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编号:10258158
血小板活化因子抗体的研制①
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 1999年第11期
     作者:姚新生 孙万邦 李官成

    单位:遵义医学院免疫学教研室,遵义 563003

    关键词:

    中国免疫学杂志991120 中国图书分类号 R392.1

    血小板活化因子(PAF)自发现以来,一直受到广泛的重视,现认为PAF是一种具有激素样广泛生物学活性的物质[1]。关于血小板活化因子抗体的研制,国外有部分实验室有报道,国内少见报道,本文根据血小板活化因子特殊的化学结构,采用2种不同的方法制备出PAF免疫原,经皮下多点和足底加淋巴结2种不同途径注射免疫新西兰白兔和Balb/c小鼠,制备出效价较高、特异性较强的PAF多克隆抗体。

    1 材料与方法

    1.1 材料 PAF纯品、卵磷脂、胆固醇、弗氏完全佐剂(CFA)、甲基化牛血清白蛋白(MBSA)均购自美国Sigma公司;羊抗兔酶标抗体为华美生物工程公司产品;无水乙醇、醋酐等均为国产分析纯试剂;DG-3022A酶标仪为国营华东电子管厂产品;96孔酶标板为DAKA公司产品;新西兰白兔,雄性,体重2.0~2.5 kg,遵义医学院实验动物中心提供;Balb/c小鼠,体重18~22 g,重庆医科大学实验动物中心提供。
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    1.2 方法

    1.2.1 PAF免疫原的制备 参照Nishihira等的方法改良制备PAF1免疫原:取PAF 1.2 mg,卵磷脂12 mg,胆固醇70 mg,加无水乙醇20 ml溶解后,加到80 ml的PBS(20 mol/L,pH7.4)中,充分混合后,4 000 r/min 离心15 min,去上清,于沉淀中加入1%的MBSA 8 ml(MBSA用20 mol/L,pH7.4的含碳二亚胺的PBS溶解)。4℃静置过夜,其间摇匀3次,再加入等体积的CFA,边加边研磨2 h,制备出PAF1免疫原。PAF2免疫原的制备:取PAF 1.2 mg加 2 ml无水乙醇溶解后,加入1%的MBSA溶液8 ml混合(MBSA用20 mol/L,pH7.4的含碳二亚胺的PBS溶解),边加边缓慢搅拌,4℃静置过夜,其间摇匀3次,再加入等体积的CFA,边加边研磨 2 h,同时加入吡啶和醋酐各8μl,制备出PAF2免疫原[2]
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    1.2.2 动物免疫程序 取新西兰白兔12只,Balb/c小鼠6只,每3只动物分一组,分别以PAF1、PAF2免疫动物,免疫途径分皮下和足底加淋巴结注射,足底加淋巴结组在兔疫前10 d以卡介苗(BCG)足底注射刺激淋巴结肿大,鼠单用皮下注射,6组免疫程序均为5次。

    1.2.3 免疫血清效价测定与特异性试验 以双向琼脂扩散试验和ELISA法分别测免疫血清中抗体效价并鉴定其特异性。实验分别设胆固醇、卵磷脂,正常新西兰白兔和正常Balb/c小鼠血清作对照。双向琼脂扩散试验以出现明显的沉淀线时,免疫血清的最大稀释度为抗体的效价,ELISA法以P/N≥2.1时,免疫血清的最大稀释度为抗体的效价。

    2 结果

    2.1 免疫血清的抗体效价 双向琼脂扩散试验测定家兔抗体效价,皮下多点注射组最高为1∶16,足底加淋巴结注射组最高1∶32,小鼠抗体效价最高为1∶8。ELISA测定抗体效价家兔4组最高为1∶10 240,小鼠抗体效价最高为1∶9 600。
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    2.2 抗体的特异性 双向琼脂扩散试验显示免疫血清与PAF出现一条明显的沉淀线,与胆固醇、卵磷脂未出现沉淀线,正常新西兰白兔和正常Balb/c小鼠血清与PAF未出现沉淀线,ELISA试验以P/N≥2.1为阳性,测兔4组免疫血清的特异性,1只免疫血清与PAF孔P/N≥2.1(5.94)。

    3 讨论

    1984年Nishihira等开始对PAF抗体进行研究,以一种混合的免疫原免疫新西兰白兔,制备出PAF抗体[2]。我们参照这种方法改良制备出2种免疫原,同时免疫新西兰白兔和Balb/c小鼠,均制备出PAF抗体。在制备免疫原时,首先考虑到PAF分子量小,免疫原性弱,又不易与其他载体相连接,因而采用混合的抗原与佐剂抗原。PAF1中的卵磷脂与胆固醇有可能是起一种脂质体佐剂的作用[3],PAF也有可能和MBSA在弗氏完全佐剂抗原的包裹下,形成一种有效的免疫原,刺激机体产生抗体;同时PAF于乙醇中溶解后,在与PBS、MBSA、CFA混合中有可能形成两相的双分子层,构成类似于脂质体佐剂的作用,于局部产生缓慢持久的刺激,促使机体合成抗PAF的抗体。同时考虑到PAF的活性基团—乙酰基极不稳定,易被乙酰水解酶水解失去活性[4],在制备PAF2免疫原时,加入了乙酰化试剂,即吡啶和醋酐,以恢复PAF在注射部位被乙酰水解酶水解的乙酰基团,延长其在局部的刺激时间。本研究初步成功,将为进一步研制效价高、特异性好的PAF多克隆抗体和PAF单克隆抗体及探索检测PAF的免疫学方法打下基础。
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    ①本课题受贵州省教委基金资助(91011)

    作者简介:姚新生,男,29岁,硕士生,主要从事免疫生化研究;

    孙万邦,男,48岁,教授,硕士生导师,主要从事分子免疫学研究

    4 参考文献

    1 Benveniste J P,Henson M,Cochrane C G.Leukocyte dependent histamine release from rabbit platelets the role of IgE,basophils,and platelet activating factor.J Exp Med,1972;136:1356

    2 Nishihira J K,Ishibashi T,Imai Y.Production and characteirzation of specific antibodies against PAF.J Bioxhem Tokyo,1984;95(5):124

    3 徐葛林.脂质体用作疫苗佐剂的研究进展.国外医学*预防,诊断,治疗生物制品分册,1996;19(1):10

    4 甘卫华.肾病综合征患儿血浆血小板活化因子、血小板的变化.中华儿科杂志,1995;33(4):212

    收稿1998-05-21 修回1999-06-18, http://www.100md.com