自身抗原SSB/La抗原优势表位分析
作者：邓安梅 仲人前 陈孙孝 施笑梅 孔宪涛
单位：邓安梅(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；仲人前(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；陈孙孝(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；施笑梅(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；孔宪涛(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)
关键词：自身抗原SSB/La；表位分析；重组抗原；免疫印迹
中国免疫学杂志000601 摘 要 目的: 探讨自身抗原La的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据。方法: 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用PCR法克隆自身抗原La多肽片段的cDNA，定向插入表达载体PGEX-2T，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用GST亲合层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果：SSB/La的抗原优势表位主要存在于1～28，80～107，108～188，283～338位。不同病人在不同病程的La优势表位有所不同。结论: 抗原驱动机制在自身免疫疾病的发病中起重要作用, 且存在表位扩展趋势。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.11
Epitope analysis of autoantigen SSB/La
DENG An-Mei, ZHONG Ren-Qian, CHEN Sun-Xiao et al.Clinical Immunology (Center,Changzheng Hospital, Shanghai 200003)
Abstract Objective: The interactions between autoantigen and autoantibody play an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases. In view of analysis of the epitopes of autoantigen SSB/La to understand the molecular mechanism of autoimmune diseases. Methods:Based on the sequence analysis of autoantigen SSB/La, the seven fractions of SSB/La GST-antigen fusion proteins induced by IPTG in E.coli.JM109 were obtained.The epitopes of SSB/La were analyzed by IBT and competitive inhibition reaction. Results:The epitopes of SSB/La were existed on aa 1～28，80～107，108～188，283～338.Conclusion:The antigen-driving mechanism play an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases.
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Key words Autoantigen SSB/La Epitope analysis Recombinant antigen Immunoblot
在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等自身免疫病的发病机制中，自身抗原和抗体的反应起着重要的作用。在分析抗核抗原抗体(ANA)的产生机制时，重组DNA技术是一项重要的工具。自身抗体的产生可能有多克隆B细胞激活、自身分子模拟等机制参与。已有证据表明，在一些自身抗体反应中有多克隆B细胞的激活，而用重组核抗原的研究又提示ANA反应由自身抗原诱导和维持[1]。在自身免疫性心肌炎中存在自身抗原的分子模拟机制，在心肌抗原和A组β型溶血型链球菌之间可产生交叉反应。在抗核抗体(ANA)的诱导过程中也存在分子模拟机制，在U1SnRNP的70 kD蛋白质的一个表位与反转录病毒p30gag蛋白具有同源性; 在人类免疫缺陷病毒(HIV)壳蛋白上具有与数种自身抗原同源的表位，包括La抗原的N端表位，这些都提示病毒在ANA产生中的启动作用。
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为研究自身免疫病发病中的抗原驱动机理，我们在计算机软件分析抗原位点的基础上，应用重组DNA技术克隆SSB/La片段，而后分析其与抗血清的反应，以期发现SSB/La的抗原优势表位, 为疾病的诊治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 受检血清和实验材料 抗La阳性血清为本中心保存的SLE患者血清, 经以往的研究证实与本中心克隆表达的La抗原反应阳性[2]；PGEX-2T质粒,JM109菌株,La cDNA clone pLaA; TaqDNA多聚酶，EcoRI内切酶，BamHI内切酶，T4DNA连接酶，Rnasin，IPTG (Promega); QINprep Plasmid Miniprep Kit, DNA extraction Kit (QINGENE)。
