Ku70基因导入人肺癌细胞后的表达及意义
作者：张捷 安继红 杨贵贞 大森繁成 簁口裕一 栗山簂之
单位：张捷(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；安继红(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；杨贵贞(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；大森繁成(日本千叶大学医学部肺癌研究中心)；簁口裕一(日本千叶大学医学部肺癌研究中心)；栗山簂之(日本千叶大学医学部肺癌研究中心)
关键词：Ku70基因；人肺癌细胞；表达
中国免疫学杂志000411 摘 要 目的：研究Ku70基因导入人肺癌细胞(LCA)后的表达及意义 。方法：构建重组的正义和反义Ku70基因表达质粒载体分别导入LCA细 胞。结果：用Northern印迹杂交法证明Ku70正义、反义基因均可在LC A的mRNA中得到表达， 用Western-blotting法去证明细胞中只有导入正义Ku70基因的蛋白表达，而导入反义Ku70 基因的人肺癌细胞，无正义Ku70蛋白表达，结论：正义Ku70基因的表达 可以调节DNA的修复，反义Ku70基因的表达可以增强肿瘤细胞对放射线照 射的敏感性。这些表达特性可为我们治疗肿瘤提供新的分子生物学手段。
, 百拇医药
中国图书分类号 R73
The expression and its specification of the Ku70 gene transferred into a human's lung carcinoma cell line
ZHANG Jie AN Ji-Hong YANG Gui-Zhen
(Second Teaching Hospital，Norman Bethune University of Medicine,Changchun 130041)
Abstract Objective：To study the expression and its speci fication of the Ku70 gene transferred into a human's lung carcinoma cell line (LCA). Met hods：Const ructing recombinant sense or antisense Ku70 expression vectors (Ku70/pCAGGS) an d transferring into LCA. Results：Those Ku70 genes were ex pressed in the mRNA o f the LCA cell line by Northern-blotting . Only the sense Ku70 gene was expres sed in the protein of the LCA transferred the sense Ku70 gene, but the sense Ku7 0 gene wasn't expressed in protein of the LCA transferred antisense Ku70 gene b y Western-blotting.Conclusion：The sense Ku70 gene would regulate to repair.The antisense Ku70 gene increased the LCA 's radiosensitivity DNA. They may offer a new molecular biology way to treat cancer.
, 百拇医药
Key words Ku70 gene Human's lung carcinoma cell Expression
Ku70基因是DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的亚单位之一，分子量为70 kD， 它与Ku80和DNA-PK的催化亚单位(DNA-PKcs)共同组成DNA-PK。近来的研究已证明，Ku70 和Ku 80基因能补充活化DNA-PKcs，参与DNA双链缺口的修复和V(D)J重组，人类Ku70基因位于 染色体的22q33，Ku80基因位于染色体的2q33～34，为人鼠同源基因[1]。近年来，K u基因对DNA -PKcs的调节研究颇受关注，是因为DNA-PK是磷酸化的蛋白质，包括肿瘤 抑制蛋白的P53，转 录因子(原癌基因)，c-Jun，C-Fos等等，特别在调节DNA转录、复制、修复中起重 要作用[2]。不难看出，上述研究与肿瘤的发病机理，基因诊断，治疗密切相关，所以，我们试图通 过Ku70正义基因、Ku70反义基因的肺癌细胞导入及表达为研究肿瘤 发病的机理和探索基因诊断治疗新方法奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 细胞系 人肺癌腺癌细胞系(LCA)日本千叶大学医学部肺癌研 究中心提供。
1.2 正义DNA，Ku70片段：3’末端的Ku70(600 bp)基因，反义DN A，Ku70片段：5’末端的Ku70(600 bp)基因，见参考文献[3，4]。
1.3 载体质粒的制备 由β-启动因子控制下[Chicken Actin Promot er]， 利用酶切，连接方法分别制成插入正义或反义Ku70基因的pCAGGS质粒。所 用内切酶，连接酶等均购于英国Biolabs公司。
1.4 重组于载体质粒的Ku70正义 反义基因分别导入人肺癌细胞(LCA 细胞)将导入前24小时传代的 LCA细胞以1×106 ml-1 接种于60 mm直径平皿中， 采用磷酸钙沉淀法，试剂盒由英国BIORAP公司提供。
