流式细胞术对不同肿瘤细胞表面所表达血小板免疫相关抗原的检测①
作者：张培彤 朴炳奎 裴迎霞 祁鑫
单位：中国中医研究院广安门医院流式细胞仪室，北京100053
关键词：流式细胞术；血小板免疫相关抗原；侵袭和转移，肿瘤；肿瘤细胞系，培养的
中国免疫学杂志991209 摘 要 目的：研究不同肿瘤细胞表面血小板免疫相关抗原的表达。方法：利用流式细胞术观察了PGCL3、PAa、PG-3、PG-3M、MGC803、ESCL、Bel、HCT、KB、A2780、CC801共11种人肿瘤细胞，其中包括二对高低不同转移能力的人肺癌(PGCL3和PAa)和人前列腺癌(PG-3和PG-3M)细胞阳性表达不同血小板免疫相关抗原的细胞数及其肿瘤细胞表面抗原表达的平均荧光强度。结果：11种人肿瘤细胞膜表面均有CD9、CD63、CD42a和TSP等血小板免疫相关抗原不同程度的表达，在MGC803细胞膜表面发现有CD36较强的表达，CD41、CD42b、CD61和CD62均未发现表达。11种人肿瘤细胞系中CD9+、CD42a+、CD63+、TSP+细胞所占的比例各不相同，不同肿瘤细胞系每个抗原阳性细胞抗原表达的荧光强度也不同。与高转移PGCL3和PG-3M细胞相比，CD9在低转移细胞系PAa和PG-3上有较高的表达，CD42a、TSP有相对低的表达。CD42a+和TSP+细胞数和表达强度在高转移PGCL3和PG-3M细胞系均要高于低转移的PAa和PG-3；CD63+细胞数高转移PG-3M细胞系要比低转移的PG-3高很多。结论：结合既往研究，肿瘤细胞表达的血小板免疫相关抗原可能与肿瘤细胞的侵袭转移能力有关。CD42a 、TSP和CD36过度表达可能促进肿瘤细胞的侵袭和转移，CD9和CD63(尤其是CD9)可能起相反的作用。由于MGC803同时表达CD36，它可能是11种肿瘤细胞中侵袭转移能力最强的。
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中国图书分类号 R392.11
Measurement of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on tumor cells surface by flow cytometry
ZHANG Pei-Tong,PIAO Bing-Kui,PEI Ying-Xia et al.
Flow Cytometry Laboratory,Guanganmen Hospital,China Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100053
Abstract Objective：To investigate the expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on various human tumor cells surface. Methods：To measure and compare the expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on 11 human tumor cell lines by flow cytometry. Particularly analyzing the results of two pairs of human pulmonary and prostatic tumor cell lines with low and high metastatic potential respectively. Counting the number and measuring the mean fluorescent intense of the antigen positive cells. Results：The expression of the fluorescent intensity and the number of the positive cells of CD9, CD63, CD42a and TSP on these tumor cell lines were different. MGC803 express CD36 except for CD9, CD63, CD42a and TSP. There were not expression of CD41, CD42b, CD61 and CD62 on 11 tumor cell lines. The positive cell number and fluorescent intensity of CD9 on the tumor cell lines PGCL3 and PG-3M with high metastatic potential is lower than that on PAa and PG-3 with low metastatic potential. The positive cell number and fluorescent intensity of CD42a, TSP, CD36 molecule expressed on PAa and PG-3 cells with low metastatic potential is less than that on PGCL3 and PG-3M. Conclusion：The expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on tumor cells surface relate to the tumor invasion and metastasis. The over expression of CD42a, CD36 and TSP on tumor cell surface may promote tumor invasion and metastasis. CD9 and CD63, especially CD9 inhibit the invasion and metastasis. MGC803 express not only CD42a and TSP, but also CD36, it may have the most powerful invasive behavior among 11 tumor cell lines.
