黄芩类黄酮对人免疫细胞化学发光及淋巴细胞增殖的影响①
作者：贺海平 秦箐 陈明 Ami Kharazmi Soren Brogger Christensen
单位：贺海平(广西肿瘤防治研究所 南宁 530021)；秦 箐(广西医科大学)；陈 明(广西医科大学)
关键词：黄芩；类黄酮；化学发光；淋巴细胞增殖
中国免疫学杂志000212 摘 要：目的：探讨黄芩类黄酮对人免疫细胞影响。方法：检测了从黄芩中纯化的3′，5，6，7-四羟基-2′，8-二甲氧基黄酮、2′，5-二羟基-6，6′，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮、(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇、黄芩甙和黄芩酮6种类黄酮成分对人多形核细胞(PMN)、单个核细胞(MNC)化学发光反应和PHA诱导淋巴细胞增殖的影响。结果：除(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇外，其它5种抑制N-Fomyl-Met-Leu-Phe(fMLP)激活的PMN和MNC或调理酵母多糖(OZ)激活的PMN产生的化学发光，也显著地抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖，在2.5×10-4mol/L浓度时抑制化学发光的抑制率可达41%～99%。抑制淋巴细胞增殖的抑制率可达89%～99%。结论：从黄芩中分离的类黄酮对PMN、MNC和淋巴细胞有不同的作用。这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有关系。也显示这些成分有可能成为新的抗炎或免疫抑制药物。
, http://www.100md.com
中国图书分类号：R392.12 R28
Effects of flavonoids isolated from Scutellaria baicalensis georgi on chemiluminescence response of immunological cells and proliferation of human lymphocytes
HE Hai-Ping
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
QIN Jing
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
, 百拇医药
CHEN Ming
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
Abstract：Objective:Studied the effects of flavonoids isolated from Scutellaria baicalensis georgi on immunological cells.Methods：It was tested that the effect of 3′,5,6,7-tetrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone,2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone,5,7,8-trihydroxyflavone,(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol,which isolated from Scutellaria baicalensis georgi on chemiluminescence(CL) response of human ploymorphonuclear cells(PMN) and mononuclear cells(MNC) and PHA-induced proliferation of human lymphocytes. Results： It was found that six compounds with the exception of 2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol strongly inhibited fMLP and opsonized zymosan(OZ)-induced CL and significantly inhibited PHA-induced lymphocyte proliferation.At 2.5×10-4mol/L concentration inhibited CL by 41% to 99% and showed the significant inhibited PHA-induced lymphocyte proliferation by 89% to 99%.Conclusion：It indicated that the effects of the flavonoids on neutrophils,MNC and lymphocytes were variable,that the effects may contribute to the known anti-inflammatory and anti-allergy actions of Scutellaria baicalensis georgi and these compounds may have potential as anti-inflammatory immunosuppressive drugs.
, 百拇医药
Key words：Scutellaria baicalensis georgi Flavonoid Chemiluminescence Lymphocyte proliferation▲
黄芩是我国和日本的一种传统的中草药，从古至今，已被用于治疗过敏性和传染性疾病[1，2]。现代的研究显示黄芩的粗提物和提取的成分具有抗真菌[3]、抗突变[4]、抗病毒[5]、抗炎症[6]、抗血管平滑肌细胞增殖[1]、抑制NAD(P)H[7]和抗肿瘤等效应[8]。为了进一步了解黄芩对免疫功能的影响，我们从黄芩提取有效成分，并检测了从黄芩中纯化的6种黄酮成分对PMN、MNC化学发光反应和PHA诱导淋巴细胞增殖的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 黄芩化学提取物的制备 3′，5，6，7-四羟基-2′，8-二甲氧基黄酮、2′，5-二羟基-6，6′，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮和(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇从黄芩中分离纯化。并经化学结构分析。黄芩甙和黄芩酮从Aldrich(德国)购买。其结构式见表1。黄芩类黄酮溶解于二甲基亚砜(DMSO)后，用含1%人白蛋白的KRB(Krebs Ringers Buffer,pH7.2)稀释。DMSO在培养基的终浓度小于0.1%(V/V)。对照试验显示DMSO在该浓度不影响淋巴细胞增殖和化学发光。
表1 6种黄芩类黄酮的化学结构
Tab.1 Chemical structures of 6 flavonoids from Scutellaria baicalensis georgi No.
