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编号:10258226
Western印迹杂交分析p53蛋白在人鼻咽癌中的表达及其意义
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 2000年第4期
     作者:郑美莲 区宝祥 龙江斌 邓满泉 陈丽珍 梁启万 李辉梅

    单位:郑美莲(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060);区宝祥(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060);龙江斌(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060);邓满泉(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060)

    关键词:鼻咽肿瘤;p53基因;蛋白质印迹法

    中国免疫学杂志000412 摘 要 目的:检测104例鼻咽癌活检组织和8例鼻咽粘膜慢性炎症组织 中p53蛋白的表达。方法:采用Western印迹法结合免疫沉淀技术。结果:104例鼻咽癌活检组织中有12例出现突变型p53蛋白表达,突变检出率 为11.54%(12/104);8例鼻咽慢性炎症活检组织中未见p53蛋白的异常表达(0/8);鼻咽癌病 人中人IgA/VCA抗体滴度≥1∶160者,p53蛋白突变检出率为11.80%(11/93),IgA/VCA抗 体 滴度≤1∶80者,p53蛋白突变检出率为9.10%(1/11),IgA/EA抗体滴度阳性者,p53蛋白突变 检 出率为14.10%(11/78),IgA/EA抗体滴度阴性者,p53蛋白突变检出率为3.80%(1/26);12例p 53蛋白异常表达 的鼻咽癌病人中有2例复发。结论:突变型p53基因产物的表达与鼻咽癌 EB病毒早期抗原有关,p53基因在鼻咽癌中可能发挥一定的作用。
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    中国图书分类号 R739.63

    Western blot analysis of p53 protein expressio n in human nasopharyngeal carcinoma

    ZHENG Mei-Lian OU Bao-Xiang LONG Jiang-Bin

    (Canc er Institute,Sun Yet-Sen University of Medical Science,Guangzhou 510060)

    Abstract Objective:To investigate the role of p53 protei n expression in nasopharyngeal carcinoma.Methods:104 human primary nasopharyngeal carcinoma and 8 nasopharyngeal chronic inflammation biops y were examined for p53 protein expression with Western blot hybridization and i mmunopercipitation techniques.Results:The 104 nasopharyng eal carcinoma biopsy 12(11.54%) showed abnormal expression of p53 protein.Abnorm al expression of p53 protein was not found in 8 biopsy of the nasopharyngeal chr onic inflammation(0/8). The protein abnormal of p53 gene were 11.80%(11/93) and 9 .10%(1/11) in nasopharyngeal carcinoma with EBV-IgA/VCA≥1∶160 and EBV-IgA/VC A ≤1∶80, respectively. The p53 protein positive rates of mutation-type were 14. 10% (11/78) and 3.80%(1/26),respectively in nasopharngeal carcinoma with EBV-IgA/EA positive and negative. 2 patients were found the cancer recurrence in 12 patien ts o f p53 protein abnormal expression.Conclusion:p53 protein e xpression may play a role in nasopharyngeal carcinoma.
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    Key words Nasopharyngeal neoplasms p53 genes Western blo t

    p53基因具有双重性,即野生型(wild type)p53 基因具有抑癌作用,突变型(mutant type)p 53 基因为致癌基因。p53基因结构改变及表达异常是人类肿瘤中常见的现象之一[1] 。p53蛋白在鼻咽癌中的研究报道不多,而且迄今为止,p53蛋白在鼻咽癌的研究大多采用 免疫组织化学的方法。我们采用Western blot结合免疫沉淀分子生物学技术检测p53蛋白 在鼻咽癌中的表达,旨在探讨p53蛋白表达与鼻咽癌的关系及其临床意义。

