重组人截短型胰岛素样生长因子1在大肠杆菌中的高效表达①
作者：李莹 邓鸿业 狄春辉 施群 韩文玲 马大龙
单位：李 莹(北京医科大学免疫系 北京100083)；邓鸿业(北京医科大学免疫系 北京100083)；狄春辉(北京医科大学免疫系 北京100083)；施 群(北京医科大学免疫系 北京100083)；马大龙(北京医科大学免疫系 北京100083)
关键词：人截短型胰岛素样生长因子1；大肠杆菌；高效表达
中国免疫学杂志000201 摘 要：目的:建立人截短型胰岛素样生长因子1的原核高效表达系统。方法：利用基因重组技术将人截短型胰岛素样生长因子1〔Des(1-3)IGF1〕的cDNA片段克隆到融合蛋白表达载体pMTY4中，用离子交换层析法纯化蛋白并经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射免疫检测、N-末端前16位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果：获得含人Des(1-3)IGF1基因的重组质粒，在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白，该蛋白经凝血酶消化后纯化可获得与天然型一致的人Des(1-3)IGF1。结论：该方法是获得人重组Des(1-3)IGF1的有效途径，对进一步研究Des(1-3)IGF1有重要意义。
, 百拇医药
分类号：R392.11
High-level expression of human truncated insulin-like growth factor 1 in E.coli
LI Ying
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)
DENG Hong-Ye
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)
DI Chun-Hui
, 百拇医药
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)
Abstract：Objective: To establish an efficient expression system for human truncated insulin-like growth factor 1 〔Des(1-3)IGF1〕as fusion protein in Escherichia coli(E.coli). Methods: The cDNA of Des(1-3)IGF1 was cloned into an fusion protein expression plasmid, pMTY4, using gene recombinant technique. The protein was purified by ion exchange chromatography and identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, radioimmunoassay(RIA), N-terminal amino acid sequence and biological activity. Results: A prokaryotic expression vector was constructed and the fusion protein containing MS2 polymerase fragment, thrombin recognition site and human Des(1-3)IGF1 was expressed in E.coli at high level. It was showed that the purified recombinant Des(1-3)IGF1 released from the fusion protein after digestion with thrombin was identical to the native Des(1-3)IGF1.Conclusion:This is an effective method for obtaining human recombinant Des(1-3)IGF1 and it is very important for further study of Des(1-3)IGF1.
, 百拇医药
Key words：Truncated insulin-like growth factor 1 E.coli High-level expression▲
胰岛素样生长因子1(IGF1)是70个氨基酸组成的多肽生长因子，具有胰岛素样效应和促进细胞生长的作用，对某些特定细胞有促进分化成熟的功能。Des(1-3)IGF1是体内天然存在的IGF1的截短形式，其N端缺失3个氨基酸Gly-Pro-Glu。实验证明，Des(1-3)IGF1刺激培养细胞增殖的能力较IGF1高10倍以上[1] 。国外已有通过化学合成、组织提取、真核细胞表达及大肠杆菌分泌性表达获得Des(1-3)IGF1的报道，但表达量均较低[2-5]。本文利用融合蛋白表达技术，成功地在大肠杆菌中高效表达了MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白，经过凝血酶消化、离子交换层析获得了天然型序列的Des(1-3)IGF1，为进一步研究Des(1-3)IGF1的结构与功能打下了基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌POP2136 (C600衍生株，含CI857基因，编码温度敏感的λ阻遏蛋白)，由Raidoud博士惠赠；DH5αF'IQTM 购自GIBCOL/BRL公司。