3
, http://www.100md.com 5
6
7
8
2′
3′
6′
C2-3
1
Baicalein
OH
OH
OH
u
, http://www.100md.com
2
Baicalin
OH
OH
OGLD
u
3
3′,5,6,7-tetrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone,OH
OH
OH
OCH3
OCH3
, 百拇医药
OH
u
4
2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone
OH
OCH3
OCH3
OCH3
OH
OCH3
u
5
, http://www.100md.com 5，7，8-trihydroxyflavone
OH
OH
OH
u
6
(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol
OH
OH
OH
OH
OH
, 百拇医药
s
1.2 PMN和MNC制备 取健康人全血，枸橼酸钠抗凝，左旋糖苷沉淀，Sodium-metrizoate Ficoll(Lymphoprep,Nyegaard,Oslo,Norway)分离。残余的红细胞用低渗法去除。嗜中性粒细胞悬液纯度大于98%。MNC用非特异性酯酶染色，悬液含15%～18%的MNC。用胎酚蓝染色细胞活性大于98%。
1.3 化学发光反应 激活或非激活的PMN的化学发光产物用鲁米诺增强系统检测。使用两种激活剂调理酵母多糖(OZ)和fMLP。①OZ，10 mg酵母多糖(Sigma)、70 ml KRB和3 ml AB型血清混合，置于37℃孵育30 min后，3 000 r/min离心10 min。沉淀物重悬于KRB中(1 mg/ml)。②fMLP，溶于KRB中，使用时终浓度为10-5mol/L。
一份的细胞悬液(当用OZ作激活剂测定时，PMN的浓度为107 ml-1或MNC为2×106 ml-1，当用fMLP作激活剂时，PMN的浓度为2×106 ml-1)加等体积，浓度不同的类黄酮，37℃旋转(20 r/min)孵育30 min。取0.1 ml孵育后的PMN或MNC，0.2 ml OZ或fMLP和0.7 ml发光胺溶液(10-4mol/L)，加入3 ml聚苯乙烯小管中。将小管放于光度仪(1251-LKB， Wallac)中检测，连续记录化学发光产物，直到最大的微伏峰出现。
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1.4 PHA诱导淋巴细胞增殖 PHA诱导的淋巴细胞增殖按我室常规方法进行。简单说，单个核细胞淋巴细胞悬于含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中(Gibco Lab.美国)，浓度为6.5×105 cell/ml。取135 μl分种于96孔板中，加25 μl的PHA溶液(Murex,英国)，PHA的终浓度为75 μg/ml。37℃(5%CO2)孵育48 h。加入不同浓度的类黄酮和l μCi的3H-胸腺嘧啶(Amersham International plc,英国)，继续培养18 h。用收集仪收集细胞，干燥滤膜。用beta计数仪(Matrix96，PACKARD)记录同位素放射量，每组平行作3孔，计算胸腺嘧啶的摄入量的均值(DMP)和标准差，用统计学检验显著性差异。各种类黄酮对淋巴细胞增殖的抑制率按下公式计算：
2 结果
, 百拇医药
2.1 类黄酮对fMLP和OZ激活的嗜中性粒细胞化学发光反应的影响 6种黄酮中的5种(1，2，3，4，5)抑制fMLP激活的PMNs产生的化学发光(见表2)。最低浓度(2.5×10-7mol/L)时的抑制率为18%～33%。在2.5×10-4 mol/L浓度时抑制率为41%～99%，奇怪的是成分3在2.5×10-4mol/L浓度时抑制率为99%，但10倍稀释后迅速降到12%。成分6即使浓度达2.5×10-4mol/L对化学发光均无影响。
表2 6种不同浓度类黄酮对fMLP或OZ激活PMN化学发光的抑制率(x±s,n=3,mol/L)
Tab.2 Percentage inhibition of various concentrations of six compounds in PMNs chemiluminescence stimulated by fMLP or OZ(x±s,n=3,mol/L) Compound
, 百拇医药
Stimulated by OZ
Stimulated by fMLP
2.5×10-4
2.5×10-5
2.5×10-6
2.5×10-7
2.5×10-4
2.5×10-5
2.5×10-6
2.5×10-7
, 百拇医药
Baicalein
95±0
61±0
31±3
23±1
101±0
97±0
83±1
50±4
Baicalin
41±0
10±2
15±4
, 百拇医药
18±5
80±8
54±7
18±8
19±9
3′,5,6′ 7-tetrahydroxy-8′dimethoxyflavone,99±1
12±0
19±2
18±1
102±0
36±15
26±12
, 百拇医药
32±10
2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone
74±1
48±1
30±1
33±2
100±0
93±0
70±2
34±1
5,7,8-trihydroxyflavone
93±0
, 百拇医药
48±2
31±4
33±2
101±0
98±1
86±3
45±3
(2R,3R-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol
4±2
5±1
4±1
-2±2
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-9±4
-4±13
-5±8
5±6
类黄酮抑制OZ激活的PMN产生的化学发光与抑制fMLP激活的特征相似。6种类黄酮抑制OZ激活的化学发光反应的强度较fMLP弱。高浓度的成分6不抑制OZ诱导的化学发光。类黄酮抑制OZ激活的MNC产生的化学发光与抑制酵母多糖激活的PMN的特性相似。
