含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫
作者：冯志华 周永兴 贾战生 连建奇 焦成松 李谨革 李文波
单位：冯志华(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)；周永兴(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)；贾战生(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)；连建奇(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
关键词：丙型肝炎病毒；核心基因；基因免疫
中国免疫学杂志000404 摘 要 目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因免疫诱生特异性免 疫应答的可行性。方法：将HCV C基因片段插入真核表达载体pcDNA3 质粒CMV启动子的下游,构建真核表达载体pcDNAHCV-C,分别转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和人 肝 癌细胞7721进行瞬时表达,用免疫荧光法和Western-blot检测表达产物;将重组质粒注射BA LB /c(H-2d)小鼠股四头肌,ELISA法检测血清中抗体产生水平。结果： 24 只免疫小鼠,初次免疫2 w后,血清中均出现了HCV C抗体,随着免疫次数和免疫剂量的增加,抗 体滴度明显提高。结论：HCV C基因免疫能够诱导机体产生特异性的体 液免疫应答,从而可能进一步诱生细胞免疫应答,成为防治HCV感染的有效方法。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 Q78
Construction and gene immunization of recombinant expression plasmid of Hepatitis C virus core gene
FENG Zhi-Hua ZHOU Yong-Xing JIA Zhan-Sheng
(Department of Infectious Diseases,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical Univer sity, Xi'an 710038)
Abstract Objective：To induce HCV specific humoral immun e responses in mice using gene immunization with the core protein of HCV.Methods ： The HCV core gene codin g region was inserted into the plasmid pcDNA3, then the core gene expressed tran siently with Lipofectamine coated in human hepatoblastoma 7721 and mouse myeloma SP2/0 cells.The product was detected by Western blot.The recombinant plasmid pc DNAHCV-C was directly injected into the quadriceps muscle of BALB/c mice ,the sp ecific antibody from the sera of immunized mice was measured by ELISA. Results： 7 721 and SP2/0 cells were shown to express specific antigen, a 22 kD protein. HC V core antibody could be detected,and the titer of specific antibody rose as immun e dose increased. Conclusion： The injection of pcDNAHCV- C might elicit specific i mmune response in BALB/c mice, and be a promising candidate as antiviral agent a nd HCV genetic vaccine.
, 百拇医药
Key words Hepatitis C virus Core gene Gene immunization
丙型肝炎病毒(HCV)感染是当前突出危害人类健康的传染病,至今尚无特异性 的预防和治疗措施。以往的病毒疫苗,含有完整的病毒蛋白质,以刺激机体产生抗体为主,难 以有效诱导产生以CTLs为代表的细胞免疫应答。基因免疫是近几年快速发展的一种新型免疫 方法,它是将编码抗原的外源基因插入一表达载体中,直接注入动物体内,于体内表达后,诱导 特异性的体液和细胞免疫应答。正是由于它能够全方位调动机体的免疫系统,因而可能预防 和清除病 毒的感染[1]。本文将包含HCV 核心(C)基因重组质粒DNA免疫BALB/c小鼠,研究HCV - C在体液免疫中的作用,为进一步探讨基因免疫用于HCV疫苗研制及抗HCV感染提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物和细胞 BALB/c小鼠均为雌性, 5～8周龄,由本校动物中心提 供;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0株(H-2d)和人肝癌细胞7721株由本室保存。
, http://www.100md.com
1.2 质粒和细菌 pBRTMHCV1-3011质粒[包含除5'非编码区基因(NCR) 外全部HCV基因序列],由美国Rice教授惠赠;pcDNA3真核表达载体和大肠杆菌菌种JM109由 本室保存;质粒制备、含HCV C基因的真核表达重组质粒的构建见文献[2]。
1.3 主要试剂及工具酶 HCV C抗原由军事医学科学院基础所凌世淦教 授惠赠;脂质体(Lipofectamine)、酶标抗体及限制性内切酶、连接酶等均购自华美生物公司 。
