一氧化氮合成酶在白血病细胞的表达
作者：赵海霞 王秀梅 KOLB J P
单位：赵海霞(内蒙古医学院第一附属医院，呼和浩特 010050)；王秀梅(内蒙古医学院微生物教研室，呼和浩特 010050)；KOLB J P(Institute Curie，FRANCE)
关键词：一氧化氮；一氧化氮合成酶；白血病细胞
中国免疫学杂志000613 摘 要 目的：为了探讨一氧化氮合成酶在CD23+白血病细胞的表达，以及CD23与NO的关系。方法：采用RT-PCR和FACS技术及Western-blotting，放射自显影方法。结果：发现CD23+白血病细胞株可以表达iNOS mRNA和iNOS蛋白，同时膜CD23可上调iNOS的表达。结论：iNOS可能与人CD23+白血病细胞的增殖和凋亡有关。
中国图书分类号 R730.22
, http://www.100md.com
Expression of NOS in leukemic cells
ZHAO Hai-Xia，WANG Xiu-Mei，KOLB J P.
Inner Mongolia Medical College，Huhhot 010050
Abstract Objective：In order to analysis the expression between Nitric oxide synthase(NOS) and CD23.Methods:By reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)，FACS and Western-blotting.Results:It indicates that leukemic cells were found to spontaneously express the iNOS mRNA and protein that is up-regulated after ligation of membrane CD23. Whereas constitutive NOS(cNOS) mRNA or protein were quite undetectable by immunofluoresence.Conclusion:The existence of a functional iNOS will provide further insights about the mechanisms to control the proliferation and apoptosis of the leukemic cells.
, 百拇医药
Key words NO NOS Leukemic cells
一氧化氮合成酶(NOS)分为三类：中枢性NOS(nNOS)、内皮结构型NOS(ecNOS)和诱导型NOS(iNOS)，前两者统称为结构型NOS(cNOS)。NO由NOS催化左旋精氨酸而生成，通过活化cGMP发挥生物学效应。近年来，NO逐渐成为人们研究的热点分子，有人将NO描述为免疫调节因子[1]，其在多种细胞的凋亡中起着重要作用，其中包括肿瘤细胞，这种作用是非常复杂的，它依赖于NO的浓度和所处环境的氧化状态[2]，有人发现EBV转染的人B细胞(CD23+)可以表达低水平的iNOS，而且产生的NO可以抑制EBV的复制和细胞的凋亡。我们以前的工作已经证实CD23的交联在人BC的增殖和分化中有一定作用[3]，这使我们联想到NOS是否可以表达在CD23+肿瘤细胞上?我们的结果显示CD23+白血病细胞株表达iNOS，同时，膜CD23交联后可以上调iNOS，而cNOS并未检测到。国内外有关CD23与NOS的关系的研究报道甚少，本文旨在揭示两者的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞 人白血病细胞株ESKOL、PIVRE、DUPUIS(CD23+即可表达膜CD23分子，总称为LC)、人肺泡上皮II型细胞株(A549)和人前单核细胞株(U937)(均由法国Institute Curie J.P.KOLB惠赠)。本文所用单克隆抗体均由美国Tras.Lab生产。
1.2 细胞培养及CD23配体刺激细胞 LC、A549及U937复苏后在含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco)培养液中培养(5%CO2孵箱)过夜(12 h)，次日分析NOS mRNA和蛋白质表达。同时，取106 ml-1的LC(三株)与抗CD23单抗(10 μg/ml)或鼠IgGl(10 μg/ml)(对照)共同培养48 h，然后分析NOS mRNA和蛋白表达情况。
1.3 细胞总RNA提取 取1×106～10×106细胞采用一步法提取总RNA[4]。
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1.4 cDNA合成 反应总体积20 μl内含6.7 mmol/L MgCl2，16.6 mmol/L(NH4)2SO4，250 μmol/L dNTP，1 μg随机引物PdN6，200 μmol/L MLV-RT逆转录酶，125 UHPRI，1～2 μg细胞总RNA。反应条件65℃5 min，42℃30 min，65℃5 min，反应完毕后恢复500 μl总体积。
1.5 引物设计与PCR反应 iNOS 5'CGGTGCTGTATTTCCTTACGAGGCGAAGAAGG3'， 5'GGGGCGGCTTGTTAGGAGGTCAAGTAAAGGGC 3'，大小为259 bp，由美国Palo Alto提供。β2-微球蛋白5'CATCCAGCGTACTCCAAAGA 3'，5'GACAAGTCTGAATGCTCCAC 3'，大小为165 bp，为PCR反应阳性对照，由法国0ligo-Express提供。
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10 μl的cDNA合成产物不需纯化，直接进行PCR，总反应体积100 μl内含250 μmol/L dNTP，50 μmol/L设计引物，1.7 mmol/L MgCl2，67 mmol/L tris-HCl(pH8.8)，1.25 U Taq DNA 聚合酶，50 μl矿物油，反应条件94℃50 s，60℃50 s，72℃50 s，共35个循环后72℃延伸10 min。cNOS PCR 除进行37个循环和引物不同外其余条件相同。取10 μl PCR产物在2%琼脂糖和7%聚丙稀酰胺凝胶电泳上鉴定。A549和U937分别作为iNOS和cNOS mRNA的阳性对照。
1.6 iNOS和cNOS蛋白的FACS分析[3] 采用特异细胞渗透和固定试剂盒(英国Serotec提供)，通过FACS分析胞内iNOS和cNOS蛋白表达。处理后的细胞依次分别与抗人iNOS(或cNOS)单抗及抗鼠IgG-FITC反应，反应后的细胞直接上FACS仪分析。
