鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达
作者：杨雨辉 陈奖励
单位：杨雨辉(中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)；陈奖励(中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)
关键词：鸡贫血病毒；VP2基因；克隆；序列分析；表达
中国免疫学杂志000420 摘 要 目的：为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征。方 法：采用PCR方法获得鸡贫血病毒的VP2基因，采用平端连接将其克隆到PUC119载体 上进行测序，采用粘端连接将其亚克隆到PET载体上并进行原核表达。结果：发现CAV-SJ1株的VP2基因共有651个碱基，同国外TK5803、26P4、Cux-1、82-2毒 株 的VP2基因相比分别有6、7、8、7个碱基的差别，其中3个是SJ1株特有的碱基变化。由基因 序列推导出的CAV-SJ1株VP2蛋白的氨基酸序列同这些毒株相比都有4个氨基酸的差别， 同国外这些毒株共有7个氨基酸的差别。原核表达的融合蛋白分子量为34 kD，占菌体蛋白含 量的10.5%。结论：CAV的分子生物学的特性较稳定，变化不大。
, 百拇医药
中国图书分类号 S852.65
Cloning,sequencing and expression of VP2 gene of CAV-SJ1 strain
YANG Yu-Hui CHEN Jiang-Li
(State Key Labratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Insti tute,CAAS,Harbin150001)
Abstract Objective：Research molecular biology character o f chicken anemia virus.Methods:The authors acquired VP2 ge ne by PCR amplifing method,and insert VP2 gere into PUC119 plasmid by cloning f or sequencing. Then the VP2 gene of SJ1 was inserted into expressing plasmid PET by subcoloning.Results:The result of sequencing demonstra te VP2 gene contains of 651 bp,which differs from those of TK5 803,26P4,Cux-1,82-2. There are 6,7,8,7 difference in VP2 between SJ1 strain an d TK5803,26P4,Cux-1,82-2. VP2 gene was successfully expressed,The authors get t he fushion protein of 34 kD. Conclusion:Molecular biology character of chicken animia virus is stable.
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Key words CAV VP2 Cloning Sequence Expression
鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)是近二十几年才发现的一种新病毒 ，它的感染可以引起雏鸡严重的贫血和胸腺萎缩，甚至造成死亡。亚临床感染则引起雏鸡食欲下降并导致雏鸡对其它疾病如：传染性法氏囊(IBD)、马立克氏病(MD)、和新城疫(ND)等 疾病的易感性增强，是当前危害养禽业的重要病原之一。
CAV含有3个开放的阅读框架，分别编码3种蛋白质(VP1、VP2、VP3)。有关研究表明VP1是CAV 唯一的结构蛋白，VP2为辅助蛋白，与病毒的装配有关，而VP3是CAV的致病性蛋白[1] 。其中VP1、VP2和病毒的免疫保护有关[2]。
本研究设计了一对扩增CAV VP2基因的引物，通过质粒PCR将其扩增出来，并通过平端连接将 其克隆于PUC119之上，并表达之，这为进一步开展CAV的分子生物学的研究和研制CAV的基因 工程疫苗打下了基础。
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1 材料与方法
1.1 PCR模板 以含有VP2基因的SJ1株的PUC-CAV1. 5 kb重组质粒为模板(由本室提供)[3]。
1.2 引物设计和PCR扩增 根据基因银行记载的Cux-1株的DNA序列 设计了 扩增CAV-SJ1株VP2基因的引物：VP2-1、5’-TAGGCGGATCCAAGTGGATGCAC-3’；VP2-2、 5’-CCATAGTCATAGTAGATTGGC-3’。在VP2-1上改造了一个BamHI酶切位点。