1.4 细胞表达产物的鉴定 将重组质粒pcDNAHCV-C用Lipofectamine 转染法分别转染SP2/0细胞和7721细胞,72 h后收集细胞。SP2/0细胞涂片,以HCV C单抗为 一抗做免疫荧光检测;7721细胞用超声断裂后,收集细胞悬液及上清,煮沸10 min,也以HC V C单抗为一抗,Western blot法检测表达的蛋白。
1.5 小鼠免疫及血清抗体水平测定 重组质粒大量提取,PEG纯化。48 只BALB/c小鼠股四头肌注射 0.25%布比卡因100 μl,24 h后分两组,在同一部位肌肉接种质 粒。第1组注射100 μg重组质粒pcDNAHCV-C或空载体对照pcDNA3,2 w后,将实验鼠再分成 两部分,一部分按以上方法每间隔2 w再次接种同量的DNA,共注射5次,另一部分不再接种; 第2组注射不同剂量50～200 μg的质粒DNA。不同剂量或不同注射次数组均设4只复鼠,小鼠 每次接种前24 h均需用0.25%布 比卡因100 μl预处理,两组均每间隔2 w剪尾取血。鼠血清1:50稀释后,ELISA法检测HCV C 特异性抗体产生情况。
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2 结果
2.1 重组质粒构建及鉴定 HindⅢ-XhoⅠ双酶切 pBRTMHCV1-3011质 粒 ,切下含HCV C基因的片段,正向插入真核表达载体pcDNA3的CMV启动子下游多克隆位点HindⅢ -XhoⅠ处,得到重组质粒pcDNAHCV-C;分别用 HindⅢ和 HindⅢ-XhoⅠ酶切鉴定重组质粒, 证明插入片段和载体大小均正确(图1)。
图1 重组质粒pcDNAHCV-C的酶切鉴定
Fig.1 Restriction endonuclease analysis of
the recombinant plasmid pcDN AHCV-C
, http://www.100md.com Note:1.DNA marker λDNA/EcoRⅠ-HindⅢ; 2.pcDNAHCV-C cut with
HindⅢ-Xh oⅠ； 3.DNA marker λDNA/HindⅢ;4.pcDNAHCV-C cut with HindⅢ
2.2 pcDNAHCV-C重组质粒的表达 SP2/0细胞内的表达产物,可与HCV- C单抗发生特异性结合(图2);Western blot法证明表达产物分子量约为22 kD(图3),表明C抗 原已得到表达。
图2 用免疫荧光法检测HCV C抗原在SP2/0细胞表达
Fig.2 Detection of expressed HCV C antigen by IF test
, http://www.100md.com
图3 Western blot法检测表达蛋白
Fig.3 Western blot detection of the expressed p22 protein
Note:1.protein marker； 2.transfected 7721 cells with p cDNAHCV-C
3.transfected 7721 cells with pcDNA3
2.3 免疫小鼠的抗体水平观察 pcDNAHCV-C重组质粒具有较强的抗原 性。用其免疫的 24只小鼠,2 w后均产生了HCV C特异性抗体。
2.3.1 免疫次数相关性 100 μg pcDNAHCV-C初次免疫BALB/c小鼠,血 清中抗体OD值在第6 w达高峰,8 w开始下降,10 w几乎测不到;再次免疫的抗体OD值明显 高于初次免疫,其OD值与pcDNAHCV-C质粒的免疫次数成正相关,即:在一定范围内免疫次数越 多,OD值越高(图4)。
, 百拇医药
图4 小鼠血清中HCV C抗体水平动态观察
Fig.4 Antibody level of HCV C in sera of BALB/c mice
2.3.2 免疫剂量相关性 从图5可知,免疫小鼠血清(初次免疫2 w后)中 抗体的P/N值与质粒pcDNAHCV-C的用量(50～200 μg)也成正相关,即:质粒用量越大,血清抗 体的P/N值越高。
图5 不同剂量pcDNAHCV-C质粒DNA免疫小鼠2 w后血 清抗体产生情况
Fig.5 Effect of different doses pcDNAHCV-C
immunized on antibody level of HCV C in sera of BALB/c mice
, 百拇医药
3 讨论
近年来越来越多的实验室证实了基因免疫保护病毒感染动物的有效性[3]。另 有研究表明,DN A免疫对某些病毒感染后处于免疫无应答状态的患者可能也有治疗作用。目前基因免疫的机 制仍不明确。
HCV为单股正链RNA病毒,其基因组内有含单一的开放读框(ORF),可 分为核心蛋白区(C区)、包 膜蛋白区(E1,E2区)和非结构蛋白区(NS2～NS5区)。其中C 区是结 构基因中最保守的区 域,该区含至少5个重要的抗原表位或细胞毒T细胞(CTL)表位[4，5],兼有诱导体液 免疫和细胞免疫 的能力。因此,C区可能与HCV的免疫致病及防御密切相关,以C蛋白刺激产生的细胞免疫可能 预防同一病毒不同毒株间的交叉感染。
我们将HCV C基因片段插入真核表达载体,构建重组质粒,转染SP2/0和7721细胞 ,结果表明,C 区能够在真核细胞中表达。以重组质粒免疫BALB/c小鼠,发现该区表达产物具有较强的抗原 性,可以诱导特异性抗体产生,而且抗体的滴度与小鼠免疫的次数和剂量呈正相关,免疫次数 越多,免疫剂量越大,抗体滴度越高。因此,采用基因免疫的方法,对于诱生HCV特异性的体液 免疫和细胞免疫是可能的,本研究为进一步诱生特异性细胞免疫应答和进行动物保护实验提 供了依据。
, 百拇医药
作者简介：冯志华, 女, 34岁，传染病学博士，主治医师；
周永兴 指导教师；男,59岁，博士生导师，主要从事肝病研究
焦成松(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
李谨革(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
李文波(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
4 参考文献