1.2 用PCR法克隆SSB/La cDNA片段 根据计算机软件分析SSB/La抗原序列的结果(另文发表)，我们用PCR法扩增7个cDNA片段，分别编码1～80，28～107，1～107,108～282，188～282，283～408，338～408位。引物设计根据已知人SSB/La DNA序列，在5'和3' 端分别加上BamHI和 EcoRI酶切位点。
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PCR反应体系: Tris-HCl (pH8.6) 10 mmol/L, KCl 50 mmol/L, MgCl2 1.5 mmol/L, TaqDNA多聚酶5 U/100 μl, 5'和3'引物各为0.25 μmol/L, 模板pLaA 质粒2 μl, 4种dNTP各200 mmol/L, 总体积50 μl。 扩增条件:94℃ 4 min;93℃ 30 s, 48℃ 30 s, 72℃ 2.5 min, 共3个循环；93℃ 30 s,62℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共25个循环；72℃ 8 min。扩增产物经溴化乙锭琼脂糖电泳, 然后用纯化试剂盒回收PCR产物。将纯化的PCR扩增产物用Taq酶Sanger双脱氧链末端终止法测序证实[3]。
1.3 SSB/La cDNA片段的表达 将经过DNA测序鉴定的纯化的PCR扩增产物及原核表达载体PGEX-2T分别经EcoRI和XhoI双酶切后，再经T4DNA连接酶作用，将La cDNA片段定向插入PGEX-2T。挑取经鉴定后的重组克隆于LB/Amp培养液37℃振摇过夜，次日1:100稀释转种于新的LB/Amp培养液中，37℃振摇培养约3 h(OD值约为0.5～0.6), 然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导3 h，超声破碎菌液后，经GST亲合层析柱纯化，得到SSB/La抗原的7种片段肽。进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色。具体步骤参见文献[2]。
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1.4 免疫印迹法分析各片段抗原性 将上述各片段肽经SDS-PAGE电泳后进行转印，200 mA,40 V,2 h。将转印后的NC膜剪成条带，用含3%BSA的PBS(pH7.4)封闭1 h。用封闭液1:500稀释50份抗La阳性血清、正常人血清，孵育1 h，PBS洗涤3次。加1:1 000稀释的HRP标记的兔抗人IgG抗体，37℃孵育1 h，充分洗涤后加入3，3-二氨联苯胺底物反应显色。
1.5 竞争抑制法分析各片段抗原性 将抗SSB/La血清混和物与重组SSB/La抗原及上述各片段肽预先在室温孵育1 h，而后与Molt-4细胞裂解液转印条带进行免疫印迹反应，方法同上。
2 结果
2.1 SSB/La cDNA片段的PCR产物 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量210～540 bp之间可见7条清晰的特异性扩增条带，符合我们的预期目的，如图1。
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图1 SSB/La cDNA片段PCR产物电泳图
Fig.1 Gel electrophoresis of the PCR products of SSB/La cDNA fractions
Note:1～4，6～8：PCR products of La l～La 7;5:DNA marker
2.2 重组融合蛋白的表达及纯化 SSB/La的7个片段肽的区域如图2。7个片段肽在大肠杆菌JM109株中，通过表达载体PGEX-2T得到表达。其产物经GST亲合层析柱纯化，进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，如图3。
图2 PCR法扩增的SSB/La cDNA片段
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Fig.2 The recombinant fusion protein profiles of SSB/La fractions
图3 SSB/La 片段重组融合蛋白SDS-PAGE电泳图
Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of the recombinant fusion proteins of SSB/La fractions
Note:1～7：fractions of La l～La 7;8:protein marker
2.3 免疫学鉴定 将50份与La全抗原反应阳性的SLE患者血清混合后，与7个片段肽的印迹条反应 ，结果如图4。La 3,La 4,La 6与混合血清反应阳性，而La 1,La 2,La 5,La 7反应阴性，表明在1～28，80～107，108～188，283～338位可能存在与抗体结合的抗原决定簇。竞争抑制实验表明，重组SSB/La，La 3，La 4,La 6可消除标准抗SSA/Ro血清与Molt-4细胞裂解液转印条之间的免疫反应，而其它抗原片段无此作用。
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图4 免疫学鉴定
Fig.4 Immunoblot of fractions