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Key words Flow cytometry Antigen immunologically related to the platelet glycoprotein Invasion and metastasis, neoplasoma Tumor cell line, culture
肿瘤细胞与血小板相互作用是肿瘤发生转移的关键步骤，血小板与肿瘤细胞通过各自浆膜表面表达的糖蛋白受体及其配基的连接作用，促进肿瘤细胞、血小板、内皮细胞、内皮下基质间的相互作用和相互激活，并利用细胞间的相互粘附及其释放的生物活性介质来影响肿瘤细胞的转移过程。我们通过了解不同肿瘤细胞表面表达的与血小板具有共同抗原性的糖蛋白分子，试图解释肿瘤细胞的侵袭转移机理。
1 材料与方法
1.1 材料 IgG1 FITC (679.1Mc7)、IgG1 PE (679.1Mc7)、IgG2a FITC(U7.27)、CD9 FITC (ALB6, IgG1)、CD31 FITC(5.6E,IgG1)、CD36 FITC (FA6.152, IgG1)、TSP PE (P10,IgG1)、CD61 FITC (RUU-PL 7F12，IgG1)、CD41 PE (P2, IgG1)、CD42a FITC(SZ1,IgG2a)、CD42b PE (SZ2,IgG1)、CD63 FITC (CLBGran/12,IgG1)、CD62 PE (CLB Thromb/6, IgG1)。除CD61 FITC来自美国BD公司，其余抗体均来自法国Immunotech公司；RPMI1640来自GIBCO；牛血清白蛋白来自Sigma。人肺巨细胞癌PGCL3 (高转移细胞系)、人肺腺癌PAa (低转移细胞系)、人前列腺癌PG-3M (高转移细胞系)和PG-3 (低转移细胞系)来自北京医科大学基础医学院病理学系；人食管癌ESCL、人肝癌Bel、人结肠癌HCT、人鼻咽癌KB、人卵巢癌A2780来自中国医学科学院药物研究所肿瘤药理研究室；人宫颈癌CC801、人胃癌MGC803来自中国医学科学院基础医学研究所病理研究室。FACSort流式细胞仪为美国BD公司产品。
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1.2 方法 各种肿瘤细胞用0.02% EDTANa2消化，以D-Hank′s液 (pH7.4) 吹打收集细胞，以0.5% 的PBA (PBS牛血清白蛋白) 洗2遍，重悬于0.5%PBA溶液中。以CD41 PE、CD61 FITC、CD42a FITC、CD42b PE、CD36 FITC、TSP PE、CD9 FITC、CD31 FITC、CD62 PE、CD63 FITC按常规方法标记染色，对照管采用IgG1 FITC、IgG2a FITC或IgG1 PE。细胞终浓度为105～106个/ml，抗体浓度为0.2 mg/ml。在室温暗处标记反应30 min后，以0.5% PBA洗1遍，用终浓度0.1%PFA固定，置4℃ 冰箱贮存待测，上机前过200目尼龙筛网，每个试验重复2～3次，每个样品收集104个细胞。另外，还将PGCL3和PAa细胞分别用终浓度为0.1、0.5、1.0 U/ml的凝血酶和2×10-4 mol/L的ATP在37℃刺激20 min，洗2遍，按常规染色，上机测试。
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1.3 流式细胞仪测试条件 FSC电压E-1，增益6.14，线性；SSC电压320，增益1.00，线性；FL1电压400，对数；FL2电压340，对数；激光功率15 mW，激发光波长488 nm。校正机器后，先以前向角和侧向角散射光形成的散点图设定收集门，以固定条件收集样本。每个样品管收集104个肿瘤细胞后进行分析。采用Macintosh Quadra 650计算机和Cell Quest软件收集处理样品数据。
2 结果
2.1 在PGCL3、PAa、PG-3M、PG-3、MGC803、ESCL、Bel、HCT、KB、A2780、CC801等11种肿瘤细胞上均发现有CD9、CD63、CD42a和TSP不同程度的表达，在MGC803上还发现有CD36较强的表达，但其余被检测抗原均未发现表达(见图1)。PGCL3与PAa细胞采用凝血酶及ADP刺激 (凝血酶的刺激可以增加肿瘤细胞CD41的表达[1]，后也未显示CD41、CD42b、CD61、CD36和CD62的表达。
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图1 MGC803 细胞所表达的血小板免疫相关抗原
Fig.1 The expression of antigens (CD9, CD36, CD42a, CD63 and TSP) immunologically related to the platelet glycoproteins on MGC803 (dot line, negative control; real line, MGC803 cells)
2.2 在被研究的11种人肿瘤细胞系中CD9+、CD63+、CD42a+、TSP+细胞的比例各不相同，不同肿瘤细胞系的每个抗原阳性细胞表达的抗原分子数量也不同。在对二组不同转移能力的细胞系，PGCL3/PAa和PG-3M/PG-3的检测中发现，高转移和低转移能力的细胞系在CD9+、CD42a+、CD63+、TSP+细胞的数目上和/或表达的平均荧光强度上有较为明显的不同，高、低转移细胞系各自有其基本类似的趋势，即CD9+细胞在低转移细胞系有较高的表达，CD42a、TSP有相对低的表达；CD63的表达在高低转移能力不同的二对细胞系略有所不同，在低转移细胞系PAa CD63的表达要比高转移细胞系PGCL3低，但低转移PG-3细胞系CD63的表达与高转移细胞系PG-3M差别不大(见图2和图3)。
