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编号:10258267
从健康人外周血中建立异种抗原特异性的T细胞系初探
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 2000年第6期
     作者:谢晋 李宁丽 张冬青 沈佰华 周光炎

    单位:谢晋(上海第二医科大学上海市免疫学研究所,上海 200025);李宁丽(上海第二医科大学上海市免疫学研究所,上海 200025);张冬青(上海第二医科大学上海市免疫学研究所,上海 200025);沈佰华(上海第二医科大学上海市免疫学研究所,上海 200025);周光炎(上海第二医科大学上海市免疫学研究所,上海 200025)

    关键词:异种细胞抗原;异种移植;T细胞系

    中国免疫学杂志000611 摘 要 目的:为了探讨异种器官移植中T细胞参与的免疫排斥机理,从健康人外周血中试行建立识别猪淋巴细胞抗原特异性的T细胞系方法研究。方法:通过照光致弱的猪外周血单个核细胞反复刺激人的T淋巴细胞,3H-TdR掺入法筛选特异性增殖的T细胞。结果:获得2株为TCRαβ+ CD3+CD8+细胞,另1株为TCRαβ+ CD3+CD4+细胞。结论:健康人外周血中有识别异种抗原特异性的T细胞系,但出现频率较低。
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    中国图书分类号 R392.4

    The generation of xeno-antigen specific T lymphocyte lines

    XIE Jin, LI Ning-Li, ZHANG Dong-Qing et al

    (Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Immunology,Shanghai 200025)

    Abstract Objective: In order to study the mechanism of T lymphocytes immune rejection in xenotransplantation,the authors construct a method of xeno-antigen specific T cell lines.Methods:Human T cell was restimulated by irradiated porcine periphery blood monocyte every other two weeks, and selected by 3 H-thymidine incorporation.Results:Two of the T cell lines are TCR α β CD3CD8 positive, the other is almost shared in TCRαβ+ CD3+CD4+ ; but NKT cells (CD3+CD56+) are found in the three T cell lines.Conclusions:The frequency which the T cell lines specially recognized xen-antigen was very low in normal human peripheral blood.
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    Key words Xeno-antigen Xenotranplantation T cell lines

    体外建立抗原特异性T淋巴细胞克隆或细胞系研究T细胞分化发育及其参与的免疫应答具有重要意义。尤其在研究T细胞对抗原识别中的MHC限制性,分析T细胞表位及T细胞克隆特性(Clonality)方面尤为可行[1,2]。本文报道应用猪的外周血单个核细胞作抗原,从健康人外周血中成功地建立3株特异性T细胞系,其分化抗原表型为TCRαβ+ CD3+CD4+ 或TCRαβ+ CD3+CD8+,并对猪细胞抗原表现出良好的应答特异性。

    1 材料与方法

    1.1 外周血单个核细胞的分离 HLA.A2阳性健康人和中国广西小型猪(中国科学院上海实验动物中心)的外周血各20 ml,肝素抗凝,Ficoll(1.077)分离单个核细胞(PBMC),PBS洗涤3次,少量的红细胞用ACK(155 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,110 mmol/L EDTA,pH7.3)裂解,再洗涤3次,用含谷胺酰胺2 mmol/L、丙酮酸钠10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、5%人AB血清的RPMI-1640培养液调整人和猪PBMC至1×106 ml-1,备用。
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    1.2 T细胞建系 建立异种抗原特异性T细胞系采用标准的半有限稀释法[3-5],简述如下。

    初次培养:用5%自体血清的RPMI-1640调整人和猪细胞至1×106 ml-1,人PBMC加入96孔‘U’型板(Nunc,丹麦),100 μl/孔,猪PBMC经3 000 rad辐照作刺激细胞(100 μl/孔)。37℃、5%CO2、培养3 d后,弃100 μl上清,同时加入含IL-2(20 U/ml)的新鲜RPMI-1640 100 μl,以后每隔2 d换液1次,直至14 d。