1.1.2 质粒 pGEM5zf和 pGEM3zf(+)质粒购自Promega公司；pBR322-IGF1质粒由北京医科大学心肺内分泌研究中心汤健教授惠赠；融合蛋白表达载体pMTY4为本室构建，它含有编码MS2聚合酶片段和凝血酶识别位点的基因[6]。
1.1.3 试剂 各种限制性内切酶、DNA修饰酶、核苷酸dNTP、ATP购自Promega公司、GIBCOL/BRL公司、华美公司等； WizardTM minipreps PCR product purification system and DNA purification system购自Promega公司；测序样品处理试剂盒Auto cycleTM sequencing kit购自Pharmacia公司；凝血酶购自中科院血研所；Q Sepharose XL和CM柱填料购自瑞典Pharmacia公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 人Des(1-3)IGF1原核表达质粒的构建 根据文献已公布的IGF1 cDNA序列，设计了第1对上游引物5'ACG CTC TGC GGG GCT GAG 3'和下游引物5' GTAAGCTTA AGC TGA CTT GGC AGG 3'。在下游引物中导入HindⅢ酶切识别位点(划线部分)，以pBR322-IGF1为模板，在Stratagene 9600 PCR仪上扩增，将获得的Des(1-3)IGF1 PCR产物用Klenow酶处理以切去3'突出A，并纯化它。为了在下游引物的HindⅢ酶切位点后增加保护性碱基，将pGEM5zf用EcoRV处理，并与上述纯化的PCR产物连接，利用Des(1-3)IGF1上游引物和pUC/M13 Reverse引物作为第2对扩增引物，以上述连接产物为模板，进行PCR扩增。并将PCR产物依次用Klenow 和Hind III 处理，与已用StuI和Hind III处理的pMTY4载体连接，获得pMTY4-Des(1-3)IGF1表达载体。
, 百拇医药
1.2.2 核酸序列测定 pMTY4-Des(1-3)IGF1质粒用EcoRI、HindⅢ双酶切，将释放片段克隆到pGEM3zf(+)质粒中，用ALFTM DNA Sequencer(Pharmacia biotech)测序仪测序，测序反应按操作说明进行。所用酶及其他试剂均由Pharmacia biotech提供。
1.2.3 质粒的转化、筛选、诱导及细菌包涵体的获得 按文献[7，8]所述方法进行。
1.2.4 蛋白的纯化 将初步纯化的包涵体于变性液(50 mmol/L Tris.HCl pH8.5, 8 mol/L Urea, 20 mmol/L β-巯基乙醇)中，37℃，0.5 h，高速离心(16 000 r/min 15 min)，并将离心上清用50 mmol/L Tris.HCl (pH8.5) 稀释至8～10倍体积，按5 U/mg蛋白加入凝血酶, 27℃ 17 h后，依次经过Q Sepharose XL阴离子交换层析柱和CM阳离子交换层析柱，收集各吸收峰进行Tris-Tricine缓冲系统的SDS-PAGE电泳。
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1.2.5 表达产物的放射免疫学检测(RIA) rhIGF1标准品购自Promega公司，兔抗IGF1抗血清UB3189由北卡罗来那大学 Ungerwood 和VanWyk博士通过美国糖尿病消化病肾脏病协会惠赠。 Indogen (1,3,4,6-tetrachloro-3α6α-diphenylglycoluril)购自Sigma公司，rhIGF1的碘化标记方法见文献[9]，RIA方法见文献[10]。
1.2.6 氨基酸序列分析 将纯化的蛋白样品送交中国医学科学院基础所测定N-末端前16位氨基酸。
1.2.7 生物学活性测定 以NIH3T3为检测细胞株，用Pepro Tech EC 公司的IGF1 作标准品，MTT掺入法测定生物学活性。
2 结果
2.1 Des(1-3)IGF1基因的PCR扩增 根据已设计的2对引物分别进行PCR，得到210 bp和336 bp的片段，如图1所示，同预期大小一致。
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图1 人Des(1-3)IGF1基因的2次PCR扩增结果
Fig. 1 Electrophoretic result of human Des(1-3)IGF1 gene amplified by PCR
Note:1. PCR markers：1 543，994，697，514，377，237 bp; 2. product using the first two primers; 3. product using the second two primers
2.2 pMTY4-Des(1-3)IGF1表达质粒的构建及初步鉴定 重组质粒按图2所示构建。通过转化、筛选，获得pMTY4-Des(1-3)IGF1质粒, PCR鉴定及NarI酶切鉴定都与预期结果一致(图略)。
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图2 表达质粒pMTY4-Des(1-3)IGF1的构建图谱
Fig.2 The construction scheme of expression plasmid pMTY4-Des(1-3)IGF1
2.3 pMTY4-Des(1-3)IGF1表达载体中目的基因序列分析 将pMTY4-Des(1-3)IGF1质粒中凝血酶识别位点及Des(1-3)IGF1基因克隆至载体pGEM3zf(+)中进行序列测定，分析结果与已公布的序列完全一致[2]。
