EphB2配体结合域基因片段的高效表达
作者：张晓光 刘新平 李福洋 茹晓荣 季少平 药立波 苏成芝
单位：张晓光(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；刘新平(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；李福洋(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；茹晓荣(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；季少平(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)
关键词：EphB2；表达；测序；酪氨酸蛋白激酶受体
中国免疫学杂志000403 摘 要 目的：对酪氨酸蛋白激酶受体EphB2胞外的配体结合区基因进 行表达研究。方法：编码EphB2胞外的配体结合区基因片段克隆于pBlue scriptSK(-)质粒中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆重组入表达载体pGEX4T-1, 构建高效表达克隆pHT，转化大肠杆菌DH5α表达。结果：经IPTG诱导5 h，蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析，表达出约41 kD大小的蛋白，占菌 体总蛋白的35%。结论：该区基因片段的高效表达为进一步制备其抗体 ，研究其配体-受体的相互作用等工作打下基础。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.11
High level expression of the extracellular lig and binding fragment of EphB2
ZHANG Xiao-Guang LIU Xin-Ping LI Fu-Yang
(Depar tment of Bioc hemistry and Molecular Biology,Faculty of Preclinical Medine,Fourth Military Med ical University,Xi'an 710032)
Abstract Objective：Study the expression of the extracell ular ligand binding region of receptor tyrosine kinases EphB2.Met hods:The extracellular ligand binding fragment of EphB2 was inserted into pBlueSK(-) plasmid,determined by auto-sequencing and then was cloned into the bacterial expression vector pGEX-4T-1 to get the recombinant clone referr ed to as pHT,the recombinant protein was expressed in E.coli DH5α.Re sults:The highest level expression was achieved at 5 h after IPTG ind u ction.SDS-PAGE and densitometry analysis indicate that the expressed protein wa s about 41 kD,and 35% of the total bacterial protein.Conclusion:High level expression of the target gene fragment was established for prep aration antibodies,gaining insight into the mechanisms of ligand-receptor inter action and other further research.
, 百拇医药
Key words EphB2 Expression Sequence Receptor tyrosine ki nase
近年来因参与神经系统的细胞间相互作用而倍受关注的Eph亚族(其命名源自 该亚族最早的成员Eph，erythropoietin-producing human hepatoma c el l line[1,2])，是最大的RTK亚族(Receptor tyrosine kinase)，由约15 个基因组 成。E ph亚族的基因区域化表达与神经轴突束的组织趋化性和发育途径有对应关系，从而与脑区的 形态结构以及神经网络结构的形成密切相关[3]。依据 Eph亚族在胞外结构域上同源 性，表达分布与 结合配体的不同情况，又可将其分成EphA和EphB subgroup。人EphB2(Erk,H ek5)全长序列是Kiyokawa等从人高分化胃腺癌cDNA文库中得到，EphB2和其跨 膜 配体ephrin-B1(Elk-L/Lerk2)与引导神经元向什么方向延伸发展即轴突发育路径有关 [4]。Ep hB2主要在上皮来源的组织表 达，在各种肿瘤组织和肿瘤细胞系(尤其人胃癌组织)中的表达均几倍高于相应正常组织，因而推测在胃的胚胎及肿瘤发生中起一定作用。我 们从胃癌组织细胞中克隆其胞外的配体结合区基因进行表达研究，为寻找其配基 ，探讨其功能打下基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 质粒pUC19，pBluescriptSK(-)，pGEX4T-1,菌种D H5α，JM109本室保存。编码EphB2胞外的配体结合区基因的重组质粒pGE42(又名phuc)本室构建[5]；DNA重 组所用各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶及Klenow片段，购自Borringer公司，纯化质粒DNA 所用的Kit(Wizard)，DNA回收kit,IPTG,X-gal购自Promega公司。
1.2 序列测定 用本校中心实验室自动测定仪进行DNA测序。
