应用包埋前免疫胶体金直接法研究细胞内病毒抗原超微定位
作者：李向群 毛琳 文莉 肖红 杨占秋
单位：湖北医科大学病毒所临床病毒室，武汉 430071
关键词：包埋前免疫胶体金技术；免疫电镜；I型单纯疱疹病毒；病毒抗原
中国免疫学杂志991210 摘 要 目的：探讨细胞内病毒抗原的超微定位的方法。方法：采用包埋前免疫胶体金方法标记I型单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原以研究该病毒在人胚肺细胞(HEL)内的超微定位。结果：发现金颗粒约为5 nm，大小均一，在HSV-1囊膜、内质网膜表面及其邻近区域有大量的金颗粒，而阴性对照在这些地方未见金颗粒。结论：表明包埋前免疫胶体金方法可靠，可用于病毒抗原的超微定位研究。
中国图书分类号 R392-33
The application of preembedding direct immunogold for ultrastructual localization of intracellular antigens of HSV-1
, 百拇医药
LI Xiang-Qun,MAO Lin,WEN Li et al.
Department of Clinical Virology,Institute of Virology Research,Hubei Medical University,Wuhan 430071
Abstract Objective:In order to explore the method for ultrastructual localization of viral intracellular antigens.Methods:The authors established a preembedding direct immunogold method to study the localization of HSV-1 antigens in human embryo lung cell.Results:The immunmoeletronic microscopy show that a lot of SPA-gold particles (diameter about 5 nm)exist in the membrance of HSV-1 envelope and endoplasmic reticulum and the areas adjacent to them ,but no SPA-gold particules exist in the same areas.Conclusion:Those results suggest that the preembedding direct immunogold method is reliable and can be used for ultrastructual localization of viral antigens.
, http://www.100md.com
Key words Preembedding immunogold technique Immunoelectronic microscopy Herpes simplex virus type I Viral antigens
细胞内病毒抗原的定位及检测，不仅可用于病毒鉴定，而且是研究病毒形态发生及病毒致病机理的重要手段，细胞内病毒抗原的定位以往多用免疫荧光法(IF)和过氧化物-抗过氧化物酶法(PAP)。前者不能用于细胞内抗原的超微定位；后者虽能，但由于有显色剂电子密度低在电镜下阳性显色不易与正常细胞结构区别等缺点。为克服上述方法的不足，我们建立了包埋前免疫胶体金直接法标记细胞内病毒抗原方法，且成功地应用于研究I型单纯疱疹病毒抗原的超微定位。
1 材料与方法
1.1 细胞与病毒
1.1.1 人胚肺细胞(HEL) 人胚肺取自人工引产4个月胚胎，按常规制备传代HEL细胞。
, http://www.100md.com
1.1.2 I型单纯疱疹病毒SM44株(HSV-1 SM44) 由美国耶鲁大学医学院熊菊贞教授惠赠。
1.2 氯化金(HAuCl4) 上海试剂一厂产品，批号XK13-0010801064。
1.3 葡萄球菌A蛋白(SPA) 西德Boehringer公司，Cot NO.775177。
1.4 血清 从武汉市七医院产妇血清中筛选出HSV-1阴性血清和HSV-1阳性血清,其免疫荧光效价为1：640。
1.5 5 nm胶体金制备 按Romano方法制备[1]。
1.6 SPA胶体金复合物的制备、纯化和质量鉴定
, http://www.100md.com
1.6.1 SPA与胶体金结合的最适浓度测定 取50 μl SPA(1 mg/0.2 ml)加入硅化的1.5 ml Ep管中用0.005 mol/L NaCl进行倍比稀释，各管加入250 μl胶体金液(pH 6)混匀后再加入250 μl 10% NaCl，用胶体金颜色由红变蓝的EP管的SPA量，计算出稳定1 ml 5 nm胶体需SPA 6 μg。
1.6.2 SPA胶体金复合物的纯化及鉴定 按上述最适浓度将SPA与胶体金混合，加入1%聚乙二醇2000(PEG-2000)使其最终浓度为0.05%，60 000 r/min, 4℃，离心1 h，于透射电镜下摄片鉴定其大小均一性。
1.7 包埋前胶体金标记细胞内抗原的电镜观察 HSV-1 SM44感染HEL细胞12 h，细胞病变至++，用PBS洗3次，橡皮帚刮下细胞，1 500 r/min，离心10 min，细胞沉淀悬浮于0.5 ml 1%多聚甲醛、0.002%皂素、0.025%戊二醛混合液中，4℃ 1 h，PBS洗3次，加1：40稀释的HSV-1阳性血清。室温1 h，PBS洗3次，加1：80稀释的SPA胶体金复合物，室温
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1 h，PBS洗3次后，常规锇酸固定、乙醇脱水、包埋、切片用于透射电镜观察，用阴性血清代替阳性血清作阴性对照。
2 结果
2.1 SPA胶体金均一性及大小鉴定 在电镜下见SPA胶体金呈圆形，单个分散，电子密度高、致密。金颗粒大小基本一致，其直径平均为(5.04±1.14) nm(图1)。
2.2 SPA胶体金直接法标记HSV-1电镜观察 电镜下见HEL细胞膜结构完整，细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒，他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集(图2)。阴性对照电镜下可见细胞膜结构完整，细胞核内有大量未成熟的HSV-1颗粒。细胞浆内有大量成熟的病毒颗粒，但其囊膜上无特异性结合的金颗粒。少量金颗粒透入细胞浆及细胞核内呈随机散在游离性分布(图3)。