2.2 类黄酮对PHA诱导的淋巴细胞增殖的影响 类黄酮(6×10-5～2.5×10-4mol/L)对PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制活性见图1。黄芩酮、2′，5-二羟基-6，6′，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮在浓度为2.50×10-4mol/L时，显著地抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖，抑制率达89%～99%。其抑制率呈浓度依赖关系。(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇浓度为1.25×10-4mol/L时，对PHA诱导的淋巴细胞增殖无明显抑制作用。
, 百拇医药
图1 类黄酮对PHA诱导淋巴细胞增殖的影响
Fig.1 Effects of the flavonoids on PHA-induced lymphocyte proliferation
Note:control(C),2′5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone(DT),5,7,8-trihydroxyflavone(T)，(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-Pentahydrooxyflavanonol(P),3′,5,6,7-trtrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone(TD),Baicalein(B-ein),Baicalin(B-in)
3 讨论
化学发光是中性粒细胞呼吸爆发的标志，与毒性的氧衍生物包括过氧化物、过氧化氢、羟自由基和单线态氧的形成和释放有关。本研究检测了6种从黄芩提取的化学成分对中性粒细胞的化学发光的影响。除(2R,3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇外，其余5种类黄酮均强烈地抑制OZ和fMLP诱导的中性粒细胞化学发光反应。结果表明：这些成分可作为抗炎药物或免疫抑制药物。
, 百拇医药
从以上6种成分的研究结果，还很难阐述其构效关系，主要是研究的成分还不够多。但通过与文献资料比较[9-11]。至少有两个方面的发现：1)Taxifolin和(2R,3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇对化学发光的抑制效应完全不同，表明在B环上C3′和C4′的羟基结构有显著的抑制化学发光反应，而B环上的C2′和C6′羟基结构则无抑制作用。2)柯因(chrysin)和芹菜配质(apigenin)不抑制OZ诱导的化学发光而5，7，8-三羟基黄酮却有抑制作用，这表明A环上8-羟基对抑制化学发光反应有明显的作用。
越来越多的资料表明许多类黄酮在体外对PMN活性氧产生有抑制作用[12]以及对受激活的T淋巴细胞增殖有影响。Oberley等认为膜信号启动细胞分化时，有过氧化物、过氧化氢的形成，葡萄糖摄入增加，使环核苷酸的比率改变[13]，这是由于过氧化氢酶和过氧化物酶减少，使细胞内过氧化氢积累，最后诱导细胞分化，氧自由基直接参与触发淋巴细胞活化的起始信号。我们试验显示5种具有抑制嗜中性粒细胞化学发光反应的类黄酮也显著抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖。另一方面(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇不抑制嗜中性粒细胞的化学发光反应也几乎不抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖反应。这清楚地表明：类黄酮对PHA诱导的淋巴细胞增殖抑制的不同，与抑制活性氧形成有关。因此，黄芩类黄酮抑制淋巴细胞增殖，可能是通过抑制氧自由基，继而抑制了淋巴细胞活化起始信号的传递。
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小结：从黄芩中分离的类黄酮对人嗜中性粒细胞、单个核细胞和淋巴细胞有不同的作用。3′，5，6′，7-四羟基-2′，8-二甲氧基黄酮是一种新发现的化合物，在体外具有抑制嗜中性粒细胞和单个核细胞的化学发光反应。这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有直接的关系。
感谢丹麦国家医院的Anne Asanovski、Hanne Tamstorf、Begit和丹麦皇家药学院给予的试验指导。■
①丹麦Dania奖学金资助
作者简介：贺海平，男，42岁，微生物与免疫学专业硕士，副教授，主要研究肿瘤免疫和肿瘤生化
作者单位：Ami Kharazmi(Clin Microbiol Depart，University Hospital,Denmark)
Soren Brogger Christensen(Depart Medicinal Chemistry,Royal Danish School
, http://www.100md.com
Pharmacy,Denmark)
参考文献：
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[13]Oberley L W,Oberley T D,Buettner G R.Cell division in normal and transformed cells:the possible role of superoxide and hydrogen peroxide.Medical Hypotheses，1981;7:21
收稿日期：1998-05-07
修回日期：1999-10-27, 百拇医药
单位：贺海平(广西肿瘤防治研究所 南宁 530021)；秦 箐(广西医科大学)；陈 明(广西医科大学)
关键词：黄芩；类黄酮；化学发光；淋巴细胞增殖
中国免疫学杂志000212 摘 要：目的：探讨黄芩类黄酮对人免疫细胞影响。方法：检测了从黄芩中纯化的3′，5，6，7-四羟基-2′，8-二甲氧基黄酮、2′，5-二羟基-6，6′，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮、(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇、黄芩甙和黄芩酮6种类黄酮成分对人多形核细胞(PMN)、单个核细胞(MNC)化学发光反应和PHA诱导淋巴细胞增殖的影响。结果：除(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇外，其它5种抑制N-Fomyl-Met-Leu-Phe(fMLP)激活的PMN和MNC或调理酵母多糖(OZ)激活的PMN产生的化学发光，也显著地抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖，在2.5×10-4mol/L浓度时抑制化学发光的抑制率可达41%～99%。抑制淋巴细胞增殖的抑制率可达89%～99%。结论：从黄芩中分离的类黄酮对PMN、MNC和淋巴细胞有不同的作用。这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有关系。也显示这些成分有可能成为新的抗炎或免疫抑制药物。