Note:1，2：SSB/La recombinant antigen;3～9：La l～La 7
2.4 SLE患者的血清反应 我们跟踪研究了3个SLE患者的血清反应，发现3年内随着病情发展，其抗体与抗原片段的反应有所不同，见表1。
表1 SLE患者血清与抗原片段反应的动态观察
Tab.1 Longitual studies of SLE patients'sera Patient
Antigen fractions binding to antibody
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1st year
2nd year
3rd year
1
La 3
La 3,La 4,La 1
La 3,La 4
2
La 3,La 4
La 3,La 6
La 3,La 4,La 6
3
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La 3,La 7
La 3,La 4
La 3,La 4
3 讨论
我们在计算机软件分析自身抗原SSB/La的氨基酸序列结构，预测抗原位点的基础上，设计特异性引物，通过DNA重组得到7个SSB/La cDNA的亚克隆，并在大肠杆菌JM109中得到表达。通过免疫印迹法来考察各片段对抗体的反应性，并通过分析片段之间的关系来研究 SSB/La 抗原优势表位。
我们用50份与La全抗原反应阳性的SLE患者血清混和物来代表患者总体水平，反映SSB/La的抗原优势决定簇。结果表明，片段La 3，La 4， La 6具有抗原性，表明在1～28，80～107，108～188，283～338位可能存在与抗体结合的抗原决定簇，包括了抗原性预测中的2个，而抗原性预测中的220～240位，在我们的实验中未显示抗原性。蛋白质作为B细胞抗原所暴露的部位取决于蛋白质的性质和宿主因素，La的抗原优势表位与其亲水性位点有差异，其间还涉及抗原、抗体的其它因素(如三级结构，翻译后修饰，RNA结合等)。La分子的抗原位点和RNA结合区位于高度螺旋化和带阳性电荷的区域, 至少存在3个分离的自身免疫表位。可能我们选择的亚克隆位点对免疫反应性会有所影响，因为患者血清来源的数量及种属差异，所用技术方法的不同(如表达系统、检测方法、抗原制备过程的差异)，所连接GST蛋白质对抗原抗体反应影响，不同位点的竞争抑制性不同。此外，要确定抗原位点，还需明确三维结构。
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在本研究中，La 3显示强烈的抗原性。有资料表明，SSB/La的88～101 位与反转录病毒gag多肽氨基酸有高度同源性,这提示交叉免疫可能是自身免疫的发病机制之一[4]。抗体识别La/SSB抗原上的反转录病毒同源序列，也可能与相邻区域序列产生反应；自身抗原与病毒蛋白的同源性还可导致T细胞耐受丧失而产生对自身抗原的反应。病毒感染可产生的抗体识别表位有限，而在自身免疫反应中存在多个表位反应，包括一些结构型表位，提示在抗体产生过程中，分子模拟机制和自身抗原反应并不是相互排斥的。
序列分析表明在La aa 111～187之间有RNA识别结构(RRM)，包括2个同源序列(RNP1和RNP2)以及许多疏水性保守性氨基酸。在这个重要的保守性功能区域含有人特异性抗体表位，然而，针对LaRRM的反应如何产生及其与疾病机制的关系尚不清楚。在许多激发自身免疫反应的胞内蛋白的保守性表位，也是分子内活性或易酶解的位点[5]，可能与核酸结合的蛋白质区域在自身免疫反应中更具免疫原性。研究这些表位的免疫遗传机制，有助于理解自身免疫机制。
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本研究对3个SLE患者血清抗SSB/La 片段抗原的反应进行了跟踪检测，发现各患者血清与抗原片段的反应性并不一致，存在个体差异性；而且在不同病程，抗原表位有所差异，这与前人提出的“表位扩展”相一致[6]。本研究的结果表明，在最初出现抗La 3的患者中出现针对其它优势表位的抗体,可能aa 1～107位是SSB/La中首先被识别的表位。反转录病毒感染可引起许多慢性系统性疾病，与癌变和成人免疫缺陷综合征有关[7]。可以作如下推测：首先是外源性反转录病毒感染或内源性反转录病毒表达，启动抗病毒蛋白的免疫反应，而后，一些抗病毒蛋白的B细胞受体可与自身抗原的表位发生交叉反应，B细胞将自身抗原分子的一部分作为免疫原递呈给宿主免疫系统，激发B细胞反应，进而，自身抗原的其它潜在性免疫原性位点也可被识别。而产生抗体不仅取决于蛋白质性质，也与个体遗传背景有关。因此各个病人的抗血清识别的表位不一定完全相同。
随着对已知蛋白一级结构，特定结构或与生物信号相关性研究不断深入，蛋白质结构预测准确率达60%～80%[8]。我们通过计算机模拟了SSB/La蛋白质分子的亲水性、柔性、抗原性，初步推测其二级结构，为进一步寻找抗原的B细胞表位，理解抗原抗体相互作用及其在发病机制中的作用打下了基础，也将有助于我们进一步认识抗原分子结构与功能之间的关系，更加了解免疫分子的识别机理。我们可以设想人类自身免疫反应由一定的分子的有限区域所激发，确定这样的区域有助于我们了解疾病机制并作进一步研究，为疾病的诊治提供依据。
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本课题受上海市启明星基金部分资助(编号 94QB14002)
作者简介:邓安梅，女，28岁，博士, 从事临床免疫学研究;仲人前，男，36岁，研究员，从事临床免疫学研究;孔宪涛，男，67岁，教授，博士生导师，从事临床免疫学研究
参考文献
1，Reichlin M.Autoantibodies to the RoRNP particles.Clin Exp Immunol,1995；99:7
