黑色素瘤B16细胞热休克蛋白-抗原肽复合物(HAC)的提纯及其抑瘤作用
作者：杨英 付士波 李秀娟 陈沙力 龚守良 李修义
单位：杨英(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)；付士波(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)；李秀娟(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)；陈沙力(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)
关键词：
中国免疫学杂志000414 中国图书分类号 R73-35
热休克蛋白(Heat shock protein, HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核真核生物中的蛋白质，具有携带特异性抗原的作用[1]。从肿瘤组织中提取的HAC(HSP-antigen peptide complex)具有肿瘤疫苗的作用，能特异性地 抑制同种肿瘤细胞的攻击。本实验从恶性度较高的黑色素瘤B16细胞胞浆中提取并纯化了HAC ，通过制备性凝胶电泳获得的不同分子量的蛋白凝胶分别免疫小鼠，观察其抑瘤作用，为制 备肿瘤疫苗提供了实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物及细胞株 C57BL/6J纯系小鼠, 雌性，体重18±2 g , 健 康。购自白求恩医科大学实验动物部。黑色素瘤B16 细胞由日本北里大学惠赠。
1.2 B16细胞胞浆蛋白的提取 制备B16细胞单细胞悬液，将离心沉淀所 得的细胞用裂解液[0.05 mol/L Tris-HCl (pH 7.2), 含0.5 mol/L NaCl, 0.1 mmo l/L PM SF, 0.1% Aprotinin] 洗涤1次，离心去上清后，用1倍于细胞体积的上述裂解液匀浆，胞 膜破碎后离心吸出上清。
1.3 Sephacryl S-200 凝胶过滤和SDS-PAGE凝胶电泳[2] 胞浆蛋白经 Sephacryl S-200凝胶过滤和10% SDS-PAGE凝胶电泳确定各管蛋白的分子量后，选取含60 ～97 kD的蛋白管进行制备性凝胶电泳，电泳后切下60、75和97 kD凝胶蛋白带。
, 百拇医药
1.4 特异性CTL诱导及抑瘤作用 将60、75和97 kD凝胶蛋白带以1:1与 福氏不完全佐剂混合，匀浆至乳化状态，免疫小鼠2次，0.1 ml/次，1次/w。分别进行体 内和体外杀伤活性检测。
2 结果
2.1 B16 HAC体内抑瘤作用 HAC60和HAC97免疫组的肿瘤发生率降低(分 别为62.5%和75.0%)， HAC60、HAC75和HAC97免疫组的肿瘤平均出现时间明显迟于对照组1.5 ～6 d(P<0.05或P<0.01)。HAC60和HAC97免疫组的肿瘤生长速度比对照组和 空白凝胶免疫组缓慢，HAC75组则无统计学差异。
2.2 B16 HAC 体外抑瘤作用 纯化的HAC60、HAC75和HAC97免疫小 鼠的 脾细胞与B16细胞混合接种小鼠后，肿瘤发生率分别降低为33.3%、57.1%和20.0%(HAC6 0和HAC 97组，P<0.05)；肿瘤平均出现时间较对照组延迟2.1～9.7 d， HAC60和HAC97组肿瘤 生长速度比对照组和空白凝胶免疫组缓慢，HAC75组无变化。
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3 讨论
HSP作为分子伴侣在肿瘤免疫中发挥着重要作用。当细胞内蛋白抗原酶解成短肽与HSP结 合后，被转运至粗面内质网，与MHC I类分子结合形成HAC共同表达于细胞表面，为CD8+的 特异性T淋巴细胞所识别，进而攻击肿瘤细胞[3]。Blachere等从M eth A肉瘤中同时提取HSP70、HSP90和gp96 3种HSPs免疫小鼠，具有抵抗同种肿瘤攻击的能 力[4]。本实验从黑色素瘤B16细胞胞浆中提取并通过制备性SDS-PAGE电泳纯化了B16 HAC60、HA C75和HAC97，分别免疫小鼠，用体内和体外两种方法检测其活性。结果表明，HAC60和HAC97 免疫组与对照组比较小鼠 的肿瘤发生率降低，肿瘤平均出现时间延迟及肿瘤生长速度减慢。HAC75免疫组在体内实验 中小鼠的肿瘤平均出现时间延迟，而其他指标未见明显变化，这可能与HAC75电泳带含有某 种促进肿瘤生长的同一分子量的蛋白有关。因此，纯化的HAC60、HAC75和HAC97免疫小鼠后 不同程度地抑制移植肿瘤生长。肿瘤组织的HAC可能结合了多种肿瘤抗原肽，免疫机体后可 以活化多个CTL克隆，实现对同一肿瘤内所有肿瘤细胞的杀伤作用[3]。因而， 从肿瘤中提取并纯化HAC为临床制备肿瘤疫苗提供了新思路。
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作者简介：杨英，女，27岁，博士生，主要研究辐射肿瘤学
龚守良(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)
李修义(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)
4 参考文献
1，Gething M J, Sambrook J. Protein folding in the cell. Nature, 1992; 355: 33
2，刘毓秀，程桂芳译. 蛋白质的凝胶电泳实践方法. 北京：科学出版社，1994：18-24
3，黄兰青, 张友会. 肿瘤免疫治疗的新策略——肿瘤肽疫苗. 国外医学.肿瘤学分册 , 1996; 23(2)：92
4，Blachere N E, Udono H, Janetazki S et al. Heat shock protein vaccines a gainst cancer. J Immunotheraphy, 1993; 14:352
[收稿1999-07-24 修回1999-10-21], 百拇医药