1.3 目的基因片段与GST融合表达质粒的构建 见图1。将测序后的pHU C重组载体用BamHI和HindIII消化，以Klenow片段补成平端，与用SmaI单酶切后的pBluescr iptSK(-)载体连接，酶切鉴定挑选反向插入的克隆，再以BamHI和EcoRI双酶切，回收切下的目的片段，与同样双酶切后的pGEX-4T-1载体定向连接，然后导入感受态E.coli DH5α菌 株，铺入平皿，过夜培养后，酶切鉴定、筛选获得阳性克隆。
, 百拇医药
图1 重组质粒pHT构建示意图
Fig.1 Construction of the recombinant plasmid pHT
1.4 诱导表达研究 阳性克隆于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，次 日1∶100转接约3 h，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，继续培养1～7 h。按常规方法进 行SDS-PAGE。表达后分别收集菌体和细胞上清。按以下方法制备细胞各组分：①用菌体悬 于100 μl溶菌酶液(溶菌酶1 mg/ml,20% 蔗糖，30 mmol/LTris-HCl，1 mmol/LEDTA)冰浴 10 min，4 ℃离心10 000 r/min,1 min,上清为外周质，沉淀重悬于100 μl 0.1 mmol/L Tr is.Cl pH8.0,冻融4 次后4 ℃离心10 000 r/min，5 min，上清为细胞质，沉淀重悬100 μl 1% Triton X-100,4℃，10 min，离心10 000 r/min，5 min为沉淀。
, 百拇医药
2 结果
2.1 表达质粒的构建 将测序后的pHUC重组载体用BamHI和HindIII消化，再以Klenow片段补成平端，琼脂糖电泳后回收片段与用SmaI单酶切后的pBluescriptSK(-)载体 连接，转化DH5α感受态细胞，EcoRI和BamHI能切下430 bp,BamHI和SmaI酶切了约300 bp 的克隆鉴定为反向插入的亚克隆即pHSS,自动测序仪测定序列。克隆片段长423 bp，序列内 部不含终止码，编码141个氨基酸。所推导的氨基酸序列与文献序列相一致[4]。再 以BamHI和EcoRI双酶切pHSS，回收切下的目的片段，与同样双酶切后的pGEX-4T-1载体定 向连接，然后导入感受态E.coli DH5α菌株，铺入平皿，过夜培养后，BamHI和EcoRI酶切 鉴定获得阳性克隆pHT(图 2)。
图2 表达重组质粒的酶切鉴定
, http://www.100md.com
Fig.2 Characterization of the recombinant plasmids with enzyme
Note:Lane 1.pGEM-7zf DNA marker(15%agarose,657,458,434,328 bp
from top to bottom);Lane 2.plasmids pHSS digested with BamHI and SmaI;
Lane 3. plasmids pHSS dige sted with EcoRI and BamHI; Lane 4.plasmids pHT
digested with EcoRI and BamHI
2.2 EphB2胞外配体结合区基因的GST融合表达 插入表达载体pGEX-4T-1中的EphB2胞外的配体结合区基因，经IPTG诱导得稳定表达。图3显示未诱导的重组载体 无明显目的的蛋白表达，经诱导后得到大小约41.0 kD蛋白表达。SDS-PAGE可见分子量约为 41.0 kD的新生蛋白带，与预期的蛋白分子大小相一致。表达产物带随诱导时间延长而逐渐 加深，到5 h最深，薄层扫描分析，表达率占细胞总蛋白的35%，表达组分结果表明表达产物 位于沉淀中(图3)。
, 百拇医药
图3 EphB2胞外的配体结合区基因表达后细胞组分分析
Fig.3 Assay the expression product of pHT in E.coli
Note:Lane 1.part of periplasm;Lane 2.part of intracellular;
Lane 3.part of precipitation;Lane 4.negative control;
Lane 5.induced pHT(97.4,66.2,43.0,31.0,20.1,14.4 kD);
Lane 6.The protein marker(94.0,67.0,43.0,21.0 and
, http://www.100md.com
14.4 kD respectively,from top to bottom)
3 讨论
Eph是一大类新发现的酪氨酸蛋白激酶受体(RTK)，现代分子生物学技术的发展使Eph亚族迅 速壮大成为RTK最大的家族，鉴于其广泛的种属和组织分布，结构上的高度保守，提示它们 在细胞内具有重要的生理功能，尽管有研究表明，Eph亚族参与神经系统的细胞间相互作用及轴突发育路径有关，Eph、hek、erk、elk等与人肿瘤发生有关 ，然而至今对他们的功能的认识仍然非常有限，最近Gale在恶性胶质瘤细胞观察到EphB2受体(Nuk/Cek5/Sek3 )被配体ephrin-B1激活而导致胞内一个62～64 kD(p62[dok])蛋白发生酪氨酸磷化，后 者与Ras GTPase激活蛋白RasGAP和含SH2/SH3结构域的接头蛋白Nck形成复合物，E phB2跨膜区保守的Y604和 Y610是其与RasGAP结合的关键位点[6]。究竟EphB2及其配体在各种病理生 理 状态中有什么特殊作用，其信号转导途径等仍需大量研究加以证实，继续克隆新的配体必将 有助于对其功能的探索。
, 百拇医药
将克隆的外源基因置于原核细胞的强启动子(如PL，Lac,trp)下，可以保证较强 的转录，而 用融合蛋白表达系统，可将转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制，既保证有较 强转录，又保证了翻译的起始，可使克隆的 外源基因得到高效表达，并且可用谷胱甘肽亲合层析分离融合蛋白，既而用凝血酶切除GST 。 我们应用基因工程方法，从人胃癌新鲜组织中克隆EphB2的胞外配体结合域的基因片段， 并得以稳定高效的融合表达，表达量占菌体总蛋白的35%，这为蛋白的纯化和进一步研究其 介导功能，寻找其新配基，探讨配基与受体作用及其信号转导打下坚实基础。
国家自然科学基金(39800027)资助
作者简介：张晓光, 女,30岁，分子免疫学博士生；
苏成芝 指导教师，男,教授,博士生导师，主要从事分子生物和免疫学的研究
