共刺激分子B7-1与IL-6协同诱导T细胞活化的研究①
作者：刘然义 屈伸 王剑波 过建莉 周华
单位：刘然义(中山医科大学肿瘤防治中心生物治疗室 广州 510060)；屈 伸(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)；王剑波(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)；过建莉(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)；周 华(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)
关键词：B7-1；(CD80)；白细胞介素-6；肿瘤疫苗；基因治疗；黑色素瘤
中国免疫学杂志000216 摘 要：目的：探讨B7-1单独或者与IL-6联合在体外诱导T细胞活化的能力。 方法：在混合淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTCs)后，测定淋巴细胞增殖指数和CTL杀伤活性。 结果：B7-1+的B16细胞能够较有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异CTL杀伤活性(与野生型B16细胞和模拟转染的B16细胞比较，P<0.01)，当与IL-6结合时效果更加显著(与各对照组比较P<0.01)。 结论：B7-1基因在肿瘤细胞中表达可增强其免疫原性，在体外有效诱导T细胞活化；在此过程中IL-6与B7-1分子存在协同效应。
, http://www.100md.com
分类号：R392.11 R739.5
IL-6 and B7-1 costimulation cooperate in the induction of T lymphocytes activation in vitro
LIU Ran-Yi
(Biotherapy Laboratory, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060. )
QU Shen
(Department of Biochemistry, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
, 百拇医药
WANG Jian-Bo
(Department of Biochemistry, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract：Objective：To investigate the effects of B7-1 costimulatory molecule alone, or combined with IL-6, in inducing T lymphocytes activation in vitro.Methods：After splenocytes from non-immunized C57BL/6 mice had been incubated with wild-type, mock-transfected, and murine B7-1 cDNA-transfected B16 melanoma cells (B16-wt, B16-neo, and B16-mB7.1) respectively for six days, the lymphocytes were tested for both proliferation indices and cytotoxic activity against B16-wt cells.Results：Compared with B16-wt or B16-neo cells, B16-mB7.1 cells more effectively induced the proliferation of effector lymphocytes and the generation of specific lytic activity in vitro (P<0.01); The effects were more significant while combined with IL-6 (compared with other groups, P<0.01), though IL-6 alone could only induce effective proliferation, but not cytotoxicity. Conclusion： The costimulation signal of B7.1 is required for the activation and proliferation of T lymphocytes, the B7-1 expression in tumor cells could increase their immunogenicity and induced effectively T lymphocytes activation, and the cooperation of IL-6 and B7.1 costimulation is more effective.
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Key words：B7-1 (CD80) Interleukin-6 Tumor vaccine Gene therapy Melanoma▲
近年来，随着B7分子性质及功能研究的深入，其在T细胞的活化、抗肿瘤免疫反应启动中的作用已成为当今研究的热点之一[1]，同时IL-6的抗肿瘤活性也越来越受到重视[2]，但关于B7分子与IL-6联合诱导T细胞活化的研究较少。本实验以免疫原性很弱的B16黑色素瘤细胞系为对象研究B7-1及其与IL-6联合在体外诱导的T细胞免疫反应。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞 C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司(沪动合证字153号)。黑色素瘤细胞系B16(F0) (B16-wt，购自武汉大学)源于C57BL/6小鼠，B16-mB7.1和B16-neo细胞分别为小鼠B7-1基因转染和模拟转染的B16细胞[3]，均用含10%小牛血清的DMEM(Gibco)培养；小鼠淋巴细胞取自未免疫的C57BL/6小鼠脾脏，用含10%FCS的1640 (Gibco)培养，培养条件为37℃、5%CO2。
, 百拇医药
1.2 CTLs的诱导及其杀伤活性的检测 将肿瘤细胞灭活(5×106 ml-1细胞用80 mg丝裂霉素C 37℃处理1 h)后与淋巴细胞于24孔板中混合培养(2 ml 1640培养液含6×106淋巴细胞、2×105肿瘤细胞，无或4 000 U IL-6)，6 d后收集淋巴细胞，用无血清1640离心洗涤3次后作为效应细胞，以B16-wt为靶细胞，用LDH释放法测定其特异杀伤活性[3]，效靶比为25:1。杀伤活性按下列公式计算：