1，Geissler M,Tokushige K,Chante C C et al.Cellular and humoral immune response t o hepatitis B virus structural proteins in mice after DNA-based immunization. G astroenterology,1997;112:1307
, 百拇医药
2，金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南. 第2版.北京：北京科学出版社，1992：19～56
3，Ulmer J B,Donnelly J J,Parker S E et al.Heterologous prot ection against infl uenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science, 1993; 259:1745
4，Cerny A,McHutchinson J G,Pasquinelli C et al.Cytotoxic T lymphocyte respon se t o hepatitis C virus derived peptides containing the HLA A2.1 binding motif. J C lin Invest,1995;95:521
5，Koziel M J,Dudley D,Afdhal N et al.Hepatitis C virus (H CV) specific cytotoxic T lymphocytes recognize epitopes in the core and envelope proteins of HCV. J V irol,1993;67:7522
[收稿1998-09-09 修回1999-04-19], http://www.100md.com
单位：冯志华(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)；周永兴(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)；贾战生(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)；连建奇(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
关键词：丙型肝炎病毒；核心基因；基因免疫
中国免疫学杂志000404 摘 要 目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因免疫诱生特异性免 疫应答的可行性。方法：将HCV C基因片段插入真核表达载体pcDNA3 质粒CMV启动子的下游,构建真核表达载体pcDNAHCV-C,分别转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和人 肝 癌细胞7721进行瞬时表达,用免疫荧光法和Western-blot检测表达产物;将重组质粒注射BA LB /c(H-2d)小鼠股四头肌,ELISA法检测血清中抗体产生水平。结果： 24 只免疫小鼠,初次免疫2 w后,血清中均出现了HCV C抗体,随着免疫次数和免疫剂量的增加,抗 体滴度明显提高。结论：HCV C基因免疫能够诱导机体产生特异性的体 液免疫应答,从而可能进一步诱生细胞免疫应答,成为防治HCV感染的有效方法。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 Q78
Construction and gene immunization of recombinant expression plasmid of Hepatitis C virus core gene
FENG Zhi-Hua ZHOU Yong-Xing JIA Zhan-Sheng
(Department of Infectious Diseases,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical Univer sity, Xi'an 710038)
Abstract Objective：To induce HCV specific humoral immun e responses in mice using gene immunization with the core protein of HCV.Methods ： The HCV core gene codin g region was inserted into the plasmid pcDNA3, then the core gene expressed tran siently with Lipofectamine coated in human hepatoblastoma 7721 and mouse myeloma SP2/0 cells.The product was detected by Western blot.The recombinant plasmid pc DNAHCV-C was directly injected into the quadriceps muscle of BALB/c mice ,the sp ecific antibody from the sera of immunized mice was measured by ELISA. Results： 7 721 and SP2/0 cells were shown to express specific antigen, a 22 kD protein. HC V core antibody could be detected,and the titer of specific antibody rose as immun e dose increased. Conclusion： The injection of pcDNAHCV- C might elicit specific i mmune response in BALB/c mice, and be a promising candidate as antiviral agent a nd HCV genetic vaccine.