2，邓安梅，仲人前，陈孙孝et al.自身抗原La融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定.中国免疫学杂志，2000；16(4)：215
3，卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993:412-414
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4，Sturgess A D,Peterson M G，McNeilage L J et al. Characteristics and epitope mapping of a cloned human autoantigen La. J Immunol,1992;140:3212
5，Habets W J,Hoet M J，Venrooy W Jvan.Epitope patterns of anti-RNP antibodies in rheamatic diseases.Arthrits Rheum,1992；33:834
6，Bachmann M,Mayet W J，Schroder H C et al. Identification of the Ro and La antigens in the endoribonuclease V-ribonucleoprotein complex.Biochem,1990;243:189
7，邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. SSB/La抗原研究进展. 中国免疫学杂志,1996;12(4):255
8，Jameson B A，Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci，1988;4(1): 181
1999-01-29
1999-08-21, 百拇医药
单位：邓安梅(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；仲人前(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；陈孙孝(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；施笑梅(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)；孔宪涛(第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海 200003)
关键词：自身抗原SSB/La；表位分析；重组抗原；免疫印迹
中国免疫学杂志000601 摘 要 目的: 探讨自身抗原La的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据。方法: 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用PCR法克隆自身抗原La多肽片段的cDNA，定向插入表达载体PGEX-2T，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用GST亲合层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果：SSB/La的抗原优势表位主要存在于1～28，80～107，108～188，283～338位。不同病人在不同病程的La优势表位有所不同。结论: 抗原驱动机制在自身免疫疾病的发病中起重要作用, 且存在表位扩展趋势。
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中国图书分类号 R392.11
Epitope analysis of autoantigen SSB/La
DENG An-Mei, ZHONG Ren-Qian, CHEN Sun-Xiao et al.Clinical Immunology (Center,Changzheng Hospital, Shanghai 200003)
Abstract Objective: The interactions between autoantigen and autoantibody play an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases. In view of analysis of the epitopes of autoantigen SSB/La to understand the molecular mechanism of autoimmune diseases. Methods:Based on the sequence analysis of autoantigen SSB/La, the seven fractions of SSB/La GST-antigen fusion proteins induced by IPTG in E.coli.JM109 were obtained.The epitopes of SSB/La were analyzed by IBT and competitive inhibition reaction. Results:The epitopes of SSB/La were existed on aa 1～28，80～107，108～188，283～338.Conclusion:The antigen-driving mechanism play an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases.