单位：杨英(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)；付士波(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)；李秀娟(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)；陈沙力(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)
关键词：
中国免疫学杂志000414 中国图书分类号 R73-35
热休克蛋白(Heat shock protein, HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核真核生物中的蛋白质，具有携带特异性抗原的作用[1]。从肿瘤组织中提取的HAC(HSP-antigen peptide complex)具有肿瘤疫苗的作用，能特异性地 抑制同种肿瘤细胞的攻击。本实验从恶性度较高的黑色素瘤B16细胞胞浆中提取并纯化了HAC ，通过制备性凝胶电泳获得的不同分子量的蛋白凝胶分别免疫小鼠，观察其抑瘤作用，为制 备肿瘤疫苗提供了实验依据。
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1 材料与方法
1.1 动物及细胞株 C57BL/6J纯系小鼠, 雌性，体重18±2 g , 健 康。购自白求恩医科大学实验动物部。黑色素瘤B16 细胞由日本北里大学惠赠。
1.2 B16细胞胞浆蛋白的提取 制备B16细胞单细胞悬液，将离心沉淀所 得的细胞用裂解液[0.05 mol/L Tris-HCl (pH 7.2), 含0.5 mol/L NaCl, 0.1 mmo l/L PM SF, 0.1% Aprotinin] 洗涤1次，离心去上清后，用1倍于细胞体积的上述裂解液匀浆，胞 膜破碎后离心吸出上清。
1.3 Sephacryl S-200 凝胶过滤和SDS-PAGE凝胶电泳[2] 胞浆蛋白经 Sephacryl S-200凝胶过滤和10% SDS-PAGE凝胶电泳确定各管蛋白的分子量后，选取含60 ～97 kD的蛋白管进行制备性凝胶电泳，电泳后切下60、75和97 kD凝胶蛋白带。
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1.4 特异性CTL诱导及抑瘤作用 将60、75和97 kD凝胶蛋白带以1:1与 福氏不完全佐剂混合，匀浆至乳化状态，免疫小鼠2次，0.1 ml/次，1次/w。分别进行体 内和体外杀伤活性检测。
2 结果
2.1 B16 HAC体内抑瘤作用 HAC60和HAC97免疫组的肿瘤发生率降低(分 别为62.5%和75.0%)， HAC60、HAC75和HAC97免疫组的肿瘤平均出现时间明显迟于对照组1.5 ～6 d(P<0.05或P<0.01)。HAC60和HAC97免疫组的肿瘤生长速度比对照组和 空白凝胶免疫组缓慢，HAC75组则无统计学差异。
2.2 B16 HAC 体外抑瘤作用 纯化的HAC60、HAC75和HAC97免疫小 鼠的 脾细胞与B16细胞混合接种小鼠后，肿瘤发生率分别降低为33.3%、57.1%和20.0%(HAC6 0和HAC 97组，P<0.05)；肿瘤平均出现时间较对照组延迟2.1～9.7 d， HAC60和HAC97组肿瘤 生长速度比对照组和空白凝胶免疫组缓慢，HAC75组无变化。
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3 讨论
HSP作为分子伴侣在肿瘤免疫中发挥着重要作用。当细胞内蛋白抗原酶解成短肽与HSP结 合后，被转运至粗面内质网，与MHC I类分子结合形成HAC共同表达于细胞表面，为CD8+的 特异性T淋巴细胞所识别，进而攻击肿瘤细胞[3]。Blachere等从M eth A肉瘤中同时提取HSP70、HSP90和gp96 3种HSPs免疫小鼠，具有抵抗同种肿瘤攻击的能 力[4]。本实验从黑色素瘤B16细胞胞浆中提取并通过制备性SDS-PAGE电泳纯化了B16 HAC60、HA C75和HAC97，分别免疫小鼠，用体内和体外两种方法检测其活性。结果表明，HAC60和HAC97 免疫组与对照组比较小鼠 的肿瘤发生率降低，肿瘤平均出现时间延迟及肿瘤生长速度减慢。HAC75免疫组在体内实验 中小鼠的肿瘤平均出现时间延迟，而其他指标未见明显变化，这可能与HAC75电泳带含有某 种促进肿瘤生长的同一分子量的蛋白有关。因此，纯化的HAC60、HAC75和HAC97免疫小鼠后 不同程度地抑制移植肿瘤生长。肿瘤组织的HAC可能结合了多种肿瘤抗原肽，免疫机体后可 以活化多个CTL克隆，实现对同一肿瘤内所有肿瘤细胞的杀伤作用[3]。因而， 从肿瘤中提取并纯化HAC为临床制备肿瘤疫苗提供了新思路。
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作者简介：杨英，女，27岁，博士生，主要研究辐射肿瘤学
龚守良(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)
李修义(白求恩医科大学 卫生部放射生物重点实验室，长春 130021)
4 参考文献
1，Gething M J, Sambrook J. Protein folding in the cell. Nature, 1992; 355: 33
2，刘毓秀，程桂芳译. 蛋白质的凝胶电泳实践方法. 北京：科学出版社，1994：18-24
3，黄兰青, 张友会. 肿瘤免疫治疗的新策略——肿瘤肽疫苗. 国外医学.肿瘤学分册 , 1996; 23(2)：92
4，Blachere N E, Udono H, Janetazki S et al. Heat shock protein vaccines a gainst cancer. J Immunotheraphy, 1993; 14:352
[收稿1999-07-24 修回1999-10-21], 百拇医药