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图2 PGCL3和PAa细胞血小板免疫相关抗原表达的对比
Fig.2 Comparision of the antigen immunologically related to the platelet glycoproteins between high metastatic potential PGCL3 and low metastatic potential PAa (dot line PAa, real line PGCL3)
图3 PG-3M和PG-3细胞血小板免疫相关抗原表达的对比
Fig.3 Comparision of the antigen immunologically related to the platelet glycoproteins between high metastatic potential PG-3M and low metastatic potential PG-3 (dot line PG-3, real line PG-3M)
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2.3 在阳性细胞的比例上，CD42a+细胞数在高转移的PGCL3和PG-3M细胞系均高于低转移的PAa和PG-3；CD9+细胞数虽然在高转移细胞系PGCL3和PG-3M分别略低于PAa和PG-3，但没有特别明显的差别；TSP+细胞数在高转移细胞系PGCL3和PG-3M分别明显高于低转移的PAa和PG-3细胞系；CD63+细胞的数目在PGCL3和PAa之间没有不同，但在二个前列腺癌细胞系当中，高转移的PG-3M要比低转移的PG-3高很多。人胃癌细胞系MGC803绝大多数细胞为CD36+，而在其余10种被检测的肿瘤细胞系则未发现表达。
3 讨论
CD9和CD63同属TM4SF (transmembrane 4 superfamily)家族。CD9在绝大多数来源于人的血液系统和实体瘤细胞的表面有表达。CD9和CD63的低表达可能是一些高转移潜能肿瘤的特征。它们表达的减少与转移有正相关趋向，这二个蛋白也许可以作为有用的预后标志[2，3]。还有人认为CD9和CD63的丢失可能使黑色素瘤细胞逃避免疫系统的监视而加剧远隔转移[2]。我们的实验也发现PGCL3/PAa，PG-3M/PG-3细胞中，低转移细胞的CD9表达比高转移细胞要强烈一些，抗CD9抗体可以很明显地加强PGCL3细胞对Boyden小室的侵袭，与上述对CD9的认识基本吻合。CD9分子可以调节肿瘤细胞的粘附和运动。最近发现的一个前列腺癌转移抑制基因KAI-1与CD9同属TM4SF家族，我们也许可以将CD9当作抑癌基因看待。CD63与其它抑癌基因不同，P53、P16等癌基因一般出现在正常细胞，在恶性细胞中丢失或失活，而CD63却不被正常的黑色素细胞表达[4]。我们发现CD63与CD9一样，在不同肿瘤细胞有广泛的表达，CD63发挥作用的机制尚不清楚。我们的实验与CD63可能是一个抑制肿瘤细胞转移因子的看法不太一致。这也许与研究中所使用的单抗种类不同有关，也许是因为肿瘤细胞CD63蛋白发生变异或失活而与正常细胞所表达的CD63不同，从而导致CD63在功能方面的差异。
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恶性肿瘤细胞中TSP的含量比良性肿瘤细胞高很多[5]。TSP介导细胞的粘附和运动对肿瘤细胞的侵袭和转移有直接促进作用。CD36是TSP受体，介导血小板与TSP及胶原之间的粘附。对肿瘤细胞表面表达CD36的研究很少[6]。我们的研究发现高转移肿瘤细胞有较高的TSP+细胞的比例和TSP表达强度，低转移者TSP的阳性细胞相对较少，TSP的表达强度也相对较低。抗TSP抗体部分阻断PGCL3细胞在浸润小室的侵袭能力。我们的研究还发现临床上肿瘤病人血小板表面CD36和TSP的表达，随着病情加重而增强，释放入血的TSP也随之增多。由于肿瘤细胞表面也存在很多非CD36的TSP受体[7]，部分肿瘤细胞表达CD36这个TSP受体，癌细胞利用TSP形成聚集并粘附到人富TSP受体的毛细血管内皮和富TSP基质，这些作用对肿瘤细胞的播散有重要意义。瘤细胞表面的TSP做为瘤细胞和血小板之间连接的桥梁，引起我们临床上常见的血液高粘高凝状态。由于在11种人肿瘤细胞表面未能发现有CD41(αIIbβ3，GpIIb/IIIa)的表达，肿瘤细胞表面TSP与CD36和/或非CD36 TSP受体的结合和相互作用介导的肿瘤细胞、血小板、内皮和内皮下基质的相互连接和作用也许比 αIIbβ3 机制[8]显得更重要。