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Key words Autoantigen SSB/La Epitope analysis Recombinant antigen Immunoblot
在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等自身免疫病的发病机制中，自身抗原和抗体的反应起着重要的作用。在分析抗核抗原抗体(ANA)的产生机制时，重组DNA技术是一项重要的工具。自身抗体的产生可能有多克隆B细胞激活、自身分子模拟等机制参与。已有证据表明，在一些自身抗体反应中有多克隆B细胞的激活，而用重组核抗原的研究又提示ANA反应由自身抗原诱导和维持[1]。在自身免疫性心肌炎中存在自身抗原的分子模拟机制，在心肌抗原和A组β型溶血型链球菌之间可产生交叉反应。在抗核抗体(ANA)的诱导过程中也存在分子模拟机制，在U1SnRNP的70 kD蛋白质的一个表位与反转录病毒p30gag蛋白具有同源性; 在人类免疫缺陷病毒(HIV)壳蛋白上具有与数种自身抗原同源的表位，包括La抗原的N端表位，这些都提示病毒在ANA产生中的启动作用。
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为研究自身免疫病发病中的抗原驱动机理，我们在计算机软件分析抗原位点的基础上，应用重组DNA技术克隆SSB/La片段，而后分析其与抗血清的反应，以期发现SSB/La的抗原优势表位, 为疾病的诊治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 受检血清和实验材料 抗La阳性血清为本中心保存的SLE患者血清, 经以往的研究证实与本中心克隆表达的La抗原反应阳性[2]；PGEX-2T质粒,JM109菌株,La cDNA clone pLaA; TaqDNA多聚酶，EcoRI内切酶，BamHI内切酶，T4DNA连接酶，Rnasin，IPTG (Promega); QINprep Plasmid Miniprep Kit, DNA extraction Kit (QINGENE)。
1.2 用PCR法克隆SSB/La cDNA片段 根据计算机软件分析SSB/La抗原序列的结果(另文发表)，我们用PCR法扩增7个cDNA片段，分别编码1～80，28～107，1～107,108～282，188～282，283～408，338～408位。引物设计根据已知人SSB/La DNA序列，在5'和3' 端分别加上BamHI和 EcoRI酶切位点。
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PCR反应体系: Tris-HCl (pH8.6) 10 mmol/L, KCl 50 mmol/L, MgCl2 1.5 mmol/L, TaqDNA多聚酶5 U/100 μl, 5'和3'引物各为0.25 μmol/L, 模板pLaA 质粒2 μl, 4种dNTP各200 mmol/L, 总体积50 μl。 扩增条件:94℃ 4 min;93℃ 30 s, 48℃ 30 s, 72℃ 2.5 min, 共3个循环；93℃ 30 s,62℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共25个循环；72℃ 8 min。扩增产物经溴化乙锭琼脂糖电泳, 然后用纯化试剂盒回收PCR产物。将纯化的PCR扩增产物用Taq酶Sanger双脱氧链末端终止法测序证实[3]。
1.3 SSB/La cDNA片段的表达 将经过DNA测序鉴定的纯化的PCR扩增产物及原核表达载体PGEX-2T分别经EcoRI和XhoI双酶切后，再经T4DNA连接酶作用，将La cDNA片段定向插入PGEX-2T。挑取经鉴定后的重组克隆于LB/Amp培养液37℃振摇过夜，次日1:100稀释转种于新的LB/Amp培养液中，37℃振摇培养约3 h(OD值约为0.5～0.6), 然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导3 h，超声破碎菌液后，经GST亲合层析柱纯化，得到SSB/La抗原的7种片段肽。进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色。具体步骤参见文献[2]。
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1.4 免疫印迹法分析各片段抗原性 将上述各片段肽经SDS-PAGE电泳后进行转印，200 mA,40 V,2 h。将转印后的NC膜剪成条带，用含3%BSA的PBS(pH7.4)封闭1 h。用封闭液1:500稀释50份抗La阳性血清、正常人血清，孵育1 h，PBS洗涤3次。加1:1 000稀释的HRP标记的兔抗人IgG抗体，37℃孵育1 h，充分洗涤后加入3，3-二氨联苯胺底物反应显色。
1.5 竞争抑制法分析各片段抗原性 将抗SSB/La血清混和物与重组SSB/La抗原及上述各片段肽预先在室温孵育1 h，而后与Molt-4细胞裂解液转印条带进行免疫印迹反应，方法同上。
2 结果