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1.5 导入基因的筛选鉴定 筛选：将导入基因的LCA细胞48 h后以1 ×105/皿的细胞密度接种于90 mm直径平皿中，加入800 μg/ml Blasticgsins( G418培 养液)，选择培养转化细胞克隆。
鉴定：单链特异探针的制备；转化克隆细胞总RNA提取、RNA电泳、Northern印迹杂交。 按分子克隆手册操作。洋地黄甙标记的核酸检测试剂盒。由Bochringer公司提供。
1.6 导入后LCA细胞的Ku70基因蛋白表达 将导入后LCA细胞中DNA蛋白提取，纯化，行SDS-PAGE电泳。采用Western-blotting法按常规转移至硝酸纤维膜( Scher & Schuell)用一定稀释度的辣根过氧化物酶(一抗)羊抗人IgG(Santa Cruz)，(二 抗)羊抗羊IgG-HRP显色，以未导入Ku70基因的LCA细胞做对照 。方法参见文献[5]。
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2 结果
2.1 pCAGGS-Ku70s(正义)，pCAGGS-Ku70as(反义)重组质 粒用HindⅢ和BamHI酶切鉴定结果，见图1。
图1 Ku70 / pCAGGS 正义、反义重组质粒
用HindⅢ和 BamHⅠ酶切鉴定结果
Fig.1 Restriction enzyme Hind and BamH analysis
of Ku70 sense and ant isense expression vectors
Note:1. λHind;2. фχ;3. Sense pCAGGS-Ku70;
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4. antisence pCAGGS-Ku70;5. sense pCAGGS-Ku70 of
restriction;6. antisense pCAGGSS-Ku70 of restriction enzyme
2.2 导入重组Ku70基因的LCA细胞中Ku70的表达见图2。Northern印迹杂交结果，可见有特异的正义、反义Ku70基因的表达印迹。
图2 Ku70 基因的mRNA表达
Fig.2 Expression of the Ku70 mRNA Northern hybidization
Note:1、parntal cell;2、sense;3、antisense
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2.3 导入正义Ku70基因LCA细胞中有正义Ku70基因蛋白表达，而导入反义Ku70基因LcA的细胞中无正义Ku70基因蛋白表达，说明反义Ku70基因导入的LCA细胞中正义 Ku70基因此段DNA已被封闭。Western-blotting结果，见图3。
图3 Ku70蛋白的表达
Fig.3 Expression of the Ku70 proein Western blotting
Note:1.parntal cell;2.sense Ku70 pro;3.a ntisense Ku70 pro
3 讨论
Ku基因对DNA-PKcs的调节作用决定了它对DNA-PK的调节作用，实质上，Ku基因为DNA 修复基因，所以DNA的转录、复制、修复以及肿瘤细胞生成都与Ku基因直接相关。现在的研究结果已得知Ku基因的cDNA的全长编码序列[6]，Ku70基因可以正义、反义形式重组于质 粒载体，并导入人肺癌细胞在 mRNA以蛋白形式表达，为我们进一步研究正常和肿瘤细胞中K u基因、DNA-PK的状况，以及是否可用导入Ku基因的方法调节DNA-CK，修复DNA，为诊断、 预防、治疗肿瘤奠定实验基础。
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另外，现已证明，胚胎干细胞由于缺乏Ku70基因，有一个XRCC6位点对X线照射非常敏 感。本研究发现正义，反义Ku70基因可以分别导入人肺癌细胞(LCA)，Northern印迹分析 显示两者已分别在mRNA中得到表达，而在LCA细胞中，只有导入正义Ku70基因的LCA细胞中有 Ku70基因蛋白的表达，而导入反义Ku70基因的LCA细胞中却没有Ku70蛋白的表达(Western- blotting分析)，说明后者的正义Ku70基因已被封闭，这时可能会有XRCC6位点的 暴露，对X线的照射将非常敏感，而肿瘤细胞的增长速度远远大于正常细胞，这为肿瘤的放射治疗提供了特异增敏的极好机会，这一表达特 性会给肿瘤的放射、基因治疗相结合提供广阔的前 景，有很实际的临床意义，同时也是我们下一步将进行的工作。
本课题受国家教委留学回国人员科研启动基金资助(1999年)
作者简介：张捷，女，42岁，硕士生导师，副教授，副主任医师，主要从事呼吸 系统疾病的临床免疫分子生物学研究；
, 百拇医药
杨贵贞 指导教师，教授，博士生导师，白求恩医科大学免疫学教研室资深教授
4 参考文献
1，Anderson C W. The nuclear serine/threonine protein kinase DNA-PK . Crit Rev Euk Gene Express, 1992;2:238
2，Blunt T,Finnie N J,Taccioli et al. Defective DNA-depende nt protein kinase activity is linked to V(D)J recombination and DNA-repair de fects associated with the scid mutation. Cell，1995;80: 813