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CD42a (GPIX) 抗原与GpIb (CD42b) 形成GpIb-IX非共价复合物，是von Willebrand(vWF)因子和凝血酶的受体。我们所使用的SZ1 (GPIX) 单抗不能识别单独的GPIb或GPIX，只与二者的复合物起反应。目前还没有发现关于肿瘤细胞表面表达CD42a的报告。在被研究的11种肿瘤细胞表面均有CD42a的表达，使用识别GpIb的单抗CD61时并没有发现CD61的表达。CD42a在肿瘤细胞表面表达的意义尚不清楚。vWF是CD42a的配基，内皮细胞、内皮下连接组织等及血小板α颗粒均存在vWF。vWF有6个重要的与其结构有关的生理连接部位连接因子VIII、GPIb-IX、GPIIb/IIIa、各型胶原、肝素及其它基质蛋白，肝素样氨基糖可能也是vWF结合的成分。肿瘤细胞进入血液中，也许通过肿瘤细胞和血小板各自表面所表达免疫学相关的GPIb-IX分子和血小板表面GPIIb/IIIa与血浆中的vWF结合，介导肿瘤细胞、内皮下基质和血小板的粘附；通过激活引发血小板的聚集，通过释放包括vWF在内的粘附蛋白和活性物质进一步促进肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用，使肿瘤细胞对内皮和内皮下基质的粘附更加牢固。肿瘤细胞通过这些粘附作用诱导血小板激活，发生释放和聚集反应，导致血液凝固系统的激活，造成有利于肿瘤细胞转移的环境。上述作用机制很可能是肿瘤细胞入血后除选择素与糖配基结合之外[8]与血管内皮和血小板发生最初接触的另外一个重要的机制。
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资金项目：国家自然科学基金资助课题(39670912)
作者简介：张培彤，男，34岁，医学博士，副主任医师，主要研究肿瘤转移防治机理
参考文献
1 Wojtukiewicz M Z, Tang D G, Ciarelli J J et al. Thrombin increases the metastatic potential of tumor cells. Int J Cancer，1993；54:793
2 Si Z， Hersey P. Expression of the neuroglandular antigen and analogues in melanoma. CD9 expression appears inversely releated to metastatic potential of melanoma. Int J Cancer,1993;54:37
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3 Radford K J, Mallesch J，Hersey P. Suppression of human melanoma cell growth and metastasis by the melanoma-associated antigen CD63 (ME491). Int J Cancer， 1995；62：631
4 Demetrick D J, Herlyn D, Tretiak M et al. ME491 melanoma-associated glycoprotein family: antigenic identity of ME491, NKI/C3, neuroglandular antigen (NGA), and CD63 proteins. J Nat Cancer Inst,1992;84:422
5 Pratt D A, Miller W R, Dawes J. Thrombospondin in malignant and non-malignant breast tissue. Eur J Cancer Clin Oncol,1989;25:343
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6 Silverstein R L, Baird M, Lo S K et al. Sense and antisense cDNA transfection of CD36 (glycoprotein IIIb) in melanoma cell. Role of CD36 as a thrombospondin receptor. J Biol Chem,1992;267(23):16607
7 Arnoletti J P, Albo O, Jhala N et al. Computer-assisted image analysis of tumor sections for a new thrombospondin receptor. Am J Surg，1994;168(5):433
8 Honn K V, Tang D G, Crissman J D. Platelet and cancer metastasis: A causal relationship? Cancer and Metastasis Reviews，1992;11:325
收稿1998-10-20 修回1999-05-08
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单位：中国中医研究院广安门医院流式细胞仪室，北京100053
关键词：流式细胞术；血小板免疫相关抗原；侵袭和转移，肿瘤；肿瘤细胞系，培养的