1.3 PCR扩增 取适量的PCU119-CAV1.5 Kb DNA于500 μl的Eppendorf管 中，与2 μl正向引物、2 μl反向引物、8 μl dNTP(10 mmol/L)、2 U Taq DNA聚合酶(Pro mega)、10 μl buffer混合加入灭菌的去离子水至100 μl，置于PTC 100 PCR程控循环仪( 美国JM-Research)上，95℃变性5 min以后，以94℃ 1 min、50℃ 1.5 min、72℃ 1 min循 环35次，最后72℃延伸10 min。
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1.4 VP2基因的克隆 将SJ1株的VP2基因的PCR产物用T4 DNA聚合酶 和多聚核苷酸激酶处理后，与SmaI酶切的PUC119载体连接，转入JM83受体菌。
1.5 克隆质粒的提取鉴定 小量法提取质粒用BamHI单酶 切和BamHI/EcoRI双酶切筛选克隆于PUC119上的正向重组质粒[4]。用BamHI/EcoRI双酶切筛选克隆于PET-28c上的阳性重组质粒。
1.6 克隆质粒测序 对重组质粒的测序用M13引物，DNA自动测序仪为AB137 7PR1SM，由宝生物工程公司大连分公司的DNA合成和分析实验室测定。6%聚丙烯酰胺凝胶，在2000 V电压8 h左右，通过计算机分析结果。
1.7 VP2基因的亚克隆 用BamHI/EcoRI双酶切PUC119-VP2正向重组质粒， 切下的VP2基因与同样酶处理的PET-28c质粒粘端连接。
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1.8 VP2基因的表达 用含有SJ1株VP2基因的PET-28c重组质粒转化到BL(D E3)受体菌，取单个菌落接种至50 ml含氨苄青霉素的LB培养基中振摇过夜。次日取1～2 ml 菌液接种至新的50 ml培养液中，37℃培养至A600OD为0.6加100 mmol/L的IPTG至浓度 为10 mmol/L继续培养3～4 h。
1.9 SDS-PAGE电泳分析 取诱导后细菌培养物，离心收集菌体，加上样缓 冲液煮沸5～10 min，取50 μl上样进行SDS-PAGE电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色。用Pha rmacia产的Image Master VDS分析融合蛋白VP2的含量。
2 结果
2.1 SJ1株VP2基因的序列分析结果 见图1。
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图1 鸡贫血病毒SJ1株和国外4株鸡贫血病毒的序列 比较
Fig.1 VP2 nucleotide sequence of the positive strand CAV
SJ1 DNA wit h comparasions to the reported sequence of foreign CAV
Note:One by one is TK5803,Cux-1,26P4,82-2 in the brac hets
2.2 VP2基因的表达产物的分析结果 SDS-PAGE电泳分析结果 见图2，质粒阳性菌与对照相比，含VP2表达重组质粒的受体菌均含有34kD的蛋白谱带，其大小与实验设计相符，用Pharmacia产的Image Master VDS分析融合蛋白VP2的含量为10.5%。
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图2 CAV-SJ1株VP2基因的大肠杆菌表达产物的SDS- PAGE的电泳分析
Fig.2 Expressing protein of VP2 gene of CAV-SJ1
strain was analysed by electrphoresis on SDS-PAGE
Note:M.Protein marker;1.Comparasion to negative
term;2-5.Germ including re combinant plasmid of PET-SJ1-VP2
3 讨论
CAV-SJ1株的VP2基因含有651个碱基，同国外CAV的TK5803、26P04、Cux-1、82-2毒株的V P2基因序列相比分别有6、7、8、7个碱基的差异，其中3个是SJ1株特有的碱基变化(见结果 序列)，由CAV-SJ1株VP2基因序列推导的氨基酸序列同国外CAV的TK5803、26P04、Cux-1、 82-2毒株的VP2蛋白的氨基酸序列相比分别都有4个氨基酸的差异，CAV-SJ1株的VP2蛋白同 这些国外毒株的VP2蛋白一共有7个氨基酸的差异。在第77个氨基酸SJ1株是Ser，其它4种毒 株 是Asn；在第153个氨基酸是Cux-1，其它4种毒株是Val；在第160个氨基酸82-2株是Lys其 它 4种毒株是Gln，在第167个氨基酸SJ1株是Gln，其它4种毒株是Glu；在第176个氨基酸SJ1株 是Tyr，其它4种毒株是Asp；在第185个氨基酸TK5803株是Val，其它4种毒株是Asp；在第 186个氨基酸26P4株是Gly，其它4种毒株是Glu。
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VP2蛋白是协助蛋白，与病毒的装配有关，而且VP2也是病毒的保护性抗原，VP2基因的序列 分析结果将为深入VP2的功能打下基础。VP2的序列内部含有完整的VP3序列，VP3是近年来研 究的热点，主要是它可以有诱导肿瘤细胞凋亡却不能使正常细胞凋亡[5]。所以VP2 基因的序列分析结果为研究VP3的功能也打下了基础。
