MLC强度下降[3]。为了更深入地探讨其发生的机理，本研究通过在体外用丈夫细胞刺激患者淋巴细胞模拟临床上的主动免疫治疗，从而观察到受丈夫细胞刺激后患者淋巴细胞的反应状态，在实验中我们采用丈夫的单核细胞(具有粘附功能且带有大量的MHCⅡ类抗原)作MLC的刺激细胞，由于粘附细胞一般不会增殖，并且经单独培养2 h后已粘附于孔底[1]，所以当它和患者淋巴细胞混合后便很容易将患者淋巴细胞与之分离。本项研究表明患者淋巴细胞经丈夫单核细胞刺激后，其对ConA的反应能力会大大下降。这与我们发现临床上经主动免疫后的患者对其丈夫和无关个体的MLC都显著下降[3]相一致，且体外实验显示，患者淋巴细胞只需脉冲式(2 h)短暂接触丈夫细胞，便可获得足够的信息而改变其反应性。
, 百拇医药
本项研究发现患者和丈夫的MLC上清对无关个体间的MLC有很强的抑制作用，这与我们发现临床上经主动免疫治疗后患者的血清对其与丈夫或无关个体的MLC有很强的抑制作用[3]相一致。表明患者淋巴细胞接受丈夫细胞刺激后确能产生抑制作用。近年来，许多研究者都已注意到抑制性T细胞(CD8+细胞)在维持正常妊娠中所起的重要作用。我们也曾经对流产患者治疗前后的T细胞亚群作过检测，发现经治疗后患者的细胞免疫状态发生了明显改变，表现为CD8+细胞的数量上升，CD4/CD8比例下降[4]，鉴于此点，患者夫妇MLC上清的抑制作用可能来源于CD8+细胞所释放的抑制因子。近年来有一些学者认为TH1和TH2比例失调也是导致流产的原因[5]。研究者认为习惯性流产患者体内TH1细胞占主导地位，因此患者表现为细胞免疫过强，胎儿被排斥，而妊娠成功者往往是TH2占上风。由此推测丈夫细胞的刺激可能促使患者淋巴细胞由TH1向TH2转化。因此MLC上清的抑制作用也可能来源于TH2细胞，故能强有力地抑制细胞免疫。
, 百拇医药
患者淋巴细胞经丈夫细胞刺激后对ConA的反应性下降，也可用上述两种推测来解释，但两种推测究竟哪一种更符合实际还有待进一步研究，测定患者治疗前后TH1和TH2释放的细胞因子，将有助于阐明这一问题。
①本课题受卫生部(NO 94-1-308)资助
作者简介：富赛里，女，40岁，主管技师，主要从事细胞免疫研究；
指导老师，陆佩华，女，52岁，教授，博士生导师，主要从事HLA和免疫遗传方面的研究工作
4 参考文献
1 周光炎，陆佩华，富赛里 et al.短期培养病人外周血淋巴细胞对PHA无反应性及粘附细胞和血清的重建功能.科学通报，1982；27：569
2 Sugi T,Makioo T,Maruyama T et al.A possible mechanism of G immunotherapy for patients with recurrent spontaneous abortions.Am J Reprod Immunol,1991;25:185
, 百拇医药
3 陆佩华，富赛里，黄立东 et al.主动免疫治疗在习惯性流产患者中诱发免疫抑制.中国免疫学杂志，1995；11(4)：237
4 赵爱民，林其德，周涵春 et al.原因不明性习惯性流产患者外周血T淋巴细胞亚群的变化.中华妇产科杂志，1994；29(3)：227
5 Raj Raghupathy.Th1-type immunity is incompatible with successful pregnancy. Immunology,1997;18(10):478
〔收稿日期：1998-09-29 修稿日期：1999-01-29〕
, 百拇医药
单位：富赛里 沈天伟 陆佩华 (上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海200025)；林其德 吕彩君 (上海第二医科大学附属仁济医院，上海200001)
关键词：主动免疫治疗；习惯性流产；免疫抑制
中国免疫学杂志990918 摘 要 目的：观察习惯性流产患者接受主动免疫治疗后免疫反应性的变化。方法：采用改良的体外混合淋巴细胞培养(MLC)模拟临床主动免疫治疗，刺激后的患者淋巴细胞的反应能力用ConA检测。结果：经患者丈夫单核细胞刺激后的患者淋巴细胞对ConA的反应能力显著下降，与未经刺激的细胞相比，P<0.001。同时，患者夫妇的MLC上清对无关个体间的MLC具有抑制作用，抑制率为36.7%。结论：表明同种异体细胞的刺激能诱导出免疫抑制，这一结果与临床习惯性流产患者主动免疫治疗的结果相一致。
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中国图书分类号 R392.11
Immunosuppressions induced by the stimulations of allo-mononuclear cells in vitro
FU Sai-Li,SHEN Tian-Wei,LU Pei-Hua et al.