2.4 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 SDS-PAGE分析结果如图3所示，工程菌pMTY4-Des(1-3)IGF1/ POP2136的主要表达产物为18.2 kD左右的分子，凝血酶消化产物分别与MS2(11 kD)和Des(1-3)IGF1(约7.2 kD)的大小一致。通过凝胶成像系统分析表明，融合蛋白表达量占菌体的30%以上；将诱导后菌体超声裂解，并用洗液(2 mol/L Urea, 50 mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA)洗涤3次后，可得纯度为80%的包涵体；凝血酶酶切效率可达95%以上；经2种离子交换柱层析所得Des(1-3)IGF1纯度可达96%以上。
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图3 表达及纯化产物的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of the products of expression and purification
Note:(A) 1. inclusion bodies of Des(1-3)IGF1 fusion protein; 2. supernatant of denatured inclusion bodies; 3. un-induced E.coli POP2136; 4. low MW protein marker：3, 6.2, 14.3, 18.4 kD; 5. pMTY4-Des(1-3)IGF1/POP2136 by temperature induction; (B) 1.fusion protein in refolding solution; 2. supernatant subjected to thrombin digestion; 3. fraction purified by Q Sepharose XL；4. fraction purified by CM column; 5. low MW protein marker same as up
, 百拇医药
2.5 蛋白的抗原性检测 将融合蛋白的复性液、纯化后Des(1-3)IGF1及MS2-GM-CSF融合蛋白用PB分别作1、20倍和5、10倍的稀释，用RIA的方法进行检测，参照标准曲线算得样品含量，表1所示。可见2种稀释样品都具有与标记IGF1竞争结合抗IGF1多克隆抗体的能力，所得数值均呈倍数关系，而所加对照MS2-GM-CSF融合蛋白却无此特点，说明此MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白和Des(1-3)IGF1的纯化产品均有IGF1 的抗原性。
表1 蛋白的抗原性检测
Tab.1 Analysis of protein's antigenity Sample
Dilution
a
Value of diluted
, http://www.100md.com
materials(pg)
b
Value of original
sample(pg)1)
a×b
MS2-Des(1-3)IGF1
Fusion protein
1
20
1 702.542
85.869
, 百拇医药 1 702.542
1 717.380
Purified
Des(1-3)IGF1
5
10
259.315
130.493
1 296.575
1 304.930
MS2-GM-CSF
Fusion protein
, 百拇医药
5
10
0
0
0
0
Note： 1)protein content in sample calculated according to standard curve
2.6 生物学活性测定 与标准品比较，我们纯化的人重组Des(1-3)IGF1在2～40 μg/ml范围显示刺激3T3 细胞生长的活性。
2.7 氨基酸序列分析 纯化的人重组Des(1-3)IGF1蛋白样品进行N-末端氨基酸序列测定，前16位氨基酸残基分别为T-L-C-G-A-E-L-V-D-A-L-Q-F-V-C-G， 与天然Des(1-3)IGF1序列完全一致。
, 百拇医药
3 讨论
胰岛素样生长因子1(IGF1)是一种作用范围广泛的生物活性因子，其受体几乎存在于所有种类的细胞中，因此临床上已将IGF1试用于多种系统疾病的治疗，其中，在生长障碍和运动神经元疾病的治疗中，由于Des(1-3)IGF1的特殊性，其与IGF结合蛋白(IGF BP)的结合力仅相当于IGF1的1%[11]，因此可克服完整型IGF1在血液中绝大部分与IGF BP结合而不发挥生理作用的弊端。
国外文献报道，完整型IGF1在原核系统的天然表达非常不稳定[12]，提示Des(1-3)IGF1的天然蛋白在大肠杆菌中可能极易降解，而且Des(1-3)IGF1的融合蛋白在大肠杆菌的分泌性表达其产量较低,本文利用pMTY4质粒构建了含Des(1-3)IGF1基因的原核表达载体，以不溶性包涵体形式表达了其融合蛋白，这样既降低了Des(1-3)IGF1对蛋白酶的敏感性，又将蛋白的表达量提高至30%。MS2和Des(1-3)IGF1之间的凝血酶识别位点(Gly Val Arg Gly Pro Arg↓)有利于Des(1-3)IGF1从融合蛋白中释放出来而去除细菌MS2聚合酶片段。总之，本文通过对蛋白变性复性、凝血酶消化和2次离子交换层析，获得高纯度、具有抗原性和生物学活性的重组Des(1-3)IGF1，此技术路线为大规模生产Des(1-3)IGF1提供了可靠的实验依据。■
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① 国家自然科学基金资助项目(39570612)
作者简介：李 莹，女，29岁，博士生
参考文献：