1.3 淋巴细胞增殖指数(Proliferation Indices， PI)的测定 混合淋巴细胞肿瘤细胞培养 (0.2 ml 培养液含105淋巴细胞、104灭活的肿瘤细胞、无或400 U IL-6，阴性对照只含淋巴细胞或者灭活的肿瘤细胞) 6 d后，用MTT法测定淋巴细胞增殖指数[4]。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 体外实验皆做3复孔，独立重复3次。数据为其中一次有代表性的实验结果，采用未配对资料的t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 B7-1+ B16细胞及其与IL-6联合诱导的CTL杀伤活性 MTLCs后测定淋巴细胞特异性CTL杀伤活性发现， B16-mB7.1组CTL杀伤活性明显高于B16-neo组和B16-WT组(P<0.01)(图 1A)；当与IL-6联合时，尽管B16-wt+IL-6组和B16-neo+IL-6组与各自的无IL-6对照组相比无明显差异，但是B16-mB7.1+IL-6组明显高于B16-mB7.1组、B16-wt+IL-6组和B16- neo+IL-6组(P<0.01)(图2A)。 2.2 B7-1+ B16细胞及其与IL-6联合诱导淋巴细胞增殖 MTLCs后测定淋巴细胞增殖指数发现，B16-mB7.1组PI值显著高于B16-wt和B16-neo组(P<0.01)(图1B)；当与IL-6联合时，B16-wt+IL-6组和B16-neo+IL-6组PI值均明显高于各自的无IL-6对照组(P<0.05)，B16-mB7.1+IL-6组PI值明显高于B16-mB7.1组、B16-wt+IL-6组和B16-neo+IL-6组(P<0.01)(图2B)。
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图1 B7-1分子在诱导淋巴细胞活化中的共刺激活性
Fig.1 The costimulation activity of B7-1 molecule in inducing lymphocytes activation
Note: 1)Compare with B16-wt and B16-neo group,P<0.01
图2 IL-6与B7-1分子在诱导淋巴细胞活化中的协同作用
Fig.2 IL-6 and B7-1 molecule cooperate in inducing lymphocytes activation
, 百拇医药
Note: 1)Compared with relevant non-IL-6 groups,P<0.05;2)Compare with B16-mB7.1, B16-wt+IL-6,and B16-neo+IL-6 groups,P<0.01
3 讨论
T细胞在机体抗肿瘤免疫中起重要作用，而T细胞的活化除了需要特异性刺激信号Ag-MHC复合物外，还需要共刺激分子(如B7-1等)的存在[1]。若缺乏共刺激分子，T细胞将进入无反应状态[5]。近年来的研究表明，将B7-1基因导入肿瘤细胞表达能增强其免疫原性、诱导免疫排斥反应[6]，但其效应强弱与野生型肿瘤细胞本身免疫原性有关[7]。白细胞介素-6 (IL-6)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，具有明显的抗肿瘤活性[2]。 本实验以免疫原性很弱的B16黑色素瘤细胞为实验对象，研究共刺激分子B7-1及其与IL-6联合在体外诱导的抗肿瘤免疫反应。结果显示，与野生型和模拟转染的B16细胞相比，小鼠B7-1基因转染的B16细胞能较有效地刺激淋巴细胞增殖、增强CTL介导的细胞毒性。这说明B7-1基因在弱免疫原性的肿瘤细胞中表达能在一定程度上增强其免疫原性，在体外较有效诱导T细胞活化。但是由于B16细胞MHC-I类分子表达水平较低，且不表达MHC-II类分子和细胞间粘附分子1 (ICAM-1)，所以诱导的抗瘤效应相对较弱[7]。当联合应用IL-6时发现，IL-6能显著增强B7-1分子诱导的淋巴细胞增殖效应和CTL杀伤活性(虽然IL-6仅刺激脾淋巴细胞增殖而不能有效增强CTL活性)。这说明，在第一信号低下、共刺激信号缺乏的情况下IL-6对T细胞的活化无促进作用(它之所以能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖可能是因为脾细胞中含有大量B细胞的原因)，但是当B7-1和IL-6联合时，即使在第一信号较弱的情况下也能有效诱导T细胞活化。这提示IL-6与B7-1的共刺激作用存在协同效应。van Seventer等证实，IL-6作为T细胞活化的共刺激因子(终末辅助因子)，其本身并不介导共刺激，但它可通过增强共刺激分子(如ICAM-1等)介导的共刺激效应而促进T细胞活化[8]。IL-6与B7-1协同作用的机理还不十分清楚，可能是由B7-1 (CD80)提供共刺激信号，与肿瘤抗原信号一起活化T细胞，而IL-6能提高T细胞对IL-2的反应性，使效应细胞充分活化并促进活化的效应细胞增殖。这还有待于进一步证实。■
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①国家教委资助课题(NO.JW9307)
作者简介：刘然义，男，32岁，助理研究员，主要从事肿瘤基因治疗和免疫治疗研究；屈 伸，男，45岁，教授，博士生导师，主要从事体细胞基因治疗和基因诊断研究
参考文献：
[1]Jonathan H E, Burden M N, Vinogrador D V et al. Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA-4 . J Immunol, 1996; 56: 2700
[2]Lu L, Shen R N, Broxmeyer H E. In vivo effects of recombinant human interleukin-6, alone or in combination with local irradiation, on tumor growth in lewis lung carcinoma-bearing mice. Int J Cell Cloning, 1991; 9: 511
, 百拇医药
[3]刘然义，屈 伸，尤颖健 et al. 小鼠B7-1 cDNA的克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨. 武汉大学学报(自然科学版)，1999；45 (2)：225
[4]刘然义，熊宇芳，屈 伸 et al. 转染人CD80基因的黑色素瘤细胞生长特性及免疫原性探讨. 癌症，1999；18(5)：562