2.1 SSB/La cDNA片段的PCR产物 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量210～540 bp之间可见7条清晰的特异性扩增条带，符合我们的预期目的，如图1。
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图1 SSB/La cDNA片段PCR产物电泳图
Fig.1 Gel electrophoresis of the PCR products of SSB/La cDNA fractions
Note:1～4，6～8：PCR products of La l～La 7;5:DNA marker
2.2 重组融合蛋白的表达及纯化 SSB/La的7个片段肽的区域如图2。7个片段肽在大肠杆菌JM109株中，通过表达载体PGEX-2T得到表达。其产物经GST亲合层析柱纯化，进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，如图3。
图2 PCR法扩增的SSB/La cDNA片段
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Fig.2 The recombinant fusion protein profiles of SSB/La fractions
图3 SSB/La 片段重组融合蛋白SDS-PAGE电泳图
Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of the recombinant fusion proteins of SSB/La fractions
Note:1～7：fractions of La l～La 7;8:protein marker
2.3 免疫学鉴定 将50份与La全抗原反应阳性的SLE患者血清混合后，与7个片段肽的印迹条反应 ，结果如图4。La 3,La 4,La 6与混合血清反应阳性，而La 1,La 2,La 5,La 7反应阴性，表明在1～28，80～107，108～188，283～338位可能存在与抗体结合的抗原决定簇。竞争抑制实验表明，重组SSB/La，La 3，La 4,La 6可消除标准抗SSA/Ro血清与Molt-4细胞裂解液转印条之间的免疫反应，而其它抗原片段无此作用。
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图4 免疫学鉴定
Fig.4 Immunoblot of fractions
Note:1，2：SSB/La recombinant antigen;3～9：La l～La 7
2.4 SLE患者的血清反应 我们跟踪研究了3个SLE患者的血清反应，发现3年内随着病情发展，其抗体与抗原片段的反应有所不同，见表1。
表1 SLE患者血清与抗原片段反应的动态观察
Tab.1 Longitual studies of SLE patients'sera Patient
Antigen fractions binding to antibody
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1st year
2nd year
3rd year
1
La 3
La 3,La 4,La 1
La 3,La 4
2
La 3,La 4
La 3,La 6
La 3,La 4,La 6
3
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La 3,La 7
La 3,La 4
La 3,La 4
3 讨论
我们在计算机软件分析自身抗原SSB/La的氨基酸序列结构，预测抗原位点的基础上，设计特异性引物，通过DNA重组得到7个SSB/La cDNA的亚克隆，并在大肠杆菌JM109中得到表达。通过免疫印迹法来考察各片段对抗体的反应性，并通过分析片段之间的关系来研究 SSB/La 抗原优势表位。
我们用50份与La全抗原反应阳性的SLE患者血清混和物来代表患者总体水平，反映SSB/La的抗原优势决定簇。结果表明，片段La 3，La 4， La 6具有抗原性，表明在1～28，80～107，108～188，283～338位可能存在与抗体结合的抗原决定簇，包括了抗原性预测中的2个，而抗原性预测中的220～240位，在我们的实验中未显示抗原性。蛋白质作为B细胞抗原所暴露的部位取决于蛋白质的性质和宿主因素，La的抗原优势表位与其亲水性位点有差异，其间还涉及抗原、抗体的其它因素(如三级结构，翻译后修饰，RNA结合等)。La分子的抗原位点和RNA结合区位于高度螺旋化和带阳性电荷的区域, 至少存在3个分离的自身免疫表位。可能我们选择的亚克隆位点对免疫反应性会有所影响，因为患者血清来源的数量及种属差异，所用技术方法的不同(如表达系统、检测方法、抗原制备过程的差异)，所连接GST蛋白质对抗原抗体反应影响，不同位点的竞争抑制性不同。此外，要确定抗原位点，还需明确三维结构。