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图1 5 nm SPA胶体金电镜观察
Fig.1 Electronic microscopy of 5 nm SPA-immunogold
图2 SPA胶体金标记HSV-1抗原免疫电镜
Fig.2 The immunoelectronic microscopy of SPA-gold labelled HSV-1 antigens
Note:a. the SPA-gold particles conjugatied with the envelope of mature HSV-1；b. the SPA-gold particles conjugated with the envelope of immature HSV-1;c. the SPA-gold particles existed in the membrance of endoplasmic reticulum;d. the areas congregated with SPA-gold particles
, 百拇医药
图3 阴性对照免疫电镜
Fig.3 The immunoelectronic microscopy of negative control
Note:a.immature HSV-1 in nucleus b.mature HSV-1 in cytoplasm c.the scattering free gold particles
3 讨论
自Faulk等建立胶体金免疫电镜技术以来，该方法广泛地应用于细胞内分泌蛋白、多肽、膜结构蛋白、胞浆蛋白等抗原的超微定位研究[2-6]，但用于病毒抗原的研究鲜有报道。上述研究多用包埋后免疫金标记的方法，该方法有非特异性金颗粒较多的不足。我们用皂素处理HEL细胞，在包埋前用自己制备的5 nm SPA胶体金成功地标记了HSV-1抗原，电镜下可清楚地显示HSV-1在形态发生过程中抗原在细胞内的分布，其分布的部位与HSV-1在核内复制，由核膜芽生，经内质网输送至胞浆。成熟释放于胞外的增殖过程及与HSV-1结构蛋白抗原的分布相符。
, 百拇医药
我们在细胞固定时加入皂素的目的是为增加细胞膜结构的通透性，使抗体和SPA金颗粒易于透过细胞膜。皂素的量要适当，其浓度太高有损于细胞膜结构的完整性，且非特异性金颗粒增多，皂素浓度过低影响特异性标记的效果。包埋前免疫金标记排除了包埋和切片过程中对待检抗原的抗原性影响，因而比包埋后金标更真实地反映病毒抗原的分布情况。
总之，我们建立的包埋前胶体金直接法标记细胞内病毒抗原的方法具有简便、经济、特异性好，可用于病毒抗原超微定位，研究病毒抗原的分布、动态变化、定量分析及病毒鉴定。
作者简介：李向群，男，35岁，微生物及免疫学硕士；
指导教师，杨占秋，男，47岁，博士生导师，主要从事病毒免疫学研究
参考文献
1 Romano E L,Stobinskic,Hcghes N C et al.An anti-globulin reagent labelled with colloidal gold for use in electron microscopy.Immunochemistry，1974;11:521
, 百拇医药
2 Faulk W P,Taylor G M.An immunocoloid method for the electron microscope.Immunochemistry，1971;8:1081
3 Bendayan M,Roth J,Perrelet A et al.Quantitative immunocytochemical localization of pancreatic secretory proteins in subcellular compartments of rat acinar cell.J Histochem Cytochem，1980;28:149
4 Ravazzola M, Orcil L.Glucagon and glicentin immunocreactivity are topologically segregated in the grarule of human panereatic A cell.Nature，1980;284:66
, 百拇医药
5 Roth J, Thorens B，Hunziker W et al.Immunocytochemical localization of galactosyltransferase Hela cells:codistribution with thiamine pyrophospha-tase in trans gogicis ternae.J Cell Biol,1984;263:1760
6 Roth J， Thorens B,Hunziker W et al.Vitamin D-dependent calcium binding protein:Immunocytochemical localization in chick kidney.Science,1981;214:197
收稿 1998-10-10 修回 1999-02-01, 百拇医药
单位：湖北医科大学病毒所临床病毒室，武汉 430071
关键词：包埋前免疫胶体金技术；免疫电镜；I型单纯疱疹病毒；病毒抗原
中国免疫学杂志991210 摘 要 目的：探讨细胞内病毒抗原的超微定位的方法。方法：采用包埋前免疫胶体金方法标记I型单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原以研究该病毒在人胚肺细胞(HEL)内的超微定位。结果：发现金颗粒约为5 nm，大小均一，在HSV-1囊膜、内质网膜表面及其邻近区域有大量的金颗粒，而阴性对照在这些地方未见金颗粒。结论：表明包埋前免疫胶体金方法可靠，可用于病毒抗原的超微定位研究。
中国图书分类号 R392-33
The application of preembedding direct immunogold for ultrastructual localization of intracellular antigens of HSV-1
, 百拇医药
LI Xiang-Qun,MAO Lin,WEN Li et al.