[1]Ballard F J, Wallace J C, Francis G L et al. Des(1-3)IGF1; a truncated form of insulin-like growth factor 1. Int J Biochem Cell Biol，1996 ;28(10):1085
[2]Bagley C J, May B L, Szabo L et al.A key functional role for the insulin-like growth factor 1 N-terminal pentapeptide. Biochem J, 1989;259(3):665
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[3]Ogasawara M, Karey K P, Marquardt H et al.Identification and purification of truncated insulin-like growth factor 1 from porcine uterus，evidence for high biological activity. Biochemistry, 1989;28:2710
[4]McKinnon P,Ross M, Wells J R et al. Expression, purification and characterization of secreted recombinant human insulin-like growth factor 1(IGF1) and the potent variant des(1-3) IGF1 in Chinese hamaster ovary cells. J Mol Endocrinol, 1991; 6(3):231
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[5]Forsberg G, Baastrup B, Brobjer M et al. Comparison of two chemical cleavage methods for preparation of a truncated form of recombinant human insulin-like growth factor 1 from a secreted fusion protein. Biofactors,1989 ;2(2):105
[6]Liu H T,Wang Y G, Zhang Y M et al. TFAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophy Res Communi, 1999; 254:203
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[7]马大龙，狄春辉, 宋泉生 et al. 人白细胞介素9 cDNA的PCR扩增及其在大肠杆菌中的表达. 北京医科大学学报， 1994；26(4)：243
[8]Kim S O, Lee Y I. High-level expression and simple purification of recombinant human insulin-like growth factor 1. J Biotechnol，1996；48(1-2):97105
[9]龚佳玲，张静霞，朱 桐 et al. 实验核医学与核药学：放射性核素标记化合物. 武汉：同济医科大学出版社，1989：96125
[10]Mohan S, Bautista C M, Herring S J et al. Development of valid methods to measure insulin-like growth factor 1 and 2 in bone cell conditional medium. Endocrinol, 1990；126:2534
, 百拇医药
[11]Walton P E, Dunshea F R, Ballard F J et al. In vitro actions of IGF analogues with poor affinities for IGFBPs: metabolic and growth effects in pigs of different ages and GH responsiveness. Progr Growth Factor Res, 1995;6:385
[12]Saito Y, Yamada H, Niwa M et al. Production and isolation of recombinant somatomedin C. J Biochem(Tokyo), 1987;101：123，134
收稿日期：1999-04-18
修回日期：1999-07-24, 百拇医药
单位：李 莹(北京医科大学免疫系 北京100083)；邓鸿业(北京医科大学免疫系 北京100083)；狄春辉(北京医科大学免疫系 北京100083)；施 群(北京医科大学免疫系 北京100083)；马大龙(北京医科大学免疫系 北京100083)
关键词：人截短型胰岛素样生长因子1；大肠杆菌；高效表达
中国免疫学杂志000201 摘 要：目的:建立人截短型胰岛素样生长因子1的原核高效表达系统。方法：利用基因重组技术将人截短型胰岛素样生长因子1〔Des(1-3)IGF1〕的cDNA片段克隆到融合蛋白表达载体pMTY4中，用离子交换层析法纯化蛋白并经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射免疫检测、N-末端前16位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果：获得含人Des(1-3)IGF1基因的重组质粒，在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白，该蛋白经凝血酶消化后纯化可获得与天然型一致的人Des(1-3)IGF1。结论：该方法是获得人重组Des(1-3)IGF1的有效途径，对进一步研究Des(1-3)IGF1有重要意义。