[5]Gimmi C D, Freeman G J, Griggen J G et al. Human T-cell clonal anergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimulation. Proc Natl Sci USA, 1993; 90: 6586
[6]Townsend S E, Allison J P. Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells . Science, 1993； 259: 368
, 百拇医药
[7]Chen L, McGowan P, Ashe S et al. Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity . J Exp Med, 1994； 179: 523
[8]van Seventer G A, Newman W, Shimizu Y et al. Analysis of T cell stimulation by superantigen plus major histocompatibility complex class Ⅱ molecules or by CD3 monoclonal antibody: costimulation by purified adhesion ligands VCAM-1, ICAM-1, but not ELAM-1 . J Exp Med, 1991；174: 901
收稿日期：1999-02-14
修回日期：1999-05-28, 百拇医药
单位：刘然义(中山医科大学肿瘤防治中心生物治疗室 广州 510060)；屈 伸(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)；王剑波(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)；过建莉(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)；周 华(同济医科大学生化教研室 武汉 430030)
关键词：B7-1；(CD80)；白细胞介素-6；肿瘤疫苗；基因治疗；黑色素瘤
中国免疫学杂志000216 摘 要：目的：探讨B7-1单独或者与IL-6联合在体外诱导T细胞活化的能力。 方法：在混合淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTCs)后，测定淋巴细胞增殖指数和CTL杀伤活性。 结果：B7-1+的B16细胞能够较有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异CTL杀伤活性(与野生型B16细胞和模拟转染的B16细胞比较，P<0.01)，当与IL-6结合时效果更加显著(与各对照组比较P<0.01)。 结论：B7-1基因在肿瘤细胞中表达可增强其免疫原性，在体外有效诱导T细胞活化；在此过程中IL-6与B7-1分子存在协同效应。
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分类号：R392.11 R739.5
IL-6 and B7-1 costimulation cooperate in the induction of T lymphocytes activation in vitro
LIU Ran-Yi
(Biotherapy Laboratory, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060. )
QU Shen
(Department of Biochemistry, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
, 百拇医药
WANG Jian-Bo
(Department of Biochemistry, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract：Objective：To investigate the effects of B7-1 costimulatory molecule alone, or combined with IL-6, in inducing T lymphocytes activation in vitro.Methods：After splenocytes from non-immunized C57BL/6 mice had been incubated with wild-type, mock-transfected, and murine B7-1 cDNA-transfected B16 melanoma cells (B16-wt, B16-neo, and B16-mB7.1) respectively for six days, the lymphocytes were tested for both proliferation indices and cytotoxic activity against B16-wt cells.Results：Compared with B16-wt or B16-neo cells, B16-mB7.1 cells more effectively induced the proliferation of effector lymphocytes and the generation of specific lytic activity in vitro (P<0.01); The effects were more significant while combined with IL-6 (compared with other groups, P<0.01), though IL-6 alone could only induce effective proliferation, but not cytotoxicity. Conclusion： The costimulation signal of B7.1 is required for the activation and proliferation of T lymphocytes, the B7-1 expression in tumor cells could increase their immunogenicity and induced effectively T lymphocytes activation, and the cooperation of IL-6 and B7.1 costimulation is more effective.