    1 材料与方法

    1.1 标本来源 鼻咽组织采自本院确诊为鼻咽 癌的初诊患者鼻咽纤维镜的检测标本。104例活检标本病理检查确诊为鼻咽癌,取8例鼻咽粘 膜慢性炎症标本作为对照。
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    1.2 组织蛋白的提取 鼻咽癌活检组织取出后,在冰浴下用玻璃研磨器磨 碎标本,然后加入细胞裂解液裂解细胞,超声波处理(7 micro 30 s 4次,每次间隔1 min) 离心,取上清,测定总蛋白含量。

    1.3 免疫沉淀 用Oncogene Science公司p53单克隆抗体,根据抗体说明进 行标本处理。p53抗体15 μl与细胞裂解物1 ml进行免疫沉淀。p53抗体是一种与Protein A ag arose结合的小鼠抗p53单克隆抗体,可把裂解物中的p53抗原沉淀,形成抗原抗体复合物。p 53靶蛋白沉淀后,弃上清液,沉淀物经洗涤后加入强阴离子去污剂SDS加样缓冲液(sample b uffer),使靶蛋白与抗体解离,然后用Western印迹法检出特异的p53蛋白。

    1.4 Western blot 已溶解于加样缓冲液的沉淀物在15% SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离,电转移至硝酸纤维膜上,用1∶30稀释p53抗体(小鼠单克隆抗体)进行Western blot,然后用1∶300稀释的二抗(碱性磷酸酶偶联的羊抗小鼠IgG)处理,采用DAB显色试剂盒 检测、摄影。
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    2 结果

    2.1 鼻咽癌组织Western blot结果 104例鼻咽癌检测标本中,有12例出现 p53蛋白表达异常的条带(见图1),突变检出率为11.54%。8例鼻咽慢性炎症检测标本中p53蛋 白表达均未见异常,突变检出率为0。

    图1 鼻咽癌组织Western blot结果

    Fig.1 Western blot analysis of p53 proteins

    in NPC cell biopsis Note:M:mar ker;1-9: NPC biopsis;

    3,4,6,8,9:abnormal expression of p53 protein;10:normal control
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    2.2 鼻咽癌p53蛋白的异常表达与病理类型和临床分期的关系 104例鼻咽 癌标本中,除了2例鼻咽未分化癌,1例泡状核细胞癌,其余均为鼻咽低分化鳞癌。12例出现 p53蛋白异常表达的标本,病理诊断均为鼻咽低分化鳞癌。104例鼻咽癌标本中包括了Ⅰ~Ⅳ 期的病人。出现p53蛋白异常表达的12例标本中Ⅰ期为1例,Ⅱ期3例,Ⅲ期5例,Ⅳ期2例, 另外有1例分期不明。

    2.3 p53蛋白异常表达与EB病毒感染的关系 104例鼻咽癌病人中, EB病毒壳抗原免疫球蛋白A(IgA/VCA) 抗体滴度≥1∶160有93例,其中p53蛋白表达异常者有11例,突变检出率为11.80%; IgA/VCA抗体滴度≤1∶80有11人,其中p53表达异常者1例,突变检出 率为9.10%。104例鼻咽癌检测标本中,IgA/EA阳性者有78例,其中p53蛋白异常者有11例, 占14.10%,IgA/EA阴性者26例,其中p53蛋白表达异常者1例,占3.80%。

    2.4 鼻咽癌p53蛋白表达异常与预后的关系 本文研究的104例鼻 咽癌病人中,发现有2例病人复发,这2例病人均为p53蛋白表达异常,其中1例为Ⅱ期病人,放疗结 束后14个月复发,另外1例为Ⅳ期病人,放疗结束后10个月复发。追踪观察病人3~4年 所研究的这104例鼻咽癌病人均未发现有肿瘤转移。
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    3 讨论