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分类号：R392.11
High-level expression of human truncated insulin-like growth factor 1 in E.coli
LI Ying
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)
DENG Hong-Ye
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)
DI Chun-Hui
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(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083)
Abstract：Objective: To establish an efficient expression system for human truncated insulin-like growth factor 1 〔Des(1-3)IGF1〕as fusion protein in Escherichia coli(E.coli). Methods: The cDNA of Des(1-3)IGF1 was cloned into an fusion protein expression plasmid, pMTY4, using gene recombinant technique. The protein was purified by ion exchange chromatography and identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, radioimmunoassay(RIA), N-terminal amino acid sequence and biological activity. Results: A prokaryotic expression vector was constructed and the fusion protein containing MS2 polymerase fragment, thrombin recognition site and human Des(1-3)IGF1 was expressed in E.coli at high level. It was showed that the purified recombinant Des(1-3)IGF1 released from the fusion protein after digestion with thrombin was identical to the native Des(1-3)IGF1.Conclusion:This is an effective method for obtaining human recombinant Des(1-3)IGF1 and it is very important for further study of Des(1-3)IGF1.
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Key words：Truncated insulin-like growth factor 1 E.coli High-level expression▲
胰岛素样生长因子1(IGF1)是70个氨基酸组成的多肽生长因子，具有胰岛素样效应和促进细胞生长的作用，对某些特定细胞有促进分化成熟的功能。Des(1-3)IGF1是体内天然存在的IGF1的截短形式，其N端缺失3个氨基酸Gly-Pro-Glu。实验证明，Des(1-3)IGF1刺激培养细胞增殖的能力较IGF1高10倍以上[1] 。国外已有通过化学合成、组织提取、真核细胞表达及大肠杆菌分泌性表达获得Des(1-3)IGF1的报道，但表达量均较低[2-5]。本文利用融合蛋白表达技术，成功地在大肠杆菌中高效表达了MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白，经过凝血酶消化、离子交换层析获得了天然型序列的Des(1-3)IGF1，为进一步研究Des(1-3)IGF1的结构与功能打下了基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌POP2136 (C600衍生株，含CI857基因，编码温度敏感的λ阻遏蛋白)，由Raidoud博士惠赠；DH5αF'IQTM 购自GIBCOL/BRL公司。
1.1.2 质粒 pGEM5zf和 pGEM3zf(+)质粒购自Promega公司；pBR322-IGF1质粒由北京医科大学心肺内分泌研究中心汤健教授惠赠；融合蛋白表达载体pMTY4为本室构建，它含有编码MS2聚合酶片段和凝血酶识别位点的基因[6]。
1.1.3 试剂 各种限制性内切酶、DNA修饰酶、核苷酸dNTP、ATP购自Promega公司、GIBCOL/BRL公司、华美公司等； WizardTM minipreps PCR product purification system and DNA purification system购自Promega公司；测序样品处理试剂盒Auto cycleTM sequencing kit购自Pharmacia公司；凝血酶购自中科院血研所；Q Sepharose XL和CM柱填料购自瑞典Pharmacia公司。