药立波(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)
, 百拇医药
苏成芝(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)
4 参考文献
1，Eph Nomenclature Committee[letter].Unified nomenclature for Eph fam ily receptors and their ligands,the ephrins.Cell,1997;90(3):403
2，Hirai H,Maru Y,Hagiwara K et al.A novel putative tyrosine kina se receptor encoded by the eph gene.Science, 1987;238:1717
3，Smith A,Robinson V,Patel K.The EphA4 and EphB1 receptor tyrosine kinases and ephrin-B2 ligand regulate targeted migration of branchial neural crest cel ls.Curr Biol,1997;7(8):561
, 百拇医药
4，Kiyokawa E,Takai S,Tanaka M.Overexpression of ERK,an EPH family receptor pr otein tyrosine kinase,in varous human tumors. Cancer Research,1994;54:3645
5，张晓光，王，方，闫小君 et al.胃癌高表达基因 ErK的扩增、克隆和鉴 定.第四军医大学学报，1997；18(6)：562
6，Holland S J,Gale N W,Gish G D et al.Juxtamembrane tyrosine res idue s couple the Eph family receptor EphB2/Nuk to specific SH2 domain proteins in ne uronal cells.EMBO J，1997;16(13):3877
[收稿1998-09-23 修回1999-03-15], http://www.100md.com
单位：张晓光(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；刘新平(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；李福洋(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；茹晓荣(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)；季少平(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)
关键词：EphB2；表达；测序；酪氨酸蛋白激酶受体
中国免疫学杂志000403 摘 要 目的：对酪氨酸蛋白激酶受体EphB2胞外的配体结合区基因进 行表达研究。方法：编码EphB2胞外的配体结合区基因片段克隆于pBlue scriptSK(-)质粒中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆重组入表达载体pGEX4T-1, 构建高效表达克隆pHT，转化大肠杆菌DH5α表达。结果：经IPTG诱导5 h，蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析，表达出约41 kD大小的蛋白，占菌 体总蛋白的35%。结论：该区基因片段的高效表达为进一步制备其抗体 ，研究其配体-受体的相互作用等工作打下基础。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.11
High level expression of the extracellular lig and binding fragment of EphB2
ZHANG Xiao-Guang LIU Xin-Ping LI Fu-Yang
(Depar tment of Bioc hemistry and Molecular Biology,Faculty of Preclinical Medine,Fourth Military Med ical University,Xi'an 710032)
Abstract Objective：Study the expression of the extracell ular ligand binding region of receptor tyrosine kinases EphB2.Met hods:The extracellular ligand binding fragment of EphB2 was inserted into pBlueSK(-) plasmid,determined by auto-sequencing and then was cloned into the bacterial expression vector pGEX-4T-1 to get the recombinant clone referr ed to as pHT,the recombinant protein was expressed in E.coli DH5α.Re sults:The highest level expression was achieved at 5 h after IPTG ind u ction.SDS-PAGE and densitometry analysis indicate that the expressed protein wa s about 41 kD,and 35% of the total bacterial protein.Conclusion:High level expression of the target gene fragment was established for prep aration antibodies,gaining insight into the mechanisms of ligand-receptor inter action and other further research.