    异种抗原特异性T细胞出现频率分析:第15天完全弃去含IL-2的营养液,加入不含IL-2的RPMI-1640每孔150 μl至初次培养的T细胞中,将细胞悬液均分入3孔中,同时在3孔中加入2×105抗原递呈细胞(APC)(即经3 000 rad辐照后的来源同一个体的PBMC),在这3孔中,一孔不加刺激细胞,作为对照组;另两孔加刺激细胞,分别为试验组与备份组。APC和刺激细胞每孔各加50 μl(2×106 ml-1),培养72 h,培养终止前18 h加1 μCi[3H]thymidine(上海原子核研究所),收集试验组与对照组细胞,β液闪仪测定cpm值。计算刺激指数SI≥3孔数,统计异种抗原特异性T细胞频率。并且挑选刺激指数SI≥3的备份组细胞至新板中,继续培养,用含IL-2 的RPMI-1640每隔2 d换液一次,至28 d。
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    再刺激与异种抗原特异性分析:第29天,收集同一孔来源细胞,调整细胞浓度至1.6×106 ml-1(50 μl/孔),再用猪细胞刺激,筛选SI≥3备份组细胞为异种抗原特异性T细胞,方法同异种抗原特异性T细胞出现频率分析。根据细胞长势扩增细胞,待细胞达到一定量时进行细胞表型鉴定。

    1.3 表型鉴定 荧光标记鼠抗人系列单抗CD3-FITC/CD56-PE、TCRγδ-FITC/TCRαβ-PE、CD4-FITC/CD8-PE、鼠IgGγ1-FITC/γ2-PE对照抗体均来自B.D.Comp,IL-2(Boerhringer Mannheim)。

    收集细胞(5×105/管),分别加CD3/CD56、TCRγδ/TCRαβ、CD4/CD8、鼠IgGγ1/γ2对照抗体,混匀,4℃,30 min,PBS(1%小牛血清)洗涤3次,2%多聚甲醛固定,进行流式细胞仪检测。
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    2 结果

    2.1 异种抗原特异性T淋巴系频率分析 用γ射线辐照致弱的猪淋巴细胞再次刺激初次培养人淋巴细胞后,经3H-TdR掺入试验分析筛选SI≥3(表1)为阳性反应细胞。本试验中60孔细胞共筛选出 4孔细胞阳性细胞,故异种抗原特异性T细胞频率为6.67%。

    表1 特异性T细胞频率(即第2次刺激数值)

    Tab.1 Specific T cells frequency T cell lines

    Control(cpm)

    Positive(cpm)

    SI(positive/control)

, 百拇医药     A

    4 624

    57 374

    12.4

    B

    9 724

    66 392

    6.8

    C

    5 820

    17 526

    3.0

    D
, 百拇医药
    6 076

    46 462

    7.6

    2.2 异种抗原特异性分析 培养29 d时,用γ射线辐照致弱的猪淋巴细胞再次刺激阳性T细胞,经3H-TdR掺入试验分析筛选SI≥3,得到3株特异性针对刺激细胞增殖的T细胞(表2)。因为其中异种抗原特异性T细胞出现频率中SI=3的‘C’细胞株,逐渐失去抗原特异性增殖的能力。另3株特异性T细胞(A,B,D)能在体外长期不断扩增增殖,此为异种抗原特异性T细胞。

    表2 异种抗原特异性(即第3次刺激数值)

    Tab.2 Xeno-antigen specific T cell lines T cell lines

    Control(cpm)
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    Positive(cpm)

    SI(positive/control)

    A

    10 275±2 748

    34 044±3 874

    3.3

    B

    1 184±327

    7 283±1 517

    6.2

    C

    8 278±741
, 百拇医药
    15 586±3 199

    1.9

    D

    5 307±1391

    15 825±2 289

    3.0

    2.3 T细胞系表型分析 用流式细胞仪分析3株T细胞系(A,B,D)表型(表3),结果表明:第一,全部为TCRαβ阳性;第二,两株为CD8(>90%)阳性,一株为CD4(>64%)为主;第三,单独NK细胞标记(CD56)阳性细胞小于1%,而CD3+CD56+双阳性细胞比例相对较高,介于25%至54%之间。

