上海地区汉族正常人及类风湿关节炎病人HLA-DPB1基因多态性分析
作者：朱乃硕 王福庆 陈诗书 王慧
单位：朱乃硕(复旦大学生命科学学 院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；王福庆(上海市免疫学研究所免疫二室，上海 200025)；陈诗书(上海第二医科大学生化及分子生物学教研室，上海 200025)；王慧(上海第二医科大学生化及分子生物学教研室，上海 200025)
关键词：
中国免疫学杂志000408 中国图书分类号 R392.13
人类MHC-II类DP抗原是由α链和β链组成的异二聚体糖蛋白，其中β 链具有 高度多态性。α链和β链分别由第6号染色体上的DPA1和DPB1基因编码，DPB1基因第2个外 显子核苷酸序列变异最大[1]，并可以反映各等位基因的多态性差异。近年研究注 意到，某些DP等位基因(如DPB1*0401)与白种人类风湿关节炎(RA)等自身免疫性疾病相关[2]。王福庆等曾对汉族正常人DP基因作了调查[3]，但对汉族类风湿关节炎 病人DP基因的研究尚少见报道。本文拟对RA病人DPB1基因进行比较研究，探索中国汉族正常 人及类风湿关节炎病人HLA-DPB1基因多态性，了解RA发病的分子机制。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 正常人150例，血液取自上海地区健康汉族人，RA病人48例 ，血液由上海市仁济医院提供。白细胞DNA参照文献[4]进行。
1.2 PCR及RFLP分析 DPB1第2外显子PCR引物参照第12届国际HLA讨论会 推荐序列合成：DPBAMP-A 5’GAG AGT GGC GCC TCC GCT CAT 3’，DPBAMP-B 5’GCC GGC CCA AAG CCC TCA CTC 3’[3]，扩增片段长度327 bp，PCR方法参照文献 [4]进行。6种限制性内切酶：RsaI，DdeI,Fok I,Ban II,Bst UI,Eco NI为Boilabs产品， 取PCR产物10～12 μl,加限制性内切酶8～10 U，按各酶最适温度要求保温2～3 h，然 后以15% PAGE或4%琼脂糖(NuSieve GTG,FMC产品)电泳，溴乙锭染色，于紫外透射仪上观察 结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 DPB1第2外显子PCR及RFLP定型结果 对所有正常人和RA病人均显示 良好的327 bp 扩增条带。DPB1各等位基因限制性内切酶水解片段格局见文献[3]。在本组中国人群中共检 出18种DPB1等位基因，正常人中检出12种，有4种等位基因频率较高：DPB1*0501(38.7%)、* 0201(17.3%)、*0202(11.7%)、*0401(10.7%)，其频率总和达78.3%。而在RA病人中 检出了16 种，其中4种频率较高的等位基因是DPB1*0501(25.0%)、*0201(19.8%)、*0402(14.6%) 及*2201(5.2%)，其频率总和达64.6%，见表1。
表1 正常人及RA病人DPB1各等位基因频率比较
Tab.1 Comparison of DPB1 allele frequency in
, 百拇医药
RA patients and healthy controls DPB1
Control(n=150)
RA patients(n=48)
0101/2601(a)
0.0
1.0
0201/3201(a)
17.3
19.8
0202
4.0
, 百拇医药
4.2
0301/2901(a)
4.0
1.0
0401
10.7
6.3
0402/2301(a)
11.7
14.6
0501
38.7
25.01)
, 百拇医药
0901
0.0
1.0
1001
0.7
1.0
1301
3.7
2.1
1401
1.7
4.2
1601
, 百拇医药
0.0
4.21)
1701
6.3
2.1
1901
0.7
0.0
2101
0.7
0.0
2201
0.0
, 百拇医药
5.21)
2401
0.0
2.1
2701
0.0
1.0
X
5.2
Note:1)P<0.05；X.the alleles'RFLP patterns are different with al leles that have published;a.the fragments digested by restriction endonucleases are similar each other