, 百拇医药
Key words EphB2 Expression Sequence Receptor tyrosine ki nase
近年来因参与神经系统的细胞间相互作用而倍受关注的Eph亚族(其命名源自 该亚族最早的成员Eph，erythropoietin-producing human hepatoma c el l line[1,2])，是最大的RTK亚族(Receptor tyrosine kinase)，由约15 个基因组 成。E ph亚族的基因区域化表达与神经轴突束的组织趋化性和发育途径有对应关系，从而与脑区的 形态结构以及神经网络结构的形成密切相关[3]。依据 Eph亚族在胞外结构域上同源 性，表达分布与 结合配体的不同情况，又可将其分成EphA和EphB subgroup。人EphB2(Erk,H ek5)全长序列是Kiyokawa等从人高分化胃腺癌cDNA文库中得到，EphB2和其跨 膜 配体ephrin-B1(Elk-L/Lerk2)与引导神经元向什么方向延伸发展即轴突发育路径有关 [4]。Ep hB2主要在上皮来源的组织表 达，在各种肿瘤组织和肿瘤细胞系(尤其人胃癌组织)中的表达均几倍高于相应正常组织，因而推测在胃的胚胎及肿瘤发生中起一定作用。我 们从胃癌组织细胞中克隆其胞外的配体结合区基因进行表达研究，为寻找其配基 ，探讨其功能打下基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 质粒pUC19，pBluescriptSK(-)，pGEX4T-1,菌种D H5α，JM109本室保存。编码EphB2胞外的配体结合区基因的重组质粒pGE42(又名phuc)本室构建[5]；DNA重 组所用各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶及Klenow片段，购自Borringer公司，纯化质粒DNA 所用的Kit(Wizard)，DNA回收kit,IPTG,X-gal购自Promega公司。
1.2 序列测定 用本校中心实验室自动测定仪进行DNA测序。
1.3 目的基因片段与GST融合表达质粒的构建 见图1。将测序后的pHU C重组载体用BamHI和HindIII消化，以Klenow片段补成平端，与用SmaI单酶切后的pBluescr iptSK(-)载体连接，酶切鉴定挑选反向插入的克隆，再以BamHI和EcoRI双酶切，回收切下的目的片段，与同样双酶切后的pGEX-4T-1载体定向连接，然后导入感受态E.coli DH5α菌 株，铺入平皿，过夜培养后，酶切鉴定、筛选获得阳性克隆。
, 百拇医药
图1 重组质粒pHT构建示意图
Fig.1 Construction of the recombinant plasmid pHT
1.4 诱导表达研究 阳性克隆于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，次 日1∶100转接约3 h，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，继续培养1～7 h。按常规方法进 行SDS-PAGE。表达后分别收集菌体和细胞上清。按以下方法制备细胞各组分：①用菌体悬 于100 μl溶菌酶液(溶菌酶1 mg/ml,20% 蔗糖，30 mmol/LTris-HCl，1 mmol/LEDTA)冰浴 10 min，4 ℃离心10 000 r/min,1 min,上清为外周质，沉淀重悬于100 μl 0.1 mmol/L Tr is.Cl pH8.0,冻融4 次后4 ℃离心10 000 r/min，5 min，上清为细胞质，沉淀重悬100 μl 1% Triton X-100,4℃，10 min，离心10 000 r/min，5 min为沉淀。
, 百拇医药
2 结果
2.1 表达质粒的构建 将测序后的pHUC重组载体用BamHI和HindIII消化，再以Klenow片段补成平端，琼脂糖电泳后回收片段与用SmaI单酶切后的pBluescriptSK(-)载体 连接，转化DH5α感受态细胞，EcoRI和BamHI能切下430 bp,BamHI和SmaI酶切了约300 bp 的克隆鉴定为反向插入的亚克隆即pHSS,自动测序仪测定序列。克隆片段长423 bp，序列内 部不含终止码，编码141个氨基酸。所推导的氨基酸序列与文献序列相一致[4]。再 以BamHI和EcoRI双酶切pHSS，回收切下的目的片段，与同样双酶切后的pGEX-4T-1载体定 向连接，然后导入感受态E.coli DH5α菌株，铺入平皿，过夜培养后，BamHI和EcoRI酶切 鉴定获得阳性克隆pHT(图 2)。
图2 表达重组质粒的酶切鉴定
, http://www.100md.com
Fig.2 Characterization of the recombinant plasmids with enzyme
Note:Lane 1.pGEM-7zf DNA marker(15%agarose,657,458,434,328 bp
from top to bottom);Lane 2.plasmids pHSS digested with BamHI and SmaI;
Lane 3. plasmids pHSS dige sted with EcoRI and BamHI; Lane 4.plasmids pHT
digested with EcoRI and BamHI