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Key words：B7-1 (CD80) Interleukin-6 Tumor vaccine Gene therapy Melanoma▲
近年来，随着B7分子性质及功能研究的深入，其在T细胞的活化、抗肿瘤免疫反应启动中的作用已成为当今研究的热点之一[1]，同时IL-6的抗肿瘤活性也越来越受到重视[2]，但关于B7分子与IL-6联合诱导T细胞活化的研究较少。本实验以免疫原性很弱的B16黑色素瘤细胞系为对象研究B7-1及其与IL-6联合在体外诱导的T细胞免疫反应。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞 C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司(沪动合证字153号)。黑色素瘤细胞系B16(F0) (B16-wt，购自武汉大学)源于C57BL/6小鼠，B16-mB7.1和B16-neo细胞分别为小鼠B7-1基因转染和模拟转染的B16细胞[3]，均用含10%小牛血清的DMEM(Gibco)培养；小鼠淋巴细胞取自未免疫的C57BL/6小鼠脾脏，用含10%FCS的1640 (Gibco)培养，培养条件为37℃、5%CO2。
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1.2 CTLs的诱导及其杀伤活性的检测 将肿瘤细胞灭活(5×106 ml-1细胞用80 mg丝裂霉素C 37℃处理1 h)后与淋巴细胞于24孔板中混合培养(2 ml 1640培养液含6×106淋巴细胞、2×105肿瘤细胞，无或4 000 U IL-6)，6 d后收集淋巴细胞，用无血清1640离心洗涤3次后作为效应细胞，以B16-wt为靶细胞，用LDH释放法测定其特异杀伤活性[3]，效靶比为25:1。杀伤活性按下列公式计算：
1.3 淋巴细胞增殖指数(Proliferation Indices， PI)的测定 混合淋巴细胞肿瘤细胞培养 (0.2 ml 培养液含105淋巴细胞、104灭活的肿瘤细胞、无或400 U IL-6，阴性对照只含淋巴细胞或者灭活的肿瘤细胞) 6 d后，用MTT法测定淋巴细胞增殖指数[4]。
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1.4 统计学处理 体外实验皆做3复孔，独立重复3次。数据为其中一次有代表性的实验结果，采用未配对资料的t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 B7-1+ B16细胞及其与IL-6联合诱导的CTL杀伤活性 MTLCs后测定淋巴细胞特异性CTL杀伤活性发现， B16-mB7.1组CTL杀伤活性明显高于B16-neo组和B16-WT组(P<0.01)(图 1A)；当与IL-6联合时，尽管B16-wt+IL-6组和B16-neo+IL-6组与各自的无IL-6对照组相比无明显差异，但是B16-mB7.1+IL-6组明显高于B16-mB7.1组、B16-wt+IL-6组和B16- neo+IL-6组(P<0.01)(图2A)。 2.2 B7-1+ B16细胞及其与IL-6联合诱导淋巴细胞增殖 MTLCs后测定淋巴细胞增殖指数发现，B16-mB7.1组PI值显著高于B16-wt和B16-neo组(P<0.01)(图1B)；当与IL-6联合时，B16-wt+IL-6组和B16-neo+IL-6组PI值均明显高于各自的无IL-6对照组(P<0.05)，B16-mB7.1+IL-6组PI值明显高于B16-mB7.1组、B16-wt+IL-6组和B16-neo+IL-6组(P<0.01)(图2B)。
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图1 B7-1分子在诱导淋巴细胞活化中的共刺激活性
Fig.1 The costimulation activity of B7-1 molecule in inducing lymphocytes activation
Note: 1)Compare with B16-wt and B16-neo group,P<0.01
图2 IL-6与B7-1分子在诱导淋巴细胞活化中的协同作用
Fig.2 IL-6 and B7-1 molecule cooperate in inducing lymphocytes activation
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Note: 1)Compared with relevant non-IL-6 groups,P<0.05;2)Compare with B16-mB7.1, B16-wt+IL-6,and B16-neo+IL-6 groups,P<0.01
3 讨论