, 百拇医药
Key words Hepatitis C virus Core gene Gene immunization
丙型肝炎病毒(HCV)感染是当前突出危害人类健康的传染病,至今尚无特异性 的预防和治疗措施。以往的病毒疫苗,含有完整的病毒蛋白质,以刺激机体产生抗体为主,难 以有效诱导产生以CTLs为代表的细胞免疫应答。基因免疫是近几年快速发展的一种新型免疫 方法,它是将编码抗原的外源基因插入一表达载体中,直接注入动物体内,于体内表达后,诱导 特异性的体液和细胞免疫应答。正是由于它能够全方位调动机体的免疫系统,因而可能预防 和清除病 毒的感染[1]。本文将包含HCV 核心(C)基因重组质粒DNA免疫BALB/c小鼠,研究HCV - C在体液免疫中的作用,为进一步探讨基因免疫用于HCV疫苗研制及抗HCV感染提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物和细胞 BALB/c小鼠均为雌性, 5～8周龄,由本校动物中心提 供;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0株(H-2d)和人肝癌细胞7721株由本室保存。
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1.2 质粒和细菌 pBRTMHCV1-3011质粒[包含除5'非编码区基因(NCR) 外全部HCV基因序列],由美国Rice教授惠赠;pcDNA3真核表达载体和大肠杆菌菌种JM109由 本室保存;质粒制备、含HCV C基因的真核表达重组质粒的构建见文献[2]。
1.3 主要试剂及工具酶 HCV C抗原由军事医学科学院基础所凌世淦教 授惠赠;脂质体(Lipofectamine)、酶标抗体及限制性内切酶、连接酶等均购自华美生物公司 。
1.4 细胞表达产物的鉴定 将重组质粒pcDNAHCV-C用Lipofectamine 转染法分别转染SP2/0细胞和7721细胞,72 h后收集细胞。SP2/0细胞涂片,以HCV C单抗为 一抗做免疫荧光检测;7721细胞用超声断裂后,收集细胞悬液及上清,煮沸10 min,也以HC V C单抗为一抗,Western blot法检测表达的蛋白。
1.5 小鼠免疫及血清抗体水平测定 重组质粒大量提取,PEG纯化。48 只BALB/c小鼠股四头肌注射 0.25%布比卡因100 μl,24 h后分两组,在同一部位肌肉接种质 粒。第1组注射100 μg重组质粒pcDNAHCV-C或空载体对照pcDNA3,2 w后,将实验鼠再分成 两部分,一部分按以上方法每间隔2 w再次接种同量的DNA,共注射5次,另一部分不再接种; 第2组注射不同剂量50～200 μg的质粒DNA。不同剂量或不同注射次数组均设4只复鼠,小鼠 每次接种前24 h均需用0.25%布 比卡因100 μl预处理,两组均每间隔2 w剪尾取血。鼠血清1:50稀释后,ELISA法检测HCV C 特异性抗体产生情况。
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2 结果
2.1 重组质粒构建及鉴定 HindⅢ-XhoⅠ双酶切 pBRTMHCV1-3011质 粒 ,切下含HCV C基因的片段,正向插入真核表达载体pcDNA3的CMV启动子下游多克隆位点HindⅢ -XhoⅠ处,得到重组质粒pcDNAHCV-C;分别用 HindⅢ和 HindⅢ-XhoⅠ酶切鉴定重组质粒, 证明插入片段和载体大小均正确(图1)。
图1 重组质粒pcDNAHCV-C的酶切鉴定
Fig.1 Restriction endonuclease analysis of
the recombinant plasmid pcDN AHCV-C
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HindⅢ-Xh oⅠ； 3.DNA marker λDNA/HindⅢ;4.pcDNAHCV-C cut with HindⅢ
2.2 pcDNAHCV-C重组质粒的表达 SP2/0细胞内的表达产物,可与HCV- C单抗发生特异性结合(图2);Western blot法证明表达产物分子量约为22 kD(图3),表明C抗 原已得到表达。
图2 用免疫荧光法检测HCV C抗原在SP2/0细胞表达
Fig.2 Detection of expressed HCV C antigen by IF test
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图3 Western blot法检测表达蛋白
Fig.3 Western blot detection of the expressed p22 protein
Note:1.protein marker； 2.transfected 7721 cells with p cDNAHCV-C
3.transfected 7721 cells with pcDNA3
2.3 免疫小鼠的抗体水平观察 pcDNAHCV-C重组质粒具有较强的抗原 性。用其免疫的 24只小鼠,2 w后均产生了HCV C特异性抗体。