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2 结果
2.1 iNOS mRNA表达(RT-PCR) 以逆转录得到的cDNA为模板，用特异性人iNOS、cNOS或β2-微球蛋白5’端引物进行PCR反应，结果显示在三株LC上均得到一条259 bp的扩增片段，与阳性对照(A549)基因大小吻合。而且CD23配体可诱导iNOS表达如图1(三株LC结果相同)，却未得到cNOS为扩增片段(未显示)。
2.2 FACS法检测iNOS蛋白 通过直接免疫荧光法FACS技术分析了iNOS及cNOS在LC细胞的表达，FITC-抗iNOS标记的平均阳性率为54%，n=3，如图2所示，灰线为IgG1标记的阴性对照，黑线为抗-iNOS标记，图中1、2、3为三株白血病细胞株。
图1 iNOS mRNA 在LC中的检测(RT-PCR)
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Fig.1 Examining of iNOS mRNA in LC
Note:Lane1.Marker;Lane2.A549;Lane3.LC;Lane4.LC+anti-CD23(10 μg/ml);Lane5.LC+mIgG1(10 μg/ml)
2.3 CD23配体刺激LC表达iNOS 我们用抗-CD23McAb(10 μg/ml)刺激LC来分析iNOS mRNA表达(图1)和iNOS蛋白水平表达。与对照(FITC-IgG2a标记的细胞)比较iNOS表达情况(见图3)，灰线为培养的细胞，黑线为与抗-CD23(10 μg/ml)共育48 h的细胞。CD23配体不能诱导cNOS在LC上的表达(结果未显示)。
图2 iNOS 蛋白在LC中的表达(FACS)
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Fig.2 Expression of iNOS in LC by FACS
图3 CD23配体刺激LC表达iNOS
Fig.3 Expression of iNOS in LC stimulated by CD23 McAb
图4 Western-blotting 测iNOS在LC的表达
Fig.4 Expression of iNOS in LC by Western blotting
2.4 Western-blotting法测iNOS蛋白 将LC裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将胶进行Western-blotting，结果如图4所示，图中1、2、3为三株LC，显示iNOS阳性，阳性对照为A549细胞。
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3 讨论
本文采用了RT-PCR和FACS方法在mRNA和蛋白质水平检测了NOS在人CD23+白血病细胞的表达，国内目前一般采用化学方法检测NOS，本文所用的方法具有敏感性高、准确性强的特点，为NOS的检测提供了新方法。我们虽然发现iNOS mRNA和蛋白存在于LC，此种细胞属B细胞系，而cNOS却未检测到，Reiling等发现正常人B淋巴细胞的某一亚群可以表达NOS mRNA和蛋白，但还未确定具体阳性亚群[6]。有趣的是，我们观察到CD23分子的配体可以增加iNOS的表达，而NO与细胞凋亡有关，渴望为CD23+白血病的治疗提出了一条新途径。Fournier也报道CD23分子在人慢性B淋巴细胞瘤(CD23+)分化调节中有一定作用[6]，与我们的结果一致。iNOS途径产生的NO是否和人CD23+白血病细胞的凋亡有关?下一步我们将用NOS抑制剂或促进剂或CD23分子的其它配体调节NO的生成来观察NO对人白血病细胞生存与凋亡的影响，这方面尚需进一步探讨。
, 百拇医药
作者简介：赵海霞，硕士研究生
4 参考文献
[1]Moncada S，Palmer R M J， Higgs E A. Nitric oxide physiology， patophysiology and pharmacology.Pharmacol Rcv， 1991;43:109
[2]Stamler J S. Redox signling:nitrosylation and related target interaction of nitric oxide. Cell，1994;78:931
[3]赵海霞，王秀梅，徐德胜.CD23特异配体与BC增殖分化的关系.中国免疫学杂志，1995；11(1)：14
[4]ZHAO H X，Dagas N，Nathiot cl et al.B cell chronec lymphocytic leukemia cells express a functional inducible nitrc oxide synthase displaying anti-apoptotic.Blood，1998;92(3):1031
, 百拇医药
[5]Reiling N，Kroncke R， Ulmer A J et al. Nitric oxide synthase: expressing of the endothelial，cazt/calmodulin dependent isoform in human B and T lymphocytes. Eur J Immunol，1996;26:511
[6]Fournier S， Yang L P， Delespesse G et al.The two CD23 isoforms display differential regulation in chronic lymphyocytic leukaemia. Br J Hematol，1995;89:337
[收稿1999-07-29 二次修回1999-11-25], 百拇医药
单位：赵海霞(内蒙古医学院第一附属医院，呼和浩特 010050)；王秀梅(内蒙古医学院微生物教研室，呼和浩特 010050)；KOLB J P(Institute Curie，FRANCE)
关键词：一氧化氮；一氧化氮合成酶；白血病细胞
中国免疫学杂志000613 摘 要 目的：为了探讨一氧化氮合成酶在CD23+白血病细胞的表达，以及CD23与NO的关系。方法：采用RT-PCR和FACS技术及Western-blotting，放射自显影方法。结果：发现CD23+白血病细胞株可以表达iNOS mRNA和iNOS蛋白，同时膜CD23可上调iNOS的表达。结论：iNOS可能与人CD23+白血病细胞的增殖和凋亡有关。
中国图书分类号 R730.22
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Expression of NOS in leukemic cells
ZHAO Hai-Xia，WANG Xiu-Mei，KOLB J P.