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中国图书分类号：R392.12 R28
Effects of flavonoids isolated from Scutellaria baicalensis georgi on chemiluminescence response of immunological cells and proliferation of human lymphocytes
HE Hai-Ping
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
QIN Jing
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
, 百拇医药
CHEN Ming
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
Abstract：Objective:Studied the effects of flavonoids isolated from Scutellaria baicalensis georgi on immunological cells.Methods：It was tested that the effect of 3′,5,6,7-tetrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone,2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone,5,7,8-trihydroxyflavone,(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol,which isolated from Scutellaria baicalensis georgi on chemiluminescence(CL) response of human ploymorphonuclear cells(PMN) and mononuclear cells(MNC) and PHA-induced proliferation of human lymphocytes. Results： It was found that six compounds with the exception of 2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol strongly inhibited fMLP and opsonized zymosan(OZ)-induced CL and significantly inhibited PHA-induced lymphocyte proliferation.At 2.5×10-4mol/L concentration inhibited CL by 41% to 99% and showed the significant inhibited PHA-induced lymphocyte proliferation by 89% to 99%.Conclusion：It indicated that the effects of the flavonoids on neutrophils,MNC and lymphocytes were variable,that the effects may contribute to the known anti-inflammatory and anti-allergy actions of Scutellaria baicalensis georgi and these compounds may have potential as anti-inflammatory immunosuppressive drugs.
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Key words：Scutellaria baicalensis georgi Flavonoid Chemiluminescence Lymphocyte proliferation▲
黄芩是我国和日本的一种传统的中草药，从古至今，已被用于治疗过敏性和传染性疾病[1，2]。现代的研究显示黄芩的粗提物和提取的成分具有抗真菌[3]、抗突变[4]、抗病毒[5]、抗炎症[6]、抗血管平滑肌细胞增殖[1]、抑制NAD(P)H[7]和抗肿瘤等效应[8]。为了进一步了解黄芩对免疫功能的影响，我们从黄芩提取有效成分，并检测了从黄芩中纯化的6种黄酮成分对PMN、MNC化学发光反应和PHA诱导淋巴细胞增殖的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 黄芩化学提取物的制备 3′，5，6，7-四羟基-2′，8-二甲氧基黄酮、2′，5-二羟基-6，6′，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮和(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇从黄芩中分离纯化。并经化学结构分析。黄芩甙和黄芩酮从Aldrich(德国)购买。其结构式见表1。黄芩类黄酮溶解于二甲基亚砜(DMSO)后，用含1%人白蛋白的KRB(Krebs Ringers Buffer,pH7.2)稀释。DMSO在培养基的终浓度小于0.1%(V/V)。对照试验显示DMSO在该浓度不影响淋巴细胞增殖和化学发光。
表1 6种黄芩类黄酮的化学结构
Tab.1 Chemical structures of 6 flavonoids from Scutellaria baicalensis georgi No.