中国免疫学杂志991209 摘 要 目的：研究不同肿瘤细胞表面血小板免疫相关抗原的表达。方法：利用流式细胞术观察了PGCL3、PAa、PG-3、PG-3M、MGC803、ESCL、Bel、HCT、KB、A2780、CC801共11种人肿瘤细胞，其中包括二对高低不同转移能力的人肺癌(PGCL3和PAa)和人前列腺癌(PG-3和PG-3M)细胞阳性表达不同血小板免疫相关抗原的细胞数及其肿瘤细胞表面抗原表达的平均荧光强度。结果：11种人肿瘤细胞膜表面均有CD9、CD63、CD42a和TSP等血小板免疫相关抗原不同程度的表达，在MGC803细胞膜表面发现有CD36较强的表达，CD41、CD42b、CD61和CD62均未发现表达。11种人肿瘤细胞系中CD9+、CD42a+、CD63+、TSP+细胞所占的比例各不相同，不同肿瘤细胞系每个抗原阳性细胞抗原表达的荧光强度也不同。与高转移PGCL3和PG-3M细胞相比，CD9在低转移细胞系PAa和PG-3上有较高的表达，CD42a、TSP有相对低的表达。CD42a+和TSP+细胞数和表达强度在高转移PGCL3和PG-3M细胞系均要高于低转移的PAa和PG-3；CD63+细胞数高转移PG-3M细胞系要比低转移的PG-3高很多。结论：结合既往研究，肿瘤细胞表达的血小板免疫相关抗原可能与肿瘤细胞的侵袭转移能力有关。CD42a 、TSP和CD36过度表达可能促进肿瘤细胞的侵袭和转移，CD9和CD63(尤其是CD9)可能起相反的作用。由于MGC803同时表达CD36，它可能是11种肿瘤细胞中侵袭转移能力最强的。
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Measurement of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on tumor cells surface by flow cytometry
ZHANG Pei-Tong,PIAO Bing-Kui,PEI Ying-Xia et al.
Flow Cytometry Laboratory,Guanganmen Hospital,China Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100053
Abstract Objective：To investigate the expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on various human tumor cells surface. Methods：To measure and compare the expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on 11 human tumor cell lines by flow cytometry. Particularly analyzing the results of two pairs of human pulmonary and prostatic tumor cell lines with low and high metastatic potential respectively. Counting the number and measuring the mean fluorescent intense of the antigen positive cells. Results：The expression of the fluorescent intensity and the number of the positive cells of CD9, CD63, CD42a and TSP on these tumor cell lines were different. MGC803 express CD36 except for CD9, CD63, CD42a and TSP. There were not expression of CD41, CD42b, CD61 and CD62 on 11 tumor cell lines. The positive cell number and fluorescent intensity of CD9 on the tumor cell lines PGCL3 and PG-3M with high metastatic potential is lower than that on PAa and PG-3 with low metastatic potential. The positive cell number and fluorescent intensity of CD42a, TSP, CD36 molecule expressed on PAa and PG-3 cells with low metastatic potential is less than that on PGCL3 and PG-3M. Conclusion：The expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on tumor cells surface relate to the tumor invasion and metastasis. The over expression of CD42a, CD36 and TSP on tumor cell surface may promote tumor invasion and metastasis. CD9 and CD63, especially CD9 inhibit the invasion and metastasis. MGC803 express not only CD42a and TSP, but also CD36, it may have the most powerful invasive behavior among 11 tumor cell lines.