VP2基因含有651个碱基大约编码216个氨基酸，推导其分子量大约为24 kD。但许多报道指出 ，细胞培养物中的VP2蛋白的分子量以及用载体表达的产物，它们的分子量都为28～30 kD左 右。本次实验以PET-28c为载体，初步表达的CAV基因产物经SDS-PAGE分析，在34 kD左 右 。因为本实验中阅读框架除了VP2本身的编码序列外，还包括从载体本身携带的启动密码子 后的33个氨基 酸序列，因此表达产物形成的融合蛋白的分子量应为34 kD。表达产物的大小与实验设计相 符 。VP2基因的表达量高达10.5%，这一结果将有助于VP2蛋白的纯化。这必将为研究以VP2 蛋白 为抗原制造疫苗和诊断试剂提供有利的物质基础。有关产物的活性正在进一步的鉴定中。
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作者简介：杨雨辉，男，硕士，主要研究分子生物学；
陈奖励，男，博士，主要研究分子生物学
4 参考文献
1，Noteborn M G,Boer De,Van Roozelar D et al. Characterati o n of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectio us replication cycle. Journal of Virology,1991;65:3131
2，Kcth,Roozelar D,Verschureren C et al. Immunogenic and protect ive of chicken anemia virus protein expressed in baculovirus. Vaccine，1995；3: 763
3，陈奖励，辛九庆，周方红 et al.鸡贫血病毒DNA的PCR及其分子克隆.中 国兽医学报，1997；17(5)：9
4，金冬雁，黎孟枫.分子克隆(译).第2版.北京：科学出版社，1992：19-21
5，张应慧.Apoptin的分子生物学基础及作用特点.国外医学*分子生物学分册，1995；20 (2)：49
[收稿1998-04-30 修回1999-12-01], 百拇医药
单位：杨雨辉(中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)；陈奖励(中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)
关键词：鸡贫血病毒；VP2基因；克隆；序列分析；表达
中国免疫学杂志000420 摘 要 目的：为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征。方 法：采用PCR方法获得鸡贫血病毒的VP2基因，采用平端连接将其克隆到PUC119载体 上进行测序，采用粘端连接将其亚克隆到PET载体上并进行原核表达。结果：发现CAV-SJ1株的VP2基因共有651个碱基，同国外TK5803、26P4、Cux-1、82-2毒 株 的VP2基因相比分别有6、7、8、7个碱基的差别，其中3个是SJ1株特有的碱基变化。由基因 序列推导出的CAV-SJ1株VP2蛋白的氨基酸序列同这些毒株相比都有4个氨基酸的差别， 同国外这些毒株共有7个氨基酸的差别。原核表达的融合蛋白分子量为34 kD，占菌体蛋白含 量的10.5%。结论：CAV的分子生物学的特性较稳定，变化不大。
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中国图书分类号 S852.65
Cloning,sequencing and expression of VP2 gene of CAV-SJ1 strain
YANG Yu-Hui CHEN Jiang-Li
(State Key Labratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Insti tute,CAAS,Harbin150001)
Abstract Objective：Research molecular biology character o f chicken anemia virus.Methods:The authors acquired VP2 ge ne by PCR amplifing method,and insert VP2 gere into PUC119 plasmid by cloning f or sequencing. Then the VP2 gene of SJ1 was inserted into expressing plasmid PET by subcoloning.Results:The result of sequencing demonstra te VP2 gene contains of 651 bp,which differs from those of TK5 803,26P4,Cux-1,82-2. There are 6,7,8,7 difference in VP2 between SJ1 strain an d TK5803,26P4,Cux-1,82-2. VP2 gene was successfully expressed,The authors get t he fushion protein of 34 kD. Conclusion:Molecular biology character of chicken animia virus is stable.