    鼻咽癌的发生、发展与EB病 毒感染相关,为了解p53基因与EB病毒的关系,本文研究了鼻咽癌病人p53表达产物与EBV 感染的关系。研究表明93例IgA/VCA抗体滴度≥1∶160的病人中有11例存在突变型p53蛋白表 达,突变检出率为11.80%,11例IgA/VCA抗体滴度≤1∶80病人中检出1例存在突变型p53蛋白 表达,突变检出率为9.10%。IgA/EA抗体滴度阳性的鼻咽癌病人中p53蛋白突变检出率为14.1 0%,而IgA/EA抗体滴度阴性的鼻咽癌病人中p53蛋白突变检出率为3.80%。 因为EB病毒早期抗原(EA)是EB病毒周期的早期产物,EA抗体能反映EB 病毒在体内感染的活动程度。本文检出的突变性p53蛋白绝大多数是EA抗体阳性鼻咽癌病人 。结果还表明p53蛋白表达异常者大多数是IgA/VCA抗体滴度高,而且是IgA/EA抗体滴度阳性 的病人。迄今已发现许多恶性肿瘤存在p53基因突变,但不同的肿瘤有不同的突变率[2 ,3]。本文检测104例鼻咽癌 活检标本中,发现有12例鼻咽癌标本显现突变型p53蛋白条带,但对临床怀疑鼻咽癌、病理 确诊为鼻咽粘膜慢性炎症病人标本进行了p53蛋白检测未发现有异常表达现象。研究结果表 明p53蛋白的异常表达只出现在鼻咽癌病人,鼻咽粘膜慢性炎症的非癌病人则未见异常,而 且鼻咽癌不仅在晚期(Ⅲ、Ⅳ期),在早期(Ⅰ、Ⅱ期)也有p53蛋白异常表达存在。但从初步 的实验结果看,鼻咽癌p53蛋白的异常表达多见于恶性程度较高、分期较晚、IgA/VCA高滴度 和IgA/EA阳性的病例,但尚未发现p53蛋白异常表达与病程进展的关系。有文献报道鼻咽癌 中p53突变率小于10.00%[4]。本文所研究的104例鼻咽癌均为原发癌,p53蛋白突变 检 出率(12/104)为11.54%,结果相近。我们的试验采用Western blot结合免疫沉淀技术检 出的 蛋白条带均为突变型p53蛋白,此法检测基因表达产物较为特异和客观。特别值得注意的是 ,在我们所检测的104例鼻咽癌活检组织中,经过3~4年追踪观察发现有2例病人鼻咽癌复发 ,而且2例病人均为p53蛋白的表达异常者,其中1例为Ⅱ期病人,IgA/VCA为1∶1 280,放疗 治愈后16个月复发,另1例为Ⅳ期病人,IgA/VCA为1∶320,放疗治愈后10个月复发,其余 p53蛋白的表达未见异常的鼻咽癌病例均未发现有复发现象,表明p53基因突变可能与鼻咽癌 预后有一定关系。上述结果提示,鼻咽癌发生、发展过程中,鼻咽部从癌前病变到癌症,发 生了一系列的病理变化,从分子生物学水平分析,p53基因表达产物也发生了一定的变化, 说明p53基因在鼻咽癌中可能发挥一定作用。
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    本课题为美国中华医学基金会(CMB)赞助(No.90-529)

    作者简介:郑美莲, 女, 54岁,副研究员

    陈丽珍(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060)

    梁启万(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060)

    李辉梅(中山医科大学肿瘤防治中心,广州 510060)

    4 参考文献

    1,Hollstein M,Sidransky D, Vogestein B et al. p53 mut ation in human cancer. Science,1990;253(5019):491

    2,Gimenez-Conti I B, Collet A M,Lanfranchi H et al. p53 Rb a nd cyclin D1 expression in human oral verrucous carcinomas. Cancer,1996;78(1):17
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    3,Gan H, Wang L A,Zhou Q et al. p53 tumor suppressor gene mutati o n early esophageal precancerous lesions and carcinoma among high-risk populatio n in henan China. Cancer Res,1994;54(16):4342

    4,Sun Y,Hegamyer G H,Cheng Y J et al. An infrequent point mutatio n of the p53 gene in human nasopharyngeal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA,1992 ;89(14):6516

    [收稿1999-03-02], 百拇医药