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Key words Flow cytometry Antigen immunologically related to the platelet glycoprotein Invasion and metastasis, neoplasoma Tumor cell line, culture
肿瘤细胞与血小板相互作用是肿瘤发生转移的关键步骤，血小板与肿瘤细胞通过各自浆膜表面表达的糖蛋白受体及其配基的连接作用，促进肿瘤细胞、血小板、内皮细胞、内皮下基质间的相互作用和相互激活，并利用细胞间的相互粘附及其释放的生物活性介质来影响肿瘤细胞的转移过程。我们通过了解不同肿瘤细胞表面表达的与血小板具有共同抗原性的糖蛋白分子，试图解释肿瘤细胞的侵袭转移机理。
1 材料与方法
1.1 材料 IgG1 FITC (679.1Mc7)、IgG1 PE (679.1Mc7)、IgG2a FITC(U7.27)、CD9 FITC (ALB6, IgG1)、CD31 FITC(5.6E,IgG1)、CD36 FITC (FA6.152, IgG1)、TSP PE (P10,IgG1)、CD61 FITC (RUU-PL 7F12，IgG1)、CD41 PE (P2, IgG1)、CD42a FITC(SZ1,IgG2a)、CD42b PE (SZ2,IgG1)、CD63 FITC (CLBGran/12,IgG1)、CD62 PE (CLB Thromb/6, IgG1)。除CD61 FITC来自美国BD公司，其余抗体均来自法国Immunotech公司；RPMI1640来自GIBCO；牛血清白蛋白来自Sigma。人肺巨细胞癌PGCL3 (高转移细胞系)、人肺腺癌PAa (低转移细胞系)、人前列腺癌PG-3M (高转移细胞系)和PG-3 (低转移细胞系)来自北京医科大学基础医学院病理学系；人食管癌ESCL、人肝癌Bel、人结肠癌HCT、人鼻咽癌KB、人卵巢癌A2780来自中国医学科学院药物研究所肿瘤药理研究室；人宫颈癌CC801、人胃癌MGC803来自中国医学科学院基础医学研究所病理研究室。FACSort流式细胞仪为美国BD公司产品。
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1.2 方法 各种肿瘤细胞用0.02% EDTANa2消化，以D-Hank′s液 (pH7.4) 吹打收集细胞，以0.5% 的PBA (PBS牛血清白蛋白) 洗2遍，重悬于0.5%PBA溶液中。以CD41 PE、CD61 FITC、CD42a FITC、CD42b PE、CD36 FITC、TSP PE、CD9 FITC、CD31 FITC、CD62 PE、CD63 FITC按常规方法标记染色，对照管采用IgG1 FITC、IgG2a FITC或IgG1 PE。细胞终浓度为105～106个/ml，抗体浓度为0.2 mg/ml。在室温暗处标记反应30 min后，以0.5% PBA洗1遍，用终浓度0.1%PFA固定，置4℃ 冰箱贮存待测，上机前过200目尼龙筛网，每个试验重复2～3次，每个样品收集104个细胞。另外，还将PGCL3和PAa细胞分别用终浓度为0.1、0.5、1.0 U/ml的凝血酶和2×10-4 mol/L的ATP在37℃刺激20 min，洗2遍，按常规染色，上机测试。
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1.3 流式细胞仪测试条件 FSC电压E-1，增益6.14，线性；SSC电压320，增益1.00，线性；FL1电压400，对数；FL2电压340，对数；激光功率15 mW，激发光波长488 nm。校正机器后，先以前向角和侧向角散射光形成的散点图设定收集门，以固定条件收集样本。每个样品管收集104个肿瘤细胞后进行分析。采用Macintosh Quadra 650计算机和Cell Quest软件收集处理样品数据。
2 结果
2.1 在PGCL3、PAa、PG-3M、PG-3、MGC803、ESCL、Bel、HCT、KB、A2780、CC801等11种肿瘤细胞上均发现有CD9、CD63、CD42a和TSP不同程度的表达，在MGC803上还发现有CD36较强的表达，但其余被检测抗原均未发现表达(见图1)。PGCL3与PAa细胞采用凝血酶及ADP刺激 (凝血酶的刺激可以增加肿瘤细胞CD41的表达[1]，后也未显示CD41、CD42b、CD61、CD36和CD62的表达。
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图1 MGC803 细胞所表达的血小板免疫相关抗原
Fig.1 The expression of antigens (CD9, CD36, CD42a, CD63 and TSP) immunologically related to the platelet glycoproteins on MGC803 (dot line, negative control; real line, MGC803 cells)