, http://www.100md.com
2.2 正常人及RA病人DPB1各等位基因频率比较分析 从结果看，RA 病人的D PB1*0501频率显著低于正常人组(P<0.05)，而RA病人DPB1*1601、*2201 频率显著高于正常组(均P<0.05)。
2.3 正常人及RA病人DPB1各等位基因相关的氨基酸变异位点比较分析 根据DPB1基因的PCR-RFLP分析结果及已知的各等位基因密码子序列特征[1]，我们 对正常人及RA病人8个主要的氨基酸变异位点(35、36、55、56、57、65、69、76位)的密码 子频 率 进行了比较，发现DP β链第56位A(丙氨酸)和69位的K(赖氨酸)频率在正常人显著高于病 人(均P<0.05)，提示这2个位点可能与RA抗性有关，见表2。
表2 正常人及RA病人DPB1等位基因相关的密码子变异 位点比较
Tab.2 Frequencies of DPB variant colons associated with RA Variant P colons
, 百拇医药
Allele associated with RA
RA patients
(%)
Controls
(%)
56 A(GCG)
DPB1*0501
46.88
58.33
<0.05
69 K(AAG)
DPB1*0501
, http://www.100md.com
55.21
66.67
<0.05
3 讨论
1978年Wank等预处理淋巴细胞分型(Primed lymphocyte typing,PLT)时发现与DR、DQ不一 样的新抗原，使预处理T淋巴细胞能产生很强的二次反应，导致后来HLA-DP抗原(D/DR ass o ciated PLT defined)的发现。该类抗原不能用血清学方法来分型，而PLT方法又非常烦琐， 给 DP抗原多态性的研究带来了一定的困难，我们应用PCR-RFLP法对DPB1基因分析，操作非常 简便，只需要PCR和电泳等基本条件即可进行。熟练技术人员10～12 h即可完成，很适合 基层单位如中小型医院和相关部门的应用。
类风湿性关节炎可能是多基因参与的自身免疫性疾病，我们曾对中国人多个免疫相关的基因 多态性进行了分析[4-6]。在对DPB基因研究中发现RA与RRAA易感序列相关，74.2 %的RA病人带有该易感序列，通过对TAP基因分析发现短链型TAP2纯合子与RA易感性显著相关 ，提示与TAP参与的内源性自身抗原递呈有关。而我们对CTLA4基因研究未发现明显与RA相关 。本文对DPB1基因的分析显示汉族人DPB1*0501频率最高(38.7%)，与RA抗性呈正相关，对 8个主要的氨基酸高变位点的密码子进行比较结果显示A56、K69两个密码子位点与RA抗性相 关。在MHC分子空间结构中，这2个密码子位点比较重要，参与了抗原结合槽的形成。综合 分析显示类风湿关节炎是一种与多种免疫基因相关联的自身免疫病，对这些基因的研究使我 们对中国人这些基因的多态性及其与RA等自身免疫病的潜在关系有了一定的认识。
, 百拇医药
作者简介：朱乃硕,男,博士，副教授，分子免疫学专业研究生导师，主要从事疾病 相关的免疫活化及免疫耐受诱导的分子机制研究
4 参考文献
1，Marsh S G E. HLA class II region sequences. Tissue Antigens,1998;51:4 67
2，Perdriger A, Semana G,Quillivic F.DPB1 polymorphism in rheumatoid:evidenc e of an association with allele DPB1 0401. Tissue Antigens,1992;39:14
3，王福庆，奚宏康.用PCR-RFLP方法调查上海汉族人群中HLA-DP多态性.中华微生物学 和免疫学杂志，1995；15(1)：40
, 百拇医药
4，朱乃硕，王亚新，陈诗书 et al.中国人群HLA-DR4等位基因结构及 其与类风湿关节炎相关性研究. 中华医学杂志，1994；74(7)：428
5，朱乃硕，黄啸宇，王福庆 et al.中国汉族人群抗原肽运载体(TAP) 基因结构的多态性及其在类风湿关节炎易感性中的意义. 中华微生物学和免疫学杂志，199 6；16(5)：309
6，朱乃硕，张 伟，段 飞 et al.中国人CTLA-4基因的PCR-SSCP和 DNA序列分析.中国免疫学杂志，1998；14(5)：349
[收稿1999-08-29 修回1999-12-06], 百拇医药