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在本研究中，La 3显示强烈的抗原性。有资料表明，SSB/La的88～101 位与反转录病毒gag多肽氨基酸有高度同源性,这提示交叉免疫可能是自身免疫的发病机制之一[4]。抗体识别La/SSB抗原上的反转录病毒同源序列，也可能与相邻区域序列产生反应；自身抗原与病毒蛋白的同源性还可导致T细胞耐受丧失而产生对自身抗原的反应。病毒感染可产生的抗体识别表位有限，而在自身免疫反应中存在多个表位反应，包括一些结构型表位，提示在抗体产生过程中，分子模拟机制和自身抗原反应并不是相互排斥的。
序列分析表明在La aa 111～187之间有RNA识别结构(RRM)，包括2个同源序列(RNP1和RNP2)以及许多疏水性保守性氨基酸。在这个重要的保守性功能区域含有人特异性抗体表位，然而，针对LaRRM的反应如何产生及其与疾病机制的关系尚不清楚。在许多激发自身免疫反应的胞内蛋白的保守性表位，也是分子内活性或易酶解的位点[5]，可能与核酸结合的蛋白质区域在自身免疫反应中更具免疫原性。研究这些表位的免疫遗传机制，有助于理解自身免疫机制。
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本研究对3个SLE患者血清抗SSB/La 片段抗原的反应进行了跟踪检测，发现各患者血清与抗原片段的反应性并不一致，存在个体差异性；而且在不同病程，抗原表位有所差异，这与前人提出的“表位扩展”相一致[6]。本研究的结果表明，在最初出现抗La 3的患者中出现针对其它优势表位的抗体,可能aa 1～107位是SSB/La中首先被识别的表位。反转录病毒感染可引起许多慢性系统性疾病，与癌变和成人免疫缺陷综合征有关[7]。可以作如下推测：首先是外源性反转录病毒感染或内源性反转录病毒表达，启动抗病毒蛋白的免疫反应，而后，一些抗病毒蛋白的B细胞受体可与自身抗原的表位发生交叉反应，B细胞将自身抗原分子的一部分作为免疫原递呈给宿主免疫系统，激发B细胞反应，进而，自身抗原的其它潜在性免疫原性位点也可被识别。而产生抗体不仅取决于蛋白质性质，也与个体遗传背景有关。因此各个病人的抗血清识别的表位不一定完全相同。
随着对已知蛋白一级结构，特定结构或与生物信号相关性研究不断深入，蛋白质结构预测准确率达60%～80%[8]。我们通过计算机模拟了SSB/La蛋白质分子的亲水性、柔性、抗原性，初步推测其二级结构，为进一步寻找抗原的B细胞表位，理解抗原抗体相互作用及其在发病机制中的作用打下了基础，也将有助于我们进一步认识抗原分子结构与功能之间的关系，更加了解免疫分子的识别机理。我们可以设想人类自身免疫反应由一定的分子的有限区域所激发，确定这样的区域有助于我们了解疾病机制并作进一步研究，为疾病的诊治提供依据。
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本课题受上海市启明星基金部分资助(编号 94QB14002)
作者简介:邓安梅，女，28岁，博士, 从事临床免疫学研究;仲人前，男，36岁，研究员，从事临床免疫学研究;孔宪涛，男，67岁，教授，博士生导师，从事临床免疫学研究
参考文献
1，Reichlin M.Autoantibodies to the RoRNP particles.Clin Exp Immunol,1995；99:7
2，邓安梅，仲人前，陈孙孝et al.自身抗原La融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定.中国免疫学杂志，2000；16(4)：215
3，卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993:412-414
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4，Sturgess A D,Peterson M G，McNeilage L J et al. Characteristics and epitope mapping of a cloned human autoantigen La. J Immunol,1992;140:3212
5，Habets W J,Hoet M J，Venrooy W Jvan.Epitope patterns of anti-RNP antibodies in rheamatic diseases.Arthrits Rheum,1992；33:834
6，Bachmann M,Mayet W J，Schroder H C et al. Identification of the Ro and La antigens in the endoribonuclease V-ribonucleoprotein complex.Biochem,1990;243:189
7，邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. SSB/La抗原研究进展. 中国免疫学杂志,1996;12(4):255
8，Jameson B A，Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci，1988;4(1): 181
1999-01-29
1999-08-21, 百拇医药