2.2 在被研究的11种人肿瘤细胞系中CD9+、CD63+、CD42a+、TSP+细胞的比例各不相同，不同肿瘤细胞系的每个抗原阳性细胞表达的抗原分子数量也不同。在对二组不同转移能力的细胞系，PGCL3/PAa和PG-3M/PG-3的检测中发现，高转移和低转移能力的细胞系在CD9+、CD42a+、CD63+、TSP+细胞的数目上和/或表达的平均荧光强度上有较为明显的不同，高、低转移细胞系各自有其基本类似的趋势，即CD9+细胞在低转移细胞系有较高的表达，CD42a、TSP有相对低的表达；CD63的表达在高低转移能力不同的二对细胞系略有所不同，在低转移细胞系PAa CD63的表达要比高转移细胞系PGCL3低，但低转移PG-3细胞系CD63的表达与高转移细胞系PG-3M差别不大(见图2和图3)。
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图2 PGCL3和PAa细胞血小板免疫相关抗原表达的对比
Fig.2 Comparision of the antigen immunologically related to the platelet glycoproteins between high metastatic potential PGCL3 and low metastatic potential PAa (dot line PAa, real line PGCL3)
图3 PG-3M和PG-3细胞血小板免疫相关抗原表达的对比
Fig.3 Comparision of the antigen immunologically related to the platelet glycoproteins between high metastatic potential PG-3M and low metastatic potential PG-3 (dot line PG-3, real line PG-3M)
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2.3 在阳性细胞的比例上，CD42a+细胞数在高转移的PGCL3和PG-3M细胞系均高于低转移的PAa和PG-3；CD9+细胞数虽然在高转移细胞系PGCL3和PG-3M分别略低于PAa和PG-3，但没有特别明显的差别；TSP+细胞数在高转移细胞系PGCL3和PG-3M分别明显高于低转移的PAa和PG-3细胞系；CD63+细胞的数目在PGCL3和PAa之间没有不同，但在二个前列腺癌细胞系当中，高转移的PG-3M要比低转移的PG-3高很多。人胃癌细胞系MGC803绝大多数细胞为CD36+，而在其余10种被检测的肿瘤细胞系则未发现表达。
3 讨论
CD9和CD63同属TM4SF (transmembrane 4 superfamily)家族。CD9在绝大多数来源于人的血液系统和实体瘤细胞的表面有表达。CD9和CD63的低表达可能是一些高转移潜能肿瘤的特征。它们表达的减少与转移有正相关趋向，这二个蛋白也许可以作为有用的预后标志[2，3]。还有人认为CD9和CD63的丢失可能使黑色素瘤细胞逃避免疫系统的监视而加剧远隔转移[2]。我们的实验也发现PGCL3/PAa，PG-3M/PG-3细胞中，低转移细胞的CD9表达比高转移细胞要强烈一些，抗CD9抗体可以很明显地加强PGCL3细胞对Boyden小室的侵袭，与上述对CD9的认识基本吻合。CD9分子可以调节肿瘤细胞的粘附和运动。最近发现的一个前列腺癌转移抑制基因KAI-1与CD9同属TM4SF家族，我们也许可以将CD9当作抑癌基因看待。CD63与其它抑癌基因不同，P53、P16等癌基因一般出现在正常细胞，在恶性细胞中丢失或失活，而CD63却不被正常的黑色素细胞表达[4]。我们发现CD63与CD9一样，在不同肿瘤细胞有广泛的表达，CD63发挥作用的机制尚不清楚。我们的实验与CD63可能是一个抑制肿瘤细胞转移因子的看法不太一致。这也许与研究中所使用的单抗种类不同有关，也许是因为肿瘤细胞CD63蛋白发生变异或失活而与正常细胞所表达的CD63不同，从而导致CD63在功能方面的差异。
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恶性肿瘤细胞中TSP的含量比良性肿瘤细胞高很多[5]。TSP介导细胞的粘附和运动对肿瘤细胞的侵袭和转移有直接促进作用。CD36是TSP受体，介导血小板与TSP及胶原之间的粘附。对肿瘤细胞表面表达CD36的研究很少[6]。我们的研究发现高转移肿瘤细胞有较高的TSP+细胞的比例和TSP表达强度，低转移者TSP的阳性细胞相对较少，TSP的表达强度也相对较低。抗TSP抗体部分阻断PGCL3细胞在浸润小室的侵袭能力。我们的研究还发现临床上肿瘤病人血小板表面CD36和TSP的表达，随着病情加重而增强，释放入血的TSP也随之增多。由于肿瘤细胞表面也存在很多非CD36的TSP受体[7]，部分肿瘤细胞表达CD36这个TSP受体，癌细胞利用TSP形成聚集并粘附到人富TSP受体的毛细血管内皮和富TSP基质，这些作用对肿瘤细胞的播散有重要意义。瘤细胞表面的TSP做为瘤细胞和血小板之间连接的桥梁，引起我们临床上常见的血液高粘高凝状态。由于在11种人肿瘤细胞表面未能发现有CD41(αIIbβ3，GpIIb/IIIa)的表达，肿瘤细胞表面TSP与CD36和/或非CD36 TSP受体的结合和相互作用介导的肿瘤细胞、血小板、内皮和内皮下基质的相互连接和作用也许比 αIIbβ3 机制[8]显得更重要。