3，Cai Q Q, Plet A, Imbert J et al. Chromosomal locatio n and expression of the genes coding for Ku p70 and p80 in human cell line and normal tissues. Cytogenet Cell Geet， 1994；65: 221
, http://www.100md.com
4，Javahery R, Khachi A, Lo K et al. DNA sequence requi rements for transcriptional initiator activity in mammalian cells. Mol Cell Biol， 1994;14: 116
5，Finne N J, Gottlieb T M, Blunt T et al. DNA-depend ent protein kinase activity is absent in xrs-6 cells: implication for site- s pecific recombination and DNA double strand break repair. Proc Natl Sci US A，1995；92: 320
6，Yuichi Takiguchi ,Akihiro Kurimasa, Fanqing Chen et al. G enomic structure and chromosomal assignment of the mouse Ku70 gene. Genomics,1 996;35: 129
[收稿1999-08-25 修回1999-12-06], http://www.100md.com
单位：张捷(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；安继红(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；杨贵贞(白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041)；大森繁成(日本千叶大学医学部肺癌研究中心)；簁口裕一(日本千叶大学医学部肺癌研究中心)；栗山簂之(日本千叶大学医学部肺癌研究中心)
关键词：Ku70基因；人肺癌细胞；表达
中国免疫学杂志000411 摘 要 目的：研究Ku70基因导入人肺癌细胞(LCA)后的表达及意义 。方法：构建重组的正义和反义Ku70基因表达质粒载体分别导入LCA细 胞。结果：用Northern印迹杂交法证明Ku70正义、反义基因均可在LC A的mRNA中得到表达， 用Western-blotting法去证明细胞中只有导入正义Ku70基因的蛋白表达，而导入反义Ku70 基因的人肺癌细胞，无正义Ku70蛋白表达，结论：正义Ku70基因的表达 可以调节DNA的修复，反义Ku70基因的表达可以增强肿瘤细胞对放射线照 射的敏感性。这些表达特性可为我们治疗肿瘤提供新的分子生物学手段。
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中国图书分类号 R73
The expression and its specification of the Ku70 gene transferred into a human's lung carcinoma cell line
ZHANG Jie AN Ji-Hong YANG Gui-Zhen
(Second Teaching Hospital，Norman Bethune University of Medicine,Changchun 130041)
Abstract Objective：To study the expression and its speci fication of the Ku70 gene transferred into a human's lung carcinoma cell line (LCA). Met hods：Const ructing recombinant sense or antisense Ku70 expression vectors (Ku70/pCAGGS) an d transferring into LCA. Results：Those Ku70 genes were ex pressed in the mRNA o f the LCA cell line by Northern-blotting . Only the sense Ku70 gene was expres sed in the protein of the LCA transferred the sense Ku70 gene, but the sense Ku7 0 gene wasn't expressed in protein of the LCA transferred antisense Ku70 gene b y Western-blotting.Conclusion：The sense Ku70 gene would regulate to repair.The antisense Ku70 gene increased the LCA 's radiosensitivity DNA. They may offer a new molecular biology way to treat cancer.