2.2 EphB2胞外配体结合区基因的GST融合表达 插入表达载体pGEX-4T-1中的EphB2胞外的配体结合区基因，经IPTG诱导得稳定表达。图3显示未诱导的重组载体 无明显目的的蛋白表达，经诱导后得到大小约41.0 kD蛋白表达。SDS-PAGE可见分子量约为 41.0 kD的新生蛋白带，与预期的蛋白分子大小相一致。表达产物带随诱导时间延长而逐渐 加深，到5 h最深，薄层扫描分析，表达率占细胞总蛋白的35%，表达组分结果表明表达产物 位于沉淀中(图3)。
, 百拇医药
图3 EphB2胞外的配体结合区基因表达后细胞组分分析
Fig.3 Assay the expression product of pHT in E.coli
Note:Lane 1.part of periplasm;Lane 2.part of intracellular;
Lane 3.part of precipitation;Lane 4.negative control;
Lane 5.induced pHT(97.4,66.2,43.0,31.0,20.1,14.4 kD);
Lane 6.The protein marker(94.0,67.0,43.0,21.0 and
, http://www.100md.com
14.4 kD respectively,from top to bottom)
3 讨论
Eph是一大类新发现的酪氨酸蛋白激酶受体(RTK)，现代分子生物学技术的发展使Eph亚族迅 速壮大成为RTK最大的家族，鉴于其广泛的种属和组织分布，结构上的高度保守，提示它们 在细胞内具有重要的生理功能，尽管有研究表明，Eph亚族参与神经系统的细胞间相互作用及轴突发育路径有关，Eph、hek、erk、elk等与人肿瘤发生有关 ，然而至今对他们的功能的认识仍然非常有限，最近Gale在恶性胶质瘤细胞观察到EphB2受体(Nuk/Cek5/Sek3 )被配体ephrin-B1激活而导致胞内一个62～64 kD(p62[dok])蛋白发生酪氨酸磷化，后 者与Ras GTPase激活蛋白RasGAP和含SH2/SH3结构域的接头蛋白Nck形成复合物，E phB2跨膜区保守的Y604和 Y610是其与RasGAP结合的关键位点[6]。究竟EphB2及其配体在各种病理生 理 状态中有什么特殊作用，其信号转导途径等仍需大量研究加以证实，继续克隆新的配体必将 有助于对其功能的探索。
, 百拇医药
将克隆的外源基因置于原核细胞的强启动子(如PL，Lac,trp)下，可以保证较强 的转录，而 用融合蛋白表达系统，可将转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制，既保证有较 强转录，又保证了翻译的起始，可使克隆的 外源基因得到高效表达，并且可用谷胱甘肽亲合层析分离融合蛋白，既而用凝血酶切除GST 。 我们应用基因工程方法，从人胃癌新鲜组织中克隆EphB2的胞外配体结合域的基因片段， 并得以稳定高效的融合表达，表达量占菌体总蛋白的35%，这为蛋白的纯化和进一步研究其 介导功能，寻找其新配基，探讨配基与受体作用及其信号转导打下坚实基础。
国家自然科学基金(39800027)资助
作者简介：张晓光, 女,30岁，分子免疫学博士生；
苏成芝 指导教师，男,教授,博士生导师，主要从事分子生物和免疫学的研究
药立波(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)
, 百拇医药
苏成芝(第四军 医大学生物化学与分子生物学教研室，西安 710033)
4 参考文献
1，Eph Nomenclature Committee[letter].Unified nomenclature for Eph fam ily receptors and their ligands,the ephrins.Cell,1997;90(3):403
2，Hirai H,Maru Y,Hagiwara K et al.A novel putative tyrosine kina se receptor encoded by the eph gene.Science, 1987;238:1717
3，Smith A,Robinson V,Patel K.The EphA4 and EphB1 receptor tyrosine kinases and ephrin-B2 ligand regulate targeted migration of branchial neural crest cel ls.Curr Biol,1997;7(8):561
, 百拇医药
4，Kiyokawa E,Takai S,Tanaka M.Overexpression of ERK,an EPH family receptor pr otein tyrosine kinase,in varous human tumors. Cancer Research,1994;54:3645
5，张晓光，王，方，闫小君 et al.胃癌高表达基因 ErK的扩增、克隆和鉴 定.第四军医大学学报，1997；18(6)：562
6，Holland S J,Gale N W,Gish G D et al.Juxtamembrane tyrosine res idue s couple the Eph family receptor EphB2/Nuk to specific SH2 domain proteins in ne uronal cells.EMBO J，1997;16(13):3877
[收稿1998-09-23 修回1999-03-15], http://www.100md.com