Shanghai Institute of Immunology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025
Abstract Objective:To observe the immune reactivities of patients with recurrent spontaneous abortions after immunotherapy.Methods:An improved mixed lymphocyte culture (MLC) was adopted to mimic the clinical immunotherapy. The reactivities of the patient′s lymphocytes after stimulated were tested with ConA.Results:The reactivities of patient′s lymphocytes to ConA were turned down significantly (P<0.001) after stimulated by their husband′s monocytes.And the MLC of unrelated donors could be inhibited by the supernate of MLC of patient′s couples.The suppressive rate was 36.7%.Conclusion:These results indicated that immunosuppression could be induced by the stimulations of allo-mononuclear cells.It coincided with the results of clinical immunotherapy of patients with recurrent spontaneous abortions.
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Key words Immunotherapy Recurrent spontaneous abortion Immunosuppression
临床上采用丈夫或无关个体的淋巴细胞作主动免疫，治疗原因不明性习惯性流产，取得了良好的临床效果。近年来正被更多的人所认可和接受，与此同时，主动免疫治疗的机理亦越来越成为研究者关注的热点。本实验采用改良的混合淋巴细胞培养(MLC)，可以将反应细胞和刺激细胞分离。从而有可能通过体外MLC模拟体内主动免疫治疗，观察患者淋巴细胞受丈夫细胞刺激后所发生的变化。
1 材料与方法
1.1 研究对象 原因不明性习惯性流产患者由上海第二医科大学附属仁济医院妇产科提供，均为流产3次或3次以上，同时无死胎、死产及活产史，并排除其他常见病因的流产患者。
1.2 改良的MLC 用粘附的方法获取患者丈夫的单核细胞作为刺激细胞，患者的淋巴细胞作为反应细胞进行微量单向MLC试验[1]。具体方法是：用淋巴细胞分离液分离患者及其丈夫的外周血淋巴细胞(内含单核细胞)分别悬浮于含20%正常男性AB血清的RPMI1640培养液中，同时调节细胞浓度至1ⅹ106 ml-1，然后取患者丈夫淋巴细胞，以200 μl/孔的液量加入96孔培养板，经37℃5%CO2环境中培养2 h，单核细胞便粘附于孔底，吸弃上清，用纯RPMI1640液洗3次去除非粘附细胞后，加上患者的淋巴细胞100 μl/孔，于37℃5%CO2环境中培养6 d或2 h，然后吸出患者淋巴细胞备用。对照细胞在同样的培养液中单独培养6 d或2 h后吸出备用。
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1.3 ConA淋转试验 取经丈夫单核细胞刺激过的患者淋巴细胞和患者对照淋巴细胞各1ⅹ105，分别加人ConA 5 μg，在200 μl含20%小牛血清的RPMI1640培养液中于37℃5%CO2环境中培养3 d。阴性对照为上述两种细胞不加ConA分别培养，所有实验组均设3复孔，培养终止前16 h，每孔加3H-TdR 1 μCi，然后收集细胞，测定并计算平均cpm值，最后结果以刺激指数SI
表示。
1.4 MLC上清抑制试验 取患者淋巴细胞为反应细胞，患者丈夫淋巴细胞经60Co 3 000 rad 照射后作刺激细胞，两者混合(各5ⅹ104)于含20%AB血清的RPMI1640(100 μl)培养液中，37℃5%CO2环境培养，6 d以后取其上清，以20 μl/孔的液量加至无关个体间的MLC，观察后者MLC的反应强度变化，并按下式计算上清抑制率。阴性对照为无关个体反应细胞加培养液。
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上清抑制率=
2 结 果
2.1 患者淋巴细胞经丈夫单核细胞刺激后对ConA的反应 本实验在体外以丈夫单核细胞刺激患者淋巴细胞模拟临床上主动免疫治疗(治疗组)，用RPMI1640培养的患者淋巴细胞作阴性对照模拟未治疗组，然后观察二者对ConA的反应。表1结果显示：预先用丈夫单核细胞刺激患者细胞，无论培养6 d还是2 h，都能降低患者淋巴细胞对ConA的反应，两者与对照组相比均有非常显著的差异(P<0.001)。
表1 患者淋巴细胞经丈夫细胞刺激后对ConA的反应
Tab.1 The reactivities of patients′ lymphocytes to ConA after stimulated by their husbands′ monocytes Lymphocytes
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of patients
Cultured in
1640 for
6 days
Cultured with
husbands′monocytes
for 6 days
Cultured in
1640 for
2 hours
Cultured with
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husbands′monocytes
for 2 hours
Number
20
20