T细胞在机体抗肿瘤免疫中起重要作用，而T细胞的活化除了需要特异性刺激信号Ag-MHC复合物外，还需要共刺激分子(如B7-1等)的存在[1]。若缺乏共刺激分子，T细胞将进入无反应状态[5]。近年来的研究表明，将B7-1基因导入肿瘤细胞表达能增强其免疫原性、诱导免疫排斥反应[6]，但其效应强弱与野生型肿瘤细胞本身免疫原性有关[7]。白细胞介素-6 (IL-6)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，具有明显的抗肿瘤活性[2]。 本实验以免疫原性很弱的B16黑色素瘤细胞为实验对象，研究共刺激分子B7-1及其与IL-6联合在体外诱导的抗肿瘤免疫反应。结果显示，与野生型和模拟转染的B16细胞相比，小鼠B7-1基因转染的B16细胞能较有效地刺激淋巴细胞增殖、增强CTL介导的细胞毒性。这说明B7-1基因在弱免疫原性的肿瘤细胞中表达能在一定程度上增强其免疫原性，在体外较有效诱导T细胞活化。但是由于B16细胞MHC-I类分子表达水平较低，且不表达MHC-II类分子和细胞间粘附分子1 (ICAM-1)，所以诱导的抗瘤效应相对较弱[7]。当联合应用IL-6时发现，IL-6能显著增强B7-1分子诱导的淋巴细胞增殖效应和CTL杀伤活性(虽然IL-6仅刺激脾淋巴细胞增殖而不能有效增强CTL活性)。这说明，在第一信号低下、共刺激信号缺乏的情况下IL-6对T细胞的活化无促进作用(它之所以能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖可能是因为脾细胞中含有大量B细胞的原因)，但是当B7-1和IL-6联合时，即使在第一信号较弱的情况下也能有效诱导T细胞活化。这提示IL-6与B7-1的共刺激作用存在协同效应。van Seventer等证实，IL-6作为T细胞活化的共刺激因子(终末辅助因子)，其本身并不介导共刺激，但它可通过增强共刺激分子(如ICAM-1等)介导的共刺激效应而促进T细胞活化[8]。IL-6与B7-1协同作用的机理还不十分清楚，可能是由B7-1 (CD80)提供共刺激信号，与肿瘤抗原信号一起活化T细胞，而IL-6能提高T细胞对IL-2的反应性，使效应细胞充分活化并促进活化的效应细胞增殖。这还有待于进一步证实。■
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①国家教委资助课题(NO.JW9307)
作者简介：刘然义，男，32岁，助理研究员，主要从事肿瘤基因治疗和免疫治疗研究；屈 伸，男，45岁，教授，博士生导师，主要从事体细胞基因治疗和基因诊断研究
参考文献：
[1]Jonathan H E, Burden M N, Vinogrador D V et al. Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA-4 . J Immunol, 1996; 56: 2700
[2]Lu L, Shen R N, Broxmeyer H E. In vivo effects of recombinant human interleukin-6, alone or in combination with local irradiation, on tumor growth in lewis lung carcinoma-bearing mice. Int J Cell Cloning, 1991; 9: 511
, 百拇医药
[3]刘然义，屈 伸，尤颖健 et al. 小鼠B7-1 cDNA的克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨. 武汉大学学报(自然科学版)，1999；45 (2)：225
[4]刘然义，熊宇芳，屈 伸 et al. 转染人CD80基因的黑色素瘤细胞生长特性及免疫原性探讨. 癌症，1999；18(5)：562
[5]Gimmi C D, Freeman G J, Griggen J G et al. Human T-cell clonal anergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimulation. Proc Natl Sci USA, 1993; 90: 6586
[6]Townsend S E, Allison J P. Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells . Science, 1993； 259: 368
, 百拇医药
[7]Chen L, McGowan P, Ashe S et al. Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity . J Exp Med, 1994； 179: 523
[8]van Seventer G A, Newman W, Shimizu Y et al. Analysis of T cell stimulation by superantigen plus major histocompatibility complex class Ⅱ molecules or by CD3 monoclonal antibody: costimulation by purified adhesion ligands VCAM-1, ICAM-1, but not ELAM-1 . J Exp Med, 1991；174: 901
收稿日期：1999-02-14
修回日期：1999-05-28, 百拇医药