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CD42a (GPIX) 抗原与GpIb (CD42b) 形成GpIb-IX非共价复合物，是von Willebrand(vWF)因子和凝血酶的受体。我们所使用的SZ1 (GPIX) 单抗不能识别单独的GPIb或GPIX，只与二者的复合物起反应。目前还没有发现关于肿瘤细胞表面表达CD42a的报告。在被研究的11种肿瘤细胞表面均有CD42a的表达，使用识别GpIb的单抗CD61时并没有发现CD61的表达。CD42a在肿瘤细胞表面表达的意义尚不清楚。vWF是CD42a的配基，内皮细胞、内皮下连接组织等及血小板α颗粒均存在vWF。vWF有6个重要的与其结构有关的生理连接部位连接因子VIII、GPIb-IX、GPIIb/IIIa、各型胶原、肝素及其它基质蛋白，肝素样氨基糖可能也是vWF结合的成分。肿瘤细胞进入血液中，也许通过肿瘤细胞和血小板各自表面所表达免疫学相关的GPIb-IX分子和血小板表面GPIIb/IIIa与血浆中的vWF结合，介导肿瘤细胞、内皮下基质和血小板的粘附；通过激活引发血小板的聚集，通过释放包括vWF在内的粘附蛋白和活性物质进一步促进肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用，使肿瘤细胞对内皮和内皮下基质的粘附更加牢固。肿瘤细胞通过这些粘附作用诱导血小板激活，发生释放和聚集反应，导致血液凝固系统的激活，造成有利于肿瘤细胞转移的环境。上述作用机制很可能是肿瘤细胞入血后除选择素与糖配基结合之外[8]与血管内皮和血小板发生最初接触的另外一个重要的机制。
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资金项目：国家自然科学基金资助课题(39670912)
作者简介：张培彤，男，34岁，医学博士，副主任医师，主要研究肿瘤转移防治机理
参考文献
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4 Demetrick D J, Herlyn D, Tretiak M et al. ME491 melanoma-associated glycoprotein family: antigenic identity of ME491, NKI/C3, neuroglandular antigen (NGA), and CD63 proteins. J Nat Cancer Inst,1992;84:422
5 Pratt D A, Miller W R, Dawes J. Thrombospondin in malignant and non-malignant breast tissue. Eur J Cancer Clin Oncol,1989;25:343
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6 Silverstein R L, Baird M, Lo S K et al. Sense and antisense cDNA transfection of CD36 (glycoprotein IIIb) in melanoma cell. Role of CD36 as a thrombospondin receptor. J Biol Chem,1992;267(23):16607
7 Arnoletti J P, Albo O, Jhala N et al. Computer-assisted image analysis of tumor sections for a new thrombospondin receptor. Am J Surg，1994;168(5):433
8 Honn K V, Tang D G, Crissman J D. Platelet and cancer metastasis: A causal relationship? Cancer and Metastasis Reviews，1992;11:325
收稿1998-10-20 修回1999-05-08
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