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Key words CAV VP2 Cloning Sequence Expression
鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)是近二十几年才发现的一种新病毒 ，它的感染可以引起雏鸡严重的贫血和胸腺萎缩，甚至造成死亡。亚临床感染则引起雏鸡食欲下降并导致雏鸡对其它疾病如：传染性法氏囊(IBD)、马立克氏病(MD)、和新城疫(ND)等 疾病的易感性增强，是当前危害养禽业的重要病原之一。
CAV含有3个开放的阅读框架，分别编码3种蛋白质(VP1、VP2、VP3)。有关研究表明VP1是CAV 唯一的结构蛋白，VP2为辅助蛋白，与病毒的装配有关，而VP3是CAV的致病性蛋白[1] 。其中VP1、VP2和病毒的免疫保护有关[2]。
本研究设计了一对扩增CAV VP2基因的引物，通过质粒PCR将其扩增出来，并通过平端连接将 其克隆于PUC119之上，并表达之，这为进一步开展CAV的分子生物学的研究和研制CAV的基因 工程疫苗打下了基础。
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1 材料与方法
1.1 PCR模板 以含有VP2基因的SJ1株的PUC-CAV1. 5 kb重组质粒为模板(由本室提供)[3]。
1.2 引物设计和PCR扩增 根据基因银行记载的Cux-1株的DNA序列 设计了 扩增CAV-SJ1株VP2基因的引物：VP2-1、5’-TAGGCGGATCCAAGTGGATGCAC-3’；VP2-2、 5’-CCATAGTCATAGTAGATTGGC-3’。在VP2-1上改造了一个BamHI酶切位点。
1.3 PCR扩增 取适量的PCU119-CAV1.5 Kb DNA于500 μl的Eppendorf管 中，与2 μl正向引物、2 μl反向引物、8 μl dNTP(10 mmol/L)、2 U Taq DNA聚合酶(Pro mega)、10 μl buffer混合加入灭菌的去离子水至100 μl，置于PTC 100 PCR程控循环仪( 美国JM-Research)上，95℃变性5 min以后，以94℃ 1 min、50℃ 1.5 min、72℃ 1 min循 环35次，最后72℃延伸10 min。
, http://www.100md.com
1.4 VP2基因的克隆 将SJ1株的VP2基因的PCR产物用T4 DNA聚合酶 和多聚核苷酸激酶处理后，与SmaI酶切的PUC119载体连接，转入JM83受体菌。
1.5 克隆质粒的提取鉴定 小量法提取质粒用BamHI单酶 切和BamHI/EcoRI双酶切筛选克隆于PUC119上的正向重组质粒[4]。用BamHI/EcoRI双酶切筛选克隆于PET-28c上的阳性重组质粒。
1.6 克隆质粒测序 对重组质粒的测序用M13引物，DNA自动测序仪为AB137 7PR1SM，由宝生物工程公司大连分公司的DNA合成和分析实验室测定。6%聚丙烯酰胺凝胶，在2000 V电压8 h左右，通过计算机分析结果。
1.7 VP2基因的亚克隆 用BamHI/EcoRI双酶切PUC119-VP2正向重组质粒， 切下的VP2基因与同样酶处理的PET-28c质粒粘端连接。
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1.8 VP2基因的表达 用含有SJ1株VP2基因的PET-28c重组质粒转化到BL(D E3)受体菌，取单个菌落接种至50 ml含氨苄青霉素的LB培养基中振摇过夜。次日取1～2 ml 菌液接种至新的50 ml培养液中，37℃培养至A600OD为0.6加100 mmol/L的IPTG至浓度 为10 mmol/L继续培养3～4 h。
1.9 SDS-PAGE电泳分析 取诱导后细菌培养物，离心收集菌体，加上样缓 冲液煮沸5～10 min，取50 μl上样进行SDS-PAGE电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色。用Pha rmacia产的Image Master VDS分析融合蛋白VP2的含量。
2 结果
2.1 SJ1株VP2基因的序列分析结果 见图1。
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图1 鸡贫血病毒SJ1株和国外4株鸡贫血病毒的序列 比较
Fig.1 VP2 nucleotide sequence of the positive strand CAV
SJ1 DNA wit h comparasions to the reported sequence of foreign CAV