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Reactivities
to ConA (SI)
10.4±7.1
5.5±3.1
40.1±14.1
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16.8±9.4
P<0.01
P<0.002
表2 患者夫妇MLC上清对无关个体间MLC的抑制作用
Tab.2 The suppressive effects of superior liquids(SL) of MLC between patients and their husbands MLC of unrelated
donors (No)
Control
(cpm)
MLC
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(cpm)
MLC in SL
(cpm)
Suppressions
of SL (%)
1
182
9 567
3 638
63.18
2
167
10 219
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5 621
36.79
3
3 443
28 013
17 182
39.52
4
171
14 415
10 021
30.85
5
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664
35 630
18 688
51.25
6
3 989
25 076
18 329
32.00
7
2 166
59 367
41 353
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31.50
8
314
22 003
14 386
35.12
9
922
20 409
13 435
35.79
10
2 912
, 百拇医药
25 124
15 963
41.24
2.2 患者与丈夫MLC上清的抑制作用 用患者淋巴细胞作反应细胞，丈夫淋巴细胞作刺激细胞MLC的上清，加至无关个体的MLC中，可明显地抑制后者MLC反应，40例患者与丈夫MLC上清对无关个体间MLC的抑制率为36.7%±20.0%。表2显示其中10例的反应数据。
3 讨论
早在九十年代初期就有一些实验室发现细胞免疫参与主动免疫诱导的免疫抑制[2]。我们以往的研究结果亦显示了主动免疫治疗在习惯性流产患者中所诱发的免疫抑制现象，即表现为治疗后患者血清出现抑制作用且患者对丈夫和无关个体的MLC强度下降[3]。为了更深入地探讨其发生的机理，本研究通过在体外用丈夫细胞刺激患者淋巴细胞模拟临床上的主动免疫治疗，从而观察到受丈夫细胞刺激后患者淋巴细胞的反应状态，在实验中我们采用丈夫的单核细胞(具有粘附功能且带有大量的MHCⅡ类抗原)作MLC的刺激细胞，由于粘附细胞一般不会增殖，并且经单独培养2 h后已粘附于孔底[1]，所以当它和患者淋巴细胞混合后便很容易将患者淋巴细胞与之分离。本项研究表明患者淋巴细胞经丈夫单核细胞刺激后，其对ConA的反应能力会大大下降。这与我们发现临床上经主动免疫后的患者对其丈夫和无关个体的MLC都显著下降[3]相一致，且体外实验显示，患者淋巴细胞只需脉冲式(2 h)短暂接触丈夫细胞，便可获得足够的信息而改变其反应性。
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本项研究发现患者和丈夫的MLC上清对无关个体间的MLC有很强的抑制作用，这与我们发现临床上经主动免疫治疗后患者的血清对其与丈夫或无关个体的MLC有很强的抑制作用[3]相一致。表明患者淋巴细胞接受丈夫细胞刺激后确能产生抑制作用。近年来，许多研究者都已注意到抑制性T细胞(CD8+细胞)在维持正常妊娠中所起的重要作用。我们也曾经对流产患者治疗前后的T细胞亚群作过检测，发现经治疗后患者的细胞免疫状态发生了明显改变，表现为CD8+细胞的数量上升，CD4/CD8比例下降[4]，鉴于此点，患者夫妇MLC上清的抑制作用可能来源于CD8+细胞所释放的抑制因子。近年来有一些学者认为TH1和TH2比例失调也是导致流产的原因[5]。研究者认为习惯性流产患者体内TH1细胞占主导地位，因此患者表现为细胞免疫过强，胎儿被排斥，而妊娠成功者往往是TH2占上风。由此推测丈夫细胞的刺激可能促使患者淋巴细胞由TH1向TH2转化。因此MLC上清的抑制作用也可能来源于TH2细胞，故能强有力地抑制细胞免疫。
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患者淋巴细胞经丈夫细胞刺激后对ConA的反应性下降，也可用上述两种推测来解释，但两种推测究竟哪一种更符合实际还有待进一步研究，测定患者治疗前后TH1和TH2释放的细胞因子，将有助于阐明这一问题。
①本课题受卫生部(NO 94-1-308)资助
作者简介：富赛里，女，40岁，主管技师，主要从事细胞免疫研究；
指导老师，陆佩华，女，52岁，教授，博士生导师，主要从事HLA和免疫遗传方面的研究工作
4 参考文献
1 周光炎，陆佩华，富赛里 et al.短期培养病人外周血淋巴细胞对PHA无反应性及粘附细胞和血清的重建功能.科学通报，1982；27：569
2 Sugi T,Makioo T,Maruyama T et al.A possible mechanism of G immunotherapy for patients with recurrent spontaneous abortions.Am J Reprod Immunol,1991;25:185
, 百拇医药
3 陆佩华，富赛里，黄立东 et al.主动免疫治疗在习惯性流产患者中诱发免疫抑制.中国免疫学杂志，1995；11(4)：237
4 赵爱民，林其德，周涵春 et al.原因不明性习惯性流产患者外周血T淋巴细胞亚群的变化.中华妇产科杂志，1994；29(3)：227
5 Raj Raghupathy.Th1-type immunity is incompatible with successful pregnancy. Immunology,1997;18(10):478
〔收稿日期：1998-09-29 修稿日期：1999-01-29〕
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