Department of Clinical Virology,Institute of Virology Research,Hubei Medical University,Wuhan 430071
Abstract Objective:In order to explore the method for ultrastructual localization of viral intracellular antigens.Methods:The authors established a preembedding direct immunogold method to study the localization of HSV-1 antigens in human embryo lung cell.Results:The immunmoeletronic microscopy show that a lot of SPA-gold particles (diameter about 5 nm)exist in the membrance of HSV-1 envelope and endoplasmic reticulum and the areas adjacent to them ,but no SPA-gold particules exist in the same areas.Conclusion:Those results suggest that the preembedding direct immunogold method is reliable and can be used for ultrastructual localization of viral antigens.
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Key words Preembedding immunogold technique Immunoelectronic microscopy Herpes simplex virus type I Viral antigens
细胞内病毒抗原的定位及检测，不仅可用于病毒鉴定，而且是研究病毒形态发生及病毒致病机理的重要手段，细胞内病毒抗原的定位以往多用免疫荧光法(IF)和过氧化物-抗过氧化物酶法(PAP)。前者不能用于细胞内抗原的超微定位；后者虽能，但由于有显色剂电子密度低在电镜下阳性显色不易与正常细胞结构区别等缺点。为克服上述方法的不足，我们建立了包埋前免疫胶体金直接法标记细胞内病毒抗原方法，且成功地应用于研究I型单纯疱疹病毒抗原的超微定位。
1 材料与方法
1.1 细胞与病毒
1.1.1 人胚肺细胞(HEL) 人胚肺取自人工引产4个月胚胎，按常规制备传代HEL细胞。
, http://www.100md.com
1.1.2 I型单纯疱疹病毒SM44株(HSV-1 SM44) 由美国耶鲁大学医学院熊菊贞教授惠赠。
1.2 氯化金(HAuCl4) 上海试剂一厂产品，批号XK13-0010801064。
1.3 葡萄球菌A蛋白(SPA) 西德Boehringer公司，Cot NO.775177。
1.4 血清 从武汉市七医院产妇血清中筛选出HSV-1阴性血清和HSV-1阳性血清,其免疫荧光效价为1：640。
1.5 5 nm胶体金制备 按Romano方法制备[1]。
1.6 SPA胶体金复合物的制备、纯化和质量鉴定
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1.6.1 SPA与胶体金结合的最适浓度测定 取50 μl SPA(1 mg/0.2 ml)加入硅化的1.5 ml Ep管中用0.005 mol/L NaCl进行倍比稀释，各管加入250 μl胶体金液(pH 6)混匀后再加入250 μl 10% NaCl，用胶体金颜色由红变蓝的EP管的SPA量，计算出稳定1 ml 5 nm胶体需SPA 6 μg。
1.6.2 SPA胶体金复合物的纯化及鉴定 按上述最适浓度将SPA与胶体金混合，加入1%聚乙二醇2000(PEG-2000)使其最终浓度为0.05%，60 000 r/min, 4℃，离心1 h，于透射电镜下摄片鉴定其大小均一性。
1.7 包埋前胶体金标记细胞内抗原的电镜观察 HSV-1 SM44感染HEL细胞12 h，细胞病变至++，用PBS洗3次，橡皮帚刮下细胞，1 500 r/min，离心10 min，细胞沉淀悬浮于0.5 ml 1%多聚甲醛、0.002%皂素、0.025%戊二醛混合液中，4℃ 1 h，PBS洗3次，加1：40稀释的HSV-1阳性血清。室温1 h，PBS洗3次，加1：80稀释的SPA胶体金复合物，室温
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1 h，PBS洗3次后，常规锇酸固定、乙醇脱水、包埋、切片用于透射电镜观察，用阴性血清代替阳性血清作阴性对照。
2 结果
2.1 SPA胶体金均一性及大小鉴定 在电镜下见SPA胶体金呈圆形，单个分散，电子密度高、致密。金颗粒大小基本一致，其直径平均为(5.04±1.14) nm(图1)。
2.2 SPA胶体金直接法标记HSV-1电镜观察 电镜下见HEL细胞膜结构完整，细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒，他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集(图2)。阴性对照电镜下可见细胞膜结构完整，细胞核内有大量未成熟的HSV-1颗粒。细胞浆内有大量成熟的病毒颗粒，但其囊膜上无特异性结合的金颗粒。少量金颗粒透入细胞浆及细胞核内呈随机散在游离性分布(图3)。