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Key words Ku70 gene Human's lung carcinoma cell Expression
Ku70基因是DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的亚单位之一，分子量为70 kD， 它与Ku80和DNA-PK的催化亚单位(DNA-PKcs)共同组成DNA-PK。近来的研究已证明，Ku70 和Ku 80基因能补充活化DNA-PKcs，参与DNA双链缺口的修复和V(D)J重组，人类Ku70基因位于 染色体的22q33，Ku80基因位于染色体的2q33～34，为人鼠同源基因[1]。近年来，K u基因对DNA -PKcs的调节研究颇受关注，是因为DNA-PK是磷酸化的蛋白质，包括肿瘤 抑制蛋白的P53，转 录因子(原癌基因)，c-Jun，C-Fos等等，特别在调节DNA转录、复制、修复中起重 要作用[2]。不难看出，上述研究与肿瘤的发病机理，基因诊断，治疗密切相关，所以，我们试图通 过Ku70正义基因、Ku70反义基因的肺癌细胞导入及表达为研究肿瘤 发病的机理和探索基因诊断治疗新方法奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 细胞系 人肺癌腺癌细胞系(LCA)日本千叶大学医学部肺癌研 究中心提供。
1.2 正义DNA，Ku70片段：3’末端的Ku70(600 bp)基因，反义DN A，Ku70片段：5’末端的Ku70(600 bp)基因，见参考文献[3，4]。
1.3 载体质粒的制备 由β-启动因子控制下[Chicken Actin Promot er]， 利用酶切，连接方法分别制成插入正义或反义Ku70基因的pCAGGS质粒。所 用内切酶，连接酶等均购于英国Biolabs公司。
1.4 重组于载体质粒的Ku70正义 反义基因分别导入人肺癌细胞(LCA 细胞)将导入前24小时传代的 LCA细胞以1×106 ml-1 接种于60 mm直径平皿中， 采用磷酸钙沉淀法，试剂盒由英国BIORAP公司提供。
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1.5 导入基因的筛选鉴定 筛选：将导入基因的LCA细胞48 h后以1 ×105/皿的细胞密度接种于90 mm直径平皿中，加入800 μg/ml Blasticgsins( G418培 养液)，选择培养转化细胞克隆。
鉴定：单链特异探针的制备；转化克隆细胞总RNA提取、RNA电泳、Northern印迹杂交。 按分子克隆手册操作。洋地黄甙标记的核酸检测试剂盒。由Bochringer公司提供。
1.6 导入后LCA细胞的Ku70基因蛋白表达 将导入后LCA细胞中DNA蛋白提取，纯化，行SDS-PAGE电泳。采用Western-blotting法按常规转移至硝酸纤维膜( Scher & Schuell)用一定稀释度的辣根过氧化物酶(一抗)羊抗人IgG(Santa Cruz)，(二 抗)羊抗羊IgG-HRP显色，以未导入Ku70基因的LCA细胞做对照 。方法参见文献[5]。
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2 结果
2.1 pCAGGS-Ku70s(正义)，pCAGGS-Ku70as(反义)重组质 粒用HindⅢ和BamHI酶切鉴定结果，见图1。
图1 Ku70 / pCAGGS 正义、反义重组质粒
用HindⅢ和 BamHⅠ酶切鉴定结果
Fig.1 Restriction enzyme Hind and BamH analysis
of Ku70 sense and ant isense expression vectors
Note:1. λHind;2. фχ;3. Sense pCAGGS-Ku70;
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4. antisence pCAGGS-Ku70;5. sense pCAGGS-Ku70 of
restriction;6. antisense pCAGGSS-Ku70 of restriction enzyme
2.2 导入重组Ku70基因的LCA细胞中Ku70的表达见图2。Northern印迹杂交结果，可见有特异的正义、反义Ku70基因的表达印迹。
图2 Ku70 基因的mRNA表达
Fig.2 Expression of the Ku70 mRNA Northern hybidization
Note:1、parntal cell;2、sense;3、antisense