3
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6
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8
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3′
6′
C2-3
1
Baicalein
OH
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Baicalin
OH
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3′,5,6,7-tetrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone,OH
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2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone
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(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol
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1.2 PMN和MNC制备 取健康人全血，枸橼酸钠抗凝，左旋糖苷沉淀，Sodium-metrizoate Ficoll(Lymphoprep,Nyegaard,Oslo,Norway)分离。残余的红细胞用低渗法去除。嗜中性粒细胞悬液纯度大于98%。MNC用非特异性酯酶染色，悬液含15%～18%的MNC。用胎酚蓝染色细胞活性大于98%。
1.3 化学发光反应 激活或非激活的PMN的化学发光产物用鲁米诺增强系统检测。使用两种激活剂调理酵母多糖(OZ)和fMLP。①OZ，10 mg酵母多糖(Sigma)、70 ml KRB和3 ml AB型血清混合，置于37℃孵育30 min后，3 000 r/min离心10 min。沉淀物重悬于KRB中(1 mg/ml)。②fMLP，溶于KRB中，使用时终浓度为10-5mol/L。
一份的细胞悬液(当用OZ作激活剂测定时，PMN的浓度为107 ml-1或MNC为2×106 ml-1，当用fMLP作激活剂时，PMN的浓度为2×106 ml-1)加等体积，浓度不同的类黄酮，37℃旋转(20 r/min)孵育30 min。取0.1 ml孵育后的PMN或MNC，0.2 ml OZ或fMLP和0.7 ml发光胺溶液(10-4mol/L)，加入3 ml聚苯乙烯小管中。将小管放于光度仪(1251-LKB， Wallac)中检测，连续记录化学发光产物，直到最大的微伏峰出现。
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1.4 PHA诱导淋巴细胞增殖 PHA诱导的淋巴细胞增殖按我室常规方法进行。简单说，单个核细胞淋巴细胞悬于含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中(Gibco Lab.美国)，浓度为6.5×105 cell/ml。取135 μl分种于96孔板中，加25 μl的PHA溶液(Murex,英国)，PHA的终浓度为75 μg/ml。37℃(5%CO2)孵育48 h。加入不同浓度的类黄酮和l μCi的3H-胸腺嘧啶(Amersham International plc,英国)，继续培养18 h。用收集仪收集细胞，干燥滤膜。用beta计数仪(Matrix96，PACKARD)记录同位素放射量，每组平行作3孔，计算胸腺嘧啶的摄入量的均值(DMP)和标准差，用统计学检验显著性差异。各种类黄酮对淋巴细胞增殖的抑制率按下公式计算：
2 结果
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2.1 类黄酮对fMLP和OZ激活的嗜中性粒细胞化学发光反应的影响 6种黄酮中的5种(1，2，3，4，5)抑制fMLP激活的PMNs产生的化学发光(见表2)。最低浓度(2.5×10-7mol/L)时的抑制率为18%～33%。在2.5×10-4 mol/L浓度时抑制率为41%～99%，奇怪的是成分3在2.5×10-4mol/L浓度时抑制率为99%，但10倍稀释后迅速降到12%。成分6即使浓度达2.5×10-4mol/L对化学发光均无影响。
表2 6种不同浓度类黄酮对fMLP或OZ激活PMN化学发光的抑制率(x±s,n=3,mol/L)
Tab.2 Percentage inhibition of various concentrations of six compounds in PMNs chemiluminescence stimulated by fMLP or OZ(x±s,n=3,mol/L) Compound
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Stimulated by OZ
Stimulated by fMLP
2.5×10-4
2.5×10-5
2.5×10-6
2.5×10-7
2.5×10-4
2.5×10-5
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Baicalein
95±0
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Baicalin
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15±4
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18±5
80±8
54±7
18±8
19±9
3′,5,6′ 7-tetrahydroxy-8′dimethoxyflavone,99±1
12±0
19±2
18±1
102±0
36±15
26±12
, 百拇医药
32±10
2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone
74±1
48±1
30±1
33±2
100±0
93±0
70±2
34±1