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图1 5 nm SPA胶体金电镜观察
Fig.1 Electronic microscopy of 5 nm SPA-immunogold
图2 SPA胶体金标记HSV-1抗原免疫电镜
Fig.2 The immunoelectronic microscopy of SPA-gold labelled HSV-1 antigens
Note:a. the SPA-gold particles conjugatied with the envelope of mature HSV-1；b. the SPA-gold particles conjugated with the envelope of immature HSV-1;c. the SPA-gold particles existed in the membrance of endoplasmic reticulum;d. the areas congregated with SPA-gold particles
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图3 阴性对照免疫电镜
Fig.3 The immunoelectronic microscopy of negative control
Note:a.immature HSV-1 in nucleus b.mature HSV-1 in cytoplasm c.the scattering free gold particles
3 讨论
自Faulk等建立胶体金免疫电镜技术以来，该方法广泛地应用于细胞内分泌蛋白、多肽、膜结构蛋白、胞浆蛋白等抗原的超微定位研究[2-6]，但用于病毒抗原的研究鲜有报道。上述研究多用包埋后免疫金标记的方法，该方法有非特异性金颗粒较多的不足。我们用皂素处理HEL细胞，在包埋前用自己制备的5 nm SPA胶体金成功地标记了HSV-1抗原，电镜下可清楚地显示HSV-1在形态发生过程中抗原在细胞内的分布，其分布的部位与HSV-1在核内复制，由核膜芽生，经内质网输送至胞浆。成熟释放于胞外的增殖过程及与HSV-1结构蛋白抗原的分布相符。
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我们在细胞固定时加入皂素的目的是为增加细胞膜结构的通透性，使抗体和SPA金颗粒易于透过细胞膜。皂素的量要适当，其浓度太高有损于细胞膜结构的完整性，且非特异性金颗粒增多，皂素浓度过低影响特异性标记的效果。包埋前免疫金标记排除了包埋和切片过程中对待检抗原的抗原性影响，因而比包埋后金标更真实地反映病毒抗原的分布情况。
总之，我们建立的包埋前胶体金直接法标记细胞内病毒抗原的方法具有简便、经济、特异性好，可用于病毒抗原超微定位，研究病毒抗原的分布、动态变化、定量分析及病毒鉴定。
作者简介：李向群，男，35岁，微生物及免疫学硕士；
指导教师，杨占秋，男，47岁，博士生导师，主要从事病毒免疫学研究
参考文献
1 Romano E L,Stobinskic,Hcghes N C et al.An anti-globulin reagent labelled with colloidal gold for use in electron microscopy.Immunochemistry，1974;11:521
, 百拇医药
2 Faulk W P,Taylor G M.An immunocoloid method for the electron microscope.Immunochemistry，1971;8:1081
3 Bendayan M,Roth J,Perrelet A et al.Quantitative immunocytochemical localization of pancreatic secretory proteins in subcellular compartments of rat acinar cell.J Histochem Cytochem，1980;28:149
4 Ravazzola M, Orcil L.Glucagon and glicentin immunocreactivity are topologically segregated in the grarule of human panereatic A cell.Nature，1980;284:66
, 百拇医药
5 Roth J, Thorens B，Hunziker W et al.Immunocytochemical localization of galactosyltransferase Hela cells:codistribution with thiamine pyrophospha-tase in trans gogicis ternae.J Cell Biol,1984;263:1760
6 Roth J， Thorens B,Hunziker W et al.Vitamin D-dependent calcium binding protein:Immunocytochemical localization in chick kidney.Science,1981;214:197
收稿 1998-10-10 修回 1999-02-01, 百拇医药