单位：朱乃硕(复旦大学生命科学学 院病毒及分子免疫实验室，上海 200433)；王福庆(上海市免疫学研究所免疫二室，上海 200025)；陈诗书(上海第二医科大学生化及分子生物学教研室，上海 200025)；王慧(上海第二医科大学生化及分子生物学教研室，上海 200025)
关键词：
中国免疫学杂志000408 中国图书分类号 R392.13
人类MHC-II类DP抗原是由α链和β链组成的异二聚体糖蛋白，其中β 链具有 高度多态性。α链和β链分别由第6号染色体上的DPA1和DPB1基因编码，DPB1基因第2个外 显子核苷酸序列变异最大[1]，并可以反映各等位基因的多态性差异。近年研究注 意到，某些DP等位基因(如DPB1*0401)与白种人类风湿关节炎(RA)等自身免疫性疾病相关[2]。王福庆等曾对汉族正常人DP基因作了调查[3]，但对汉族类风湿关节炎 病人DP基因的研究尚少见报道。本文拟对RA病人DPB1基因进行比较研究，探索中国汉族正常 人及类风湿关节炎病人HLA-DPB1基因多态性，了解RA发病的分子机制。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 研究对象 正常人150例，血液取自上海地区健康汉族人，RA病人48例 ，血液由上海市仁济医院提供。白细胞DNA参照文献[4]进行。
1.2 PCR及RFLP分析 DPB1第2外显子PCR引物参照第12届国际HLA讨论会 推荐序列合成：DPBAMP-A 5’GAG AGT GGC GCC TCC GCT CAT 3’，DPBAMP-B 5’GCC GGC CCA AAG CCC TCA CTC 3’[3]，扩增片段长度327 bp，PCR方法参照文献 [4]进行。6种限制性内切酶：RsaI，DdeI,Fok I,Ban II,Bst UI,Eco NI为Boilabs产品， 取PCR产物10～12 μl,加限制性内切酶8～10 U，按各酶最适温度要求保温2～3 h，然 后以15% PAGE或4%琼脂糖(NuSieve GTG,FMC产品)电泳，溴乙锭染色，于紫外透射仪上观察 结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 DPB1第2外显子PCR及RFLP定型结果 对所有正常人和RA病人均显示 良好的327 bp 扩增条带。DPB1各等位基因限制性内切酶水解片段格局见文献[3]。在本组中国人群中共检 出18种DPB1等位基因，正常人中检出12种，有4种等位基因频率较高：DPB1*0501(38.7%)、* 0201(17.3%)、*0202(11.7%)、*0401(10.7%)，其频率总和达78.3%。而在RA病人中 检出了16 种，其中4种频率较高的等位基因是DPB1*0501(25.0%)、*0201(19.8%)、*0402(14.6%) 及*2201(5.2%)，其频率总和达64.6%，见表1。
表1 正常人及RA病人DPB1各等位基因频率比较
Tab.1 Comparison of DPB1 allele frequency in
, 百拇医药
RA patients and healthy controls DPB1
Control(n=150)
RA patients(n=48)
0101/2601(a)
0.0
1.0
0201/3201(a)
17.3
19.8
0202
4.0
, 百拇医药
4.2
0301/2901(a)
4.0
1.0
0401
10.7
6.3
0402/2301(a)
11.7
14.6
0501
38.7
25.01)
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3.7
2.1
1401
1.7
4.2
1601
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0.0
4.21)
1701
6.3
2.1
1901
0.7
0.0
2101
0.7
0.0
2201
0.0
, 百拇医药
5.21)
2401
0.0
2.1
2701
0.0
1.0
X
5.2
Note:1)P<0.05；X.the alleles'RFLP patterns are different with al leles that have published;a.the fragments digested by restriction endonucleases are similar each other