2.3.1 免疫次数相关性 100 μg pcDNAHCV-C初次免疫BALB/c小鼠,血 清中抗体OD值在第6 w达高峰,8 w开始下降,10 w几乎测不到;再次免疫的抗体OD值明显 高于初次免疫,其OD值与pcDNAHCV-C质粒的免疫次数成正相关,即:在一定范围内免疫次数越 多,OD值越高(图4)。
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图4 小鼠血清中HCV C抗体水平动态观察
Fig.4 Antibody level of HCV C in sera of BALB/c mice
2.3.2 免疫剂量相关性 从图5可知,免疫小鼠血清(初次免疫2 w后)中 抗体的P/N值与质粒pcDNAHCV-C的用量(50～200 μg)也成正相关,即:质粒用量越大,血清抗 体的P/N值越高。
图5 不同剂量pcDNAHCV-C质粒DNA免疫小鼠2 w后血 清抗体产生情况
Fig.5 Effect of different doses pcDNAHCV-C
immunized on antibody level of HCV C in sera of BALB/c mice
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3 讨论
近年来越来越多的实验室证实了基因免疫保护病毒感染动物的有效性[3]。另 有研究表明,DN A免疫对某些病毒感染后处于免疫无应答状态的患者可能也有治疗作用。目前基因免疫的机 制仍不明确。
HCV为单股正链RNA病毒,其基因组内有含单一的开放读框(ORF),可 分为核心蛋白区(C区)、包 膜蛋白区(E1,E2区)和非结构蛋白区(NS2～NS5区)。其中C 区是结 构基因中最保守的区 域,该区含至少5个重要的抗原表位或细胞毒T细胞(CTL)表位[4，5],兼有诱导体液 免疫和细胞免疫 的能力。因此,C区可能与HCV的免疫致病及防御密切相关,以C蛋白刺激产生的细胞免疫可能 预防同一病毒不同毒株间的交叉感染。
我们将HCV C基因片段插入真核表达载体,构建重组质粒,转染SP2/0和7721细胞 ,结果表明,C 区能够在真核细胞中表达。以重组质粒免疫BALB/c小鼠,发现该区表达产物具有较强的抗原 性,可以诱导特异性抗体产生,而且抗体的滴度与小鼠免疫的次数和剂量呈正相关,免疫次数 越多,免疫剂量越大,抗体滴度越高。因此,采用基因免疫的方法,对于诱生HCV特异性的体液 免疫和细胞免疫是可能的,本研究为进一步诱生特异性细胞免疫应答和进行动物保护实验提 供了依据。
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作者简介：冯志华, 女, 34岁，传染病学博士，主治医师；
周永兴 指导教师；男,59岁，博士生导师，主要从事肝病研究
焦成松(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
李谨革(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
李文波(第四军 医大学唐都医院传染科，西安 710038)
4 参考文献
1，Geissler M,Tokushige K,Chante C C et al.Cellular and humoral immune response t o hepatitis B virus structural proteins in mice after DNA-based immunization. G astroenterology,1997;112:1307
, 百拇医药
2，金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南. 第2版.北京：北京科学出版社，1992：19～56
3，Ulmer J B,Donnelly J J,Parker S E et al.Heterologous prot ection against infl uenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science, 1993; 259:1745
4，Cerny A,McHutchinson J G,Pasquinelli C et al.Cytotoxic T lymphocyte respon se t o hepatitis C virus derived peptides containing the HLA A2.1 binding motif. J C lin Invest,1995;95:521
5，Koziel M J,Dudley D,Afdhal N et al.Hepatitis C virus (H CV) specific cytotoxic T lymphocytes recognize epitopes in the core and envelope proteins of HCV. J V irol,1993;67:7522
[收稿1998-09-09 修回1999-04-19], http://www.100md.com