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2.3 导入正义Ku70基因LCA细胞中有正义Ku70基因蛋白表达，而导入反义Ku70基因LcA的细胞中无正义Ku70基因蛋白表达，说明反义Ku70基因导入的LCA细胞中正义 Ku70基因此段DNA已被封闭。Western-blotting结果，见图3。
图3 Ku70蛋白的表达
Fig.3 Expression of the Ku70 proein Western blotting
Note:1.parntal cell;2.sense Ku70 pro;3.a ntisense Ku70 pro
3 讨论
Ku基因对DNA-PKcs的调节作用决定了它对DNA-PK的调节作用，实质上，Ku基因为DNA 修复基因，所以DNA的转录、复制、修复以及肿瘤细胞生成都与Ku基因直接相关。现在的研究结果已得知Ku基因的cDNA的全长编码序列[6]，Ku70基因可以正义、反义形式重组于质 粒载体，并导入人肺癌细胞在 mRNA以蛋白形式表达，为我们进一步研究正常和肿瘤细胞中K u基因、DNA-PK的状况，以及是否可用导入Ku基因的方法调节DNA-CK，修复DNA，为诊断、 预防、治疗肿瘤奠定实验基础。
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另外，现已证明，胚胎干细胞由于缺乏Ku70基因，有一个XRCC6位点对X线照射非常敏 感。本研究发现正义，反义Ku70基因可以分别导入人肺癌细胞(LCA)，Northern印迹分析 显示两者已分别在mRNA中得到表达，而在LCA细胞中，只有导入正义Ku70基因的LCA细胞中有 Ku70基因蛋白的表达，而导入反义Ku70基因的LCA细胞中却没有Ku70蛋白的表达(Western- blotting分析)，说明后者的正义Ku70基因已被封闭，这时可能会有XRCC6位点的 暴露，对X线的照射将非常敏感，而肿瘤细胞的增长速度远远大于正常细胞，这为肿瘤的放射治疗提供了特异增敏的极好机会，这一表达特 性会给肿瘤的放射、基因治疗相结合提供广阔的前 景，有很实际的临床意义，同时也是我们下一步将进行的工作。
本课题受国家教委留学回国人员科研启动基金资助(1999年)
作者简介：张捷，女，42岁，硕士生导师，副教授，副主任医师，主要从事呼吸 系统疾病的临床免疫分子生物学研究；
, 百拇医药
杨贵贞 指导教师，教授，博士生导师，白求恩医科大学免疫学教研室资深教授
4 参考文献
1，Anderson C W. The nuclear serine/threonine protein kinase DNA-PK . Crit Rev Euk Gene Express, 1992;2:238
2，Blunt T,Finnie N J,Taccioli et al. Defective DNA-depende nt protein kinase activity is linked to V(D)J recombination and DNA-repair de fects associated with the scid mutation. Cell，1995;80: 813
3，Cai Q Q, Plet A, Imbert J et al. Chromosomal locatio n and expression of the genes coding for Ku p70 and p80 in human cell line and normal tissues. Cytogenet Cell Geet， 1994；65: 221
, http://www.100md.com
4，Javahery R, Khachi A, Lo K et al. DNA sequence requi rements for transcriptional initiator activity in mammalian cells. Mol Cell Biol， 1994;14: 116
5，Finne N J, Gottlieb T M, Blunt T et al. DNA-depend ent protein kinase activity is absent in xrs-6 cells: implication for site- s pecific recombination and DNA double strand break repair. Proc Natl Sci US A，1995；92: 320
6，Yuichi Takiguchi ,Akihiro Kurimasa, Fanqing Chen et al. G enomic structure and chromosomal assignment of the mouse Ku70 gene. Genomics,1 996;35: 129
[收稿1999-08-25 修回1999-12-06], http://www.100md.com