Note:One by one is TK5803,Cux-1,26P4,82-2 in the brac hets
2.2 VP2基因的表达产物的分析结果 SDS-PAGE电泳分析结果 见图2，质粒阳性菌与对照相比，含VP2表达重组质粒的受体菌均含有34kD的蛋白谱带，其大小与实验设计相符，用Pharmacia产的Image Master VDS分析融合蛋白VP2的含量为10.5%。
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图2 CAV-SJ1株VP2基因的大肠杆菌表达产物的SDS- PAGE的电泳分析
Fig.2 Expressing protein of VP2 gene of CAV-SJ1
strain was analysed by electrphoresis on SDS-PAGE
Note:M.Protein marker;1.Comparasion to negative
term;2-5.Germ including re combinant plasmid of PET-SJ1-VP2
3 讨论
CAV-SJ1株的VP2基因含有651个碱基，同国外CAV的TK5803、26P04、Cux-1、82-2毒株的V P2基因序列相比分别有6、7、8、7个碱基的差异，其中3个是SJ1株特有的碱基变化(见结果 序列)，由CAV-SJ1株VP2基因序列推导的氨基酸序列同国外CAV的TK5803、26P04、Cux-1、 82-2毒株的VP2蛋白的氨基酸序列相比分别都有4个氨基酸的差异，CAV-SJ1株的VP2蛋白同 这些国外毒株的VP2蛋白一共有7个氨基酸的差异。在第77个氨基酸SJ1株是Ser，其它4种毒 株 是Asn；在第153个氨基酸是Cux-1，其它4种毒株是Val；在第160个氨基酸82-2株是Lys其 它 4种毒株是Gln，在第167个氨基酸SJ1株是Gln，其它4种毒株是Glu；在第176个氨基酸SJ1株 是Tyr，其它4种毒株是Asp；在第185个氨基酸TK5803株是Val，其它4种毒株是Asp；在第 186个氨基酸26P4株是Gly，其它4种毒株是Glu。
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VP2蛋白是协助蛋白，与病毒的装配有关，而且VP2也是病毒的保护性抗原，VP2基因的序列 分析结果将为深入VP2的功能打下基础。VP2的序列内部含有完整的VP3序列，VP3是近年来研 究的热点，主要是它可以有诱导肿瘤细胞凋亡却不能使正常细胞凋亡[5]。所以VP2 基因的序列分析结果为研究VP3的功能也打下了基础。
VP2基因含有651个碱基大约编码216个氨基酸，推导其分子量大约为24 kD。但许多报道指出 ，细胞培养物中的VP2蛋白的分子量以及用载体表达的产物，它们的分子量都为28～30 kD左 右。本次实验以PET-28c为载体，初步表达的CAV基因产物经SDS-PAGE分析，在34 kD左 右 。因为本实验中阅读框架除了VP2本身的编码序列外，还包括从载体本身携带的启动密码子 后的33个氨基 酸序列，因此表达产物形成的融合蛋白的分子量应为34 kD。表达产物的大小与实验设计相 符 。VP2基因的表达量高达10.5%，这一结果将有助于VP2蛋白的纯化。这必将为研究以VP2 蛋白 为抗原制造疫苗和诊断试剂提供有利的物质基础。有关产物的活性正在进一步的鉴定中。
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作者简介：杨雨辉，男，硕士，主要研究分子生物学；
陈奖励，男，博士，主要研究分子生物学
4 参考文献
1，Noteborn M G,Boer De,Van Roozelar D et al. Characterati o n of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectio us replication cycle. Journal of Virology,1991;65:3131
2，Kcth,Roozelar D,Verschureren C et al. Immunogenic and protect ive of chicken anemia virus protein expressed in baculovirus. Vaccine，1995；3: 763
3，陈奖励，辛九庆，周方红 et al.鸡贫血病毒DNA的PCR及其分子克隆.中 国兽医学报，1997；17(5)：9
4，金冬雁，黎孟枫.分子克隆(译).第2版.北京：科学出版社，1992：19-21
5，张应慧.Apoptin的分子生物学基础及作用特点.国外医学*分子生物学分册，1995；20 (2)：49
[收稿1998-04-30 修回1999-12-01], 百拇医药