, http://www.100md.com
2.2 正常人及RA病人DPB1各等位基因频率比较分析 从结果看，RA 病人的D PB1*0501频率显著低于正常人组(P<0.05)，而RA病人DPB1*1601、*2201 频率显著高于正常组(均P<0.05)。
2.3 正常人及RA病人DPB1各等位基因相关的氨基酸变异位点比较分析 根据DPB1基因的PCR-RFLP分析结果及已知的各等位基因密码子序列特征[1]，我们 对正常人及RA病人8个主要的氨基酸变异位点(35、36、55、56、57、65、69、76位)的密码 子频 率 进行了比较，发现DP β链第56位A(丙氨酸)和69位的K(赖氨酸)频率在正常人显著高于病 人(均P<0.05)，提示这2个位点可能与RA抗性有关，见表2。
表2 正常人及RA病人DPB1等位基因相关的密码子变异 位点比较
Tab.2 Frequencies of DPB variant colons associated with RA Variant P colons
, 百拇医药
Allele associated with RA
RA patients
(%)
Controls
(%)
56 A(GCG)
DPB1*0501
46.88
58.33
<0.05
69 K(AAG)
DPB1*0501
, http://www.100md.com
55.21
66.67
<0.05
3 讨论
1978年Wank等预处理淋巴细胞分型(Primed lymphocyte typing,PLT)时发现与DR、DQ不一 样的新抗原，使预处理T淋巴细胞能产生很强的二次反应，导致后来HLA-DP抗原(D/DR ass o ciated PLT defined)的发现。该类抗原不能用血清学方法来分型，而PLT方法又非常烦琐， 给 DP抗原多态性的研究带来了一定的困难，我们应用PCR-RFLP法对DPB1基因分析，操作非常 简便，只需要PCR和电泳等基本条件即可进行。熟练技术人员10～12 h即可完成，很适合 基层单位如中小型医院和相关部门的应用。
类风湿性关节炎可能是多基因参与的自身免疫性疾病，我们曾对中国人多个免疫相关的基因 多态性进行了分析[4-6]。在对DPB基因研究中发现RA与RRAA易感序列相关，74.2 %的RA病人带有该易感序列，通过对TAP基因分析发现短链型TAP2纯合子与RA易感性显著相关 ，提示与TAP参与的内源性自身抗原递呈有关。而我们对CTLA4基因研究未发现明显与RA相关 。本文对DPB1基因的分析显示汉族人DPB1*0501频率最高(38.7%)，与RA抗性呈正相关，对 8个主要的氨基酸高变位点的密码子进行比较结果显示A56、K69两个密码子位点与RA抗性相 关。在MHC分子空间结构中，这2个密码子位点比较重要，参与了抗原结合槽的形成。综合 分析显示类风湿关节炎是一种与多种免疫基因相关联的自身免疫病，对这些基因的研究使我 们对中国人这些基因的多态性及其与RA等自身免疫病的潜在关系有了一定的认识。
, 百拇医药
作者简介：朱乃硕,男,博士，副教授，分子免疫学专业研究生导师，主要从事疾病 相关的免疫活化及免疫耐受诱导的分子机制研究
4 参考文献
1，Marsh S G E. HLA class II region sequences. Tissue Antigens,1998;51:4 67
2，Perdriger A, Semana G,Quillivic F.DPB1 polymorphism in rheumatoid:evidenc e of an association with allele DPB1 0401. Tissue Antigens,1992;39:14
3，王福庆，奚宏康.用PCR-RFLP方法调查上海汉族人群中HLA-DP多态性.中华微生物学 和免疫学杂志，1995；15(1)：40
, 百拇医药
4，朱乃硕，王亚新，陈诗书 et al.中国人群HLA-DR4等位基因结构及 其与类风湿关节炎相关性研究. 中华医学杂志，1994；74(7)：428
5，朱乃硕，黄啸宇，王福庆 et al.中国汉族人群抗原肽运载体(TAP) 基因结构的多态性及其在类风湿关节炎易感性中的意义. 中华微生物学和免疫学杂志，199 6；16(5)：309
6，朱乃硕，张 伟，段 飞 et al.中国人CTLA-4基因的PCR-SSCP和 DNA序列分析.中国免疫学杂志，1998；14(5)：349
[收稿1999-08-29 修回1999-12-06], 百拇医药