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1.2 方法
1.2.1 人Des(1-3)IGF1原核表达质粒的构建 根据文献已公布的IGF1 cDNA序列，设计了第1对上游引物5'ACG CTC TGC GGG GCT GAG 3'和下游引物5' GTAAGCTTA AGC TGA CTT GGC AGG 3'。在下游引物中导入HindⅢ酶切识别位点(划线部分)，以pBR322-IGF1为模板，在Stratagene 9600 PCR仪上扩增，将获得的Des(1-3)IGF1 PCR产物用Klenow酶处理以切去3'突出A，并纯化它。为了在下游引物的HindⅢ酶切位点后增加保护性碱基，将pGEM5zf用EcoRV处理，并与上述纯化的PCR产物连接，利用Des(1-3)IGF1上游引物和pUC/M13 Reverse引物作为第2对扩增引物，以上述连接产物为模板，进行PCR扩增。并将PCR产物依次用Klenow 和Hind III 处理，与已用StuI和Hind III处理的pMTY4载体连接，获得pMTY4-Des(1-3)IGF1表达载体。
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1.2.2 核酸序列测定 pMTY4-Des(1-3)IGF1质粒用EcoRI、HindⅢ双酶切，将释放片段克隆到pGEM3zf(+)质粒中，用ALFTM DNA Sequencer(Pharmacia biotech)测序仪测序，测序反应按操作说明进行。所用酶及其他试剂均由Pharmacia biotech提供。
1.2.3 质粒的转化、筛选、诱导及细菌包涵体的获得 按文献[7，8]所述方法进行。
1.2.4 蛋白的纯化 将初步纯化的包涵体于变性液(50 mmol/L Tris.HCl pH8.5, 8 mol/L Urea, 20 mmol/L β-巯基乙醇)中，37℃，0.5 h，高速离心(16 000 r/min 15 min)，并将离心上清用50 mmol/L Tris.HCl (pH8.5) 稀释至8～10倍体积，按5 U/mg蛋白加入凝血酶, 27℃ 17 h后，依次经过Q Sepharose XL阴离子交换层析柱和CM阳离子交换层析柱，收集各吸收峰进行Tris-Tricine缓冲系统的SDS-PAGE电泳。
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1.2.5 表达产物的放射免疫学检测(RIA) rhIGF1标准品购自Promega公司，兔抗IGF1抗血清UB3189由北卡罗来那大学 Ungerwood 和VanWyk博士通过美国糖尿病消化病肾脏病协会惠赠。 Indogen (1,3,4,6-tetrachloro-3α6α-diphenylglycoluril)购自Sigma公司，rhIGF1的碘化标记方法见文献[9]，RIA方法见文献[10]。
1.2.6 氨基酸序列分析 将纯化的蛋白样品送交中国医学科学院基础所测定N-末端前16位氨基酸。
1.2.7 生物学活性测定 以NIH3T3为检测细胞株，用Pepro Tech EC 公司的IGF1 作标准品，MTT掺入法测定生物学活性。
2 结果
2.1 Des(1-3)IGF1基因的PCR扩增 根据已设计的2对引物分别进行PCR，得到210 bp和336 bp的片段，如图1所示，同预期大小一致。
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图1 人Des(1-3)IGF1基因的2次PCR扩增结果
Fig. 1 Electrophoretic result of human Des(1-3)IGF1 gene amplified by PCR
Note:1. PCR markers：1 543，994，697，514，377，237 bp; 2. product using the first two primers; 3. product using the second two primers
2.2 pMTY4-Des(1-3)IGF1表达质粒的构建及初步鉴定 重组质粒按图2所示构建。通过转化、筛选，获得pMTY4-Des(1-3)IGF1质粒, PCR鉴定及NarI酶切鉴定都与预期结果一致(图略)。
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图2 表达质粒pMTY4-Des(1-3)IGF1的构建图谱
Fig.2 The construction scheme of expression plasmid pMTY4-Des(1-3)IGF1
2.3 pMTY4-Des(1-3)IGF1表达载体中目的基因序列分析 将pMTY4-Des(1-3)IGF1质粒中凝血酶识别位点及Des(1-3)IGF1基因克隆至载体pGEM3zf(+)中进行序列测定，分析结果与已公布的序列完全一致[2]。
2.4 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 SDS-PAGE分析结果如图3所示，工程菌pMTY4-Des(1-3)IGF1/ POP2136的主要表达产物为18.2 kD左右的分子，凝血酶消化产物分别与MS2(11 kD)和Des(1-3)IGF1(约7.2 kD)的大小一致。通过凝胶成像系统分析表明，融合蛋白表达量占菌体的30%以上；将诱导后菌体超声裂解，并用洗液(2 mol/L Urea, 50 mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA)洗涤3次后，可得纯度为80%的包涵体；凝血酶酶切效率可达95%以上；经2种离子交换柱层析所得Des(1-3)IGF1纯度可达96%以上。