    表3 T细胞系表型(%)
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    Tab.3 T cells phenotype(%) T cell lines

    CD3+

    CD4+

    CD8+

    CD3-CD56+

    CD3+CD56+

    TCRαβ

    TCRγδ

    A

    98.50

    71.99
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    28.99

    0.37

    28.43

    99.47

    2.69

    B

    98.81

    0.51

    91.84

    0.10

    25.41

    93.12

    1.83
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    D

    99.92

    1.52

    89.77

    0.05

    53.45

    98.46

    4.67

    3 讨论

    由于抗原分为可溶性抗原和细胞抗原,因此建立T细胞克隆或系的方法很多,原理是用抗原反复刺激与筛选抗原特异性的T细胞。这种体外建立抗原特异性T细胞系的方法在抗原诱发的免疫机理研究中十分重要。为了深入研究异种移植的细胞性排斥机理,我们用异种细胞作为刺激抗原,在体外反复刺激健康人外周血T细胞,经3H-TdR掺入法筛选得到特异性增殖的T细胞。本试验中建立的特异性T细胞株中有部分呈NK细胞表面标记(CD3+CD56+),称NK样T细胞(NKT)。体内,该类细胞在骨髓含量较高,是不成熟的细胞;发育成熟后,在外周血中,NKT细胞量很少,几乎检测不出[6]。有关抗原特异性T细胞株和NK T细胞生理学功能正在进一步研究。
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    建立T细胞系的技术要点是:首先,在第1次刺激时,培养基中应加自体血清以减少自身反应性T细胞增殖。第二,在第2次刺激后加入自体APC细胞很重要,抗原需经加工递呈才能进一步激活T细胞增殖反应。并且APC细胞递呈不同抗原表位,甚至优势表位都可影响T细胞增殖强度。第三,细胞抗原刺激细胞增殖强度往往弱于可溶性抗原,在细胞生长旺盛期时扩增细胞,当达到一定数量后,应立即进行细胞功能研究。最后,应用3H-TdR掺入法筛选阳性增殖T细胞是可行的,在此基础上可根据实验要求,进一步做有限稀释建立T细胞克隆。

    国家自然科学基金重大项目资助(No.39993430)

    作者简介:谢晋,男,28岁,博士研究生,主要从事移植免疫研究

    参考文献

    1,Kumagai-Braesch M, Satake M, Koregren O et al. Characterization of cellular human anti-porcine xenoreactivity. Clin Transpl, 1993;7:273
, http://www.100md.com
    2,Yamada K, Sachs D H, Dersimonian H. Human anti-porcine xenogeneic T cell response: Evidence for allelic specificity of mixed leukocyte reaction

    and for both direct and indirect pathways of recognition. J Immunol, 1995;155: 5249

    3,Banerjee S, Webber C, Poole A R. The induction of arthritis in mice by the cartilage proteoglycan aggrecan: role of CD4+ and CD8+ cells. Cell Immunol, 1992;144: 347
, http://www.100md.com
    4,Leroux J Y, Guerassimov A, Cartman A et al. Immunity to the G1 Globular domain of the cartilage prpteoglycan aggrecan can induce inflammatory erosive polyarthritis and spondylitis in BALB/C mice but imminity to G1 is inhibited by covaently bound keratan sulfate in vitro and in vivo. J Clin Invest, 1996;97: 621

    5,Zhang Y P, Guerassinov A, Leroux J Y et al. Arthritis induced by proteoglycan aggrecn G1 domain in Balb/c mice: Evidence of T cell Involvement and the immunosuppressive influence of keratan sulfate on recognition of T and B cell Epitopes. J Clin Invest, 1998;101:1678

    6,Eberl G, Robson MacDonald H. Rapid death and regeneration of NKT cells in anti-cd3ε- or IL-12-Treated mice: A major role for bone marrow in NKT cell homeostasis. Immunity,1998;9: 345

    收稿1999-08-19 修回1999-11-10, http://www.100md.com