5,7,8-trihydroxyflavone
93±0
, 百拇医药
48±2
31±4
33±2
101±0
98±1
86±3
45±3
(2R,3R-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol
4±2
5±1
4±1
-2±2
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-9±4
-4±13
-5±8
5±6
类黄酮抑制OZ激活的PMN产生的化学发光与抑制fMLP激活的特征相似。6种类黄酮抑制OZ激活的化学发光反应的强度较fMLP弱。高浓度的成分6不抑制OZ诱导的化学发光。类黄酮抑制OZ激活的MNC产生的化学发光与抑制酵母多糖激活的PMN的特性相似。
2.2 类黄酮对PHA诱导的淋巴细胞增殖的影响 类黄酮(6×10-5～2.5×10-4mol/L)对PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制活性见图1。黄芩酮、2′，5-二羟基-6，6′，7，8-四甲氧基黄酮、5，7，8-三羟基黄酮在浓度为2.50×10-4mol/L时，显著地抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖，抑制率达89%～99%。其抑制率呈浓度依赖关系。(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇浓度为1.25×10-4mol/L时，对PHA诱导的淋巴细胞增殖无明显抑制作用。
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图1 类黄酮对PHA诱导淋巴细胞增殖的影响
Fig.1 Effects of the flavonoids on PHA-induced lymphocyte proliferation
Note:control(C),2′5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone(DT),5,7,8-trihydroxyflavone(T)，(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-Pentahydrooxyflavanonol(P),3′,5,6,7-trtrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone(TD),Baicalein(B-ein),Baicalin(B-in)
3 讨论
化学发光是中性粒细胞呼吸爆发的标志，与毒性的氧衍生物包括过氧化物、过氧化氢、羟自由基和单线态氧的形成和释放有关。本研究检测了6种从黄芩提取的化学成分对中性粒细胞的化学发光的影响。除(2R,3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇外，其余5种类黄酮均强烈地抑制OZ和fMLP诱导的中性粒细胞化学发光反应。结果表明：这些成分可作为抗炎药物或免疫抑制药物。
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从以上6种成分的研究结果，还很难阐述其构效关系，主要是研究的成分还不够多。但通过与文献资料比较[9-11]。至少有两个方面的发现：1)Taxifolin和(2R,3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇对化学发光的抑制效应完全不同，表明在B环上C3′和C4′的羟基结构有显著的抑制化学发光反应，而B环上的C2′和C6′羟基结构则无抑制作用。2)柯因(chrysin)和芹菜配质(apigenin)不抑制OZ诱导的化学发光而5，7，8-三羟基黄酮却有抑制作用，这表明A环上8-羟基对抑制化学发光反应有明显的作用。
越来越多的资料表明许多类黄酮在体外对PMN活性氧产生有抑制作用[12]以及对受激活的T淋巴细胞增殖有影响。Oberley等认为膜信号启动细胞分化时，有过氧化物、过氧化氢的形成，葡萄糖摄入增加，使环核苷酸的比率改变[13]，这是由于过氧化氢酶和过氧化物酶减少，使细胞内过氧化氢积累，最后诱导细胞分化，氧自由基直接参与触发淋巴细胞活化的起始信号。我们试验显示5种具有抑制嗜中性粒细胞化学发光反应的类黄酮也显著抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖。另一方面(2R，3R)-2′，3，5，6′，7-五羟基黄烷醇不抑制嗜中性粒细胞的化学发光反应也几乎不抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖反应。这清楚地表明：类黄酮对PHA诱导的淋巴细胞增殖抑制的不同，与抑制活性氧形成有关。因此，黄芩类黄酮抑制淋巴细胞增殖，可能是通过抑制氧自由基，继而抑制了淋巴细胞活化起始信号的传递。
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小结：从黄芩中分离的类黄酮对人嗜中性粒细胞、单个核细胞和淋巴细胞有不同的作用。3′，5，6′，7-四羟基-2′，8-二甲氧基黄酮是一种新发现的化合物，在体外具有抑制嗜中性粒细胞和单个核细胞的化学发光反应。这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有直接的关系。
感谢丹麦国家医院的Anne Asanovski、Hanne Tamstorf、Begit和丹麦皇家药学院给予的试验指导。■
①丹麦Dania奖学金资助
作者简介：贺海平，男，42岁，微生物与免疫学专业硕士，副教授，主要研究肿瘤免疫和肿瘤生化
作者单位：Ami Kharazmi(Clin Microbiol Depart，University Hospital,Denmark)
Soren Brogger Christensen(Depart Medicinal Chemistry,Royal Danish School
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Pharmacy,Denmark)
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收稿日期：1998-05-07
修回日期：1999-10-27, 百拇医药