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图3 表达及纯化产物的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of the products of expression and purification
Note:(A) 1. inclusion bodies of Des(1-3)IGF1 fusion protein; 2. supernatant of denatured inclusion bodies; 3. un-induced E.coli POP2136; 4. low MW protein marker：3, 6.2, 14.3, 18.4 kD; 5. pMTY4-Des(1-3)IGF1/POP2136 by temperature induction; (B) 1.fusion protein in refolding solution; 2. supernatant subjected to thrombin digestion; 3. fraction purified by Q Sepharose XL；4. fraction purified by CM column; 5. low MW protein marker same as up
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2.5 蛋白的抗原性检测 将融合蛋白的复性液、纯化后Des(1-3)IGF1及MS2-GM-CSF融合蛋白用PB分别作1、20倍和5、10倍的稀释，用RIA的方法进行检测，参照标准曲线算得样品含量，表1所示。可见2种稀释样品都具有与标记IGF1竞争结合抗IGF1多克隆抗体的能力，所得数值均呈倍数关系，而所加对照MS2-GM-CSF融合蛋白却无此特点，说明此MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白和Des(1-3)IGF1的纯化产品均有IGF1 的抗原性。
表1 蛋白的抗原性检测
Tab.1 Analysis of protein's antigenity Sample
Dilution
a
Value of diluted
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materials(pg)
b
Value of original
sample(pg)1)
a×b
MS2-Des(1-3)IGF1
Fusion protein
1
20
1 702.542
85.869
, 百拇医药 1 702.542
1 717.380
Purified
Des(1-3)IGF1
5
10
259.315
130.493
1 296.575
1 304.930
MS2-GM-CSF
Fusion protein
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5
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0
0
0
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Note： 1)protein content in sample calculated according to standard curve
2.6 生物学活性测定 与标准品比较，我们纯化的人重组Des(1-3)IGF1在2～40 μg/ml范围显示刺激3T3 细胞生长的活性。
2.7 氨基酸序列分析 纯化的人重组Des(1-3)IGF1蛋白样品进行N-末端氨基酸序列测定，前16位氨基酸残基分别为T-L-C-G-A-E-L-V-D-A-L-Q-F-V-C-G， 与天然Des(1-3)IGF1序列完全一致。
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3 讨论
胰岛素样生长因子1(IGF1)是一种作用范围广泛的生物活性因子，其受体几乎存在于所有种类的细胞中，因此临床上已将IGF1试用于多种系统疾病的治疗，其中，在生长障碍和运动神经元疾病的治疗中，由于Des(1-3)IGF1的特殊性，其与IGF结合蛋白(IGF BP)的结合力仅相当于IGF1的1%[11]，因此可克服完整型IGF1在血液中绝大部分与IGF BP结合而不发挥生理作用的弊端。
国外文献报道，完整型IGF1在原核系统的天然表达非常不稳定[12]，提示Des(1-3)IGF1的天然蛋白在大肠杆菌中可能极易降解，而且Des(1-3)IGF1的融合蛋白在大肠杆菌的分泌性表达其产量较低,本文利用pMTY4质粒构建了含Des(1-3)IGF1基因的原核表达载体，以不溶性包涵体形式表达了其融合蛋白，这样既降低了Des(1-3)IGF1对蛋白酶的敏感性，又将蛋白的表达量提高至30%。MS2和Des(1-3)IGF1之间的凝血酶识别位点(Gly Val Arg Gly Pro Arg↓)有利于Des(1-3)IGF1从融合蛋白中释放出来而去除细菌MS2聚合酶片段。总之，本文通过对蛋白变性复性、凝血酶消化和2次离子交换层析，获得高纯度、具有抗原性和生物学活性的重组Des(1-3)IGF1，此技术路线为大规模生产Des(1-3)IGF1提供了可靠的实验依据。■
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① 国家自然科学基金资助项目(39570612)
作者简介：李 莹，女，29岁，博士生
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收稿日期：1999-04-18
修回日期：1999-07-24, 百拇医药