Inner Mongolia Medical College，Huhhot 010050
Abstract Objective：In order to analysis the expression between Nitric oxide synthase(NOS) and CD23.Methods:By reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)，FACS and Western-blotting.Results:It indicates that leukemic cells were found to spontaneously express the iNOS mRNA and protein that is up-regulated after ligation of membrane CD23. Whereas constitutive NOS(cNOS) mRNA or protein were quite undetectable by immunofluoresence.Conclusion:The existence of a functional iNOS will provide further insights about the mechanisms to control the proliferation and apoptosis of the leukemic cells.
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Key words NO NOS Leukemic cells
一氧化氮合成酶(NOS)分为三类：中枢性NOS(nNOS)、内皮结构型NOS(ecNOS)和诱导型NOS(iNOS)，前两者统称为结构型NOS(cNOS)。NO由NOS催化左旋精氨酸而生成，通过活化cGMP发挥生物学效应。近年来，NO逐渐成为人们研究的热点分子，有人将NO描述为免疫调节因子[1]，其在多种细胞的凋亡中起着重要作用，其中包括肿瘤细胞，这种作用是非常复杂的，它依赖于NO的浓度和所处环境的氧化状态[2]，有人发现EBV转染的人B细胞(CD23+)可以表达低水平的iNOS，而且产生的NO可以抑制EBV的复制和细胞的凋亡。我们以前的工作已经证实CD23的交联在人BC的增殖和分化中有一定作用[3]，这使我们联想到NOS是否可以表达在CD23+肿瘤细胞上?我们的结果显示CD23+白血病细胞株表达iNOS，同时，膜CD23交联后可以上调iNOS，而cNOS并未检测到。国内外有关CD23与NOS的关系的研究报道甚少，本文旨在揭示两者的关系。
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1 材料与方法
1.1 细胞 人白血病细胞株ESKOL、PIVRE、DUPUIS(CD23+即可表达膜CD23分子，总称为LC)、人肺泡上皮II型细胞株(A549)和人前单核细胞株(U937)(均由法国Institute Curie J.P.KOLB惠赠)。本文所用单克隆抗体均由美国Tras.Lab生产。
1.2 细胞培养及CD23配体刺激细胞 LC、A549及U937复苏后在含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco)培养液中培养(5%CO2孵箱)过夜(12 h)，次日分析NOS mRNA和蛋白质表达。同时，取106 ml-1的LC(三株)与抗CD23单抗(10 μg/ml)或鼠IgGl(10 μg/ml)(对照)共同培养48 h，然后分析NOS mRNA和蛋白表达情况。
1.3 细胞总RNA提取 取1×106～10×106细胞采用一步法提取总RNA[4]。
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1.4 cDNA合成 反应总体积20 μl内含6.7 mmol/L MgCl2，16.6 mmol/L(NH4)2SO4，250 μmol/L dNTP，1 μg随机引物PdN6，200 μmol/L MLV-RT逆转录酶，125 UHPRI，1～2 μg细胞总RNA。反应条件65℃5 min，42℃30 min，65℃5 min，反应完毕后恢复500 μl总体积。
1.5 引物设计与PCR反应 iNOS 5'CGGTGCTGTATTTCCTTACGAGGCGAAGAAGG3'， 5'GGGGCGGCTTGTTAGGAGGTCAAGTAAAGGGC 3'，大小为259 bp，由美国Palo Alto提供。β2-微球蛋白5'CATCCAGCGTACTCCAAAGA 3'，5'GACAAGTCTGAATGCTCCAC 3'，大小为165 bp，为PCR反应阳性对照，由法国0ligo-Express提供。
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10 μl的cDNA合成产物不需纯化，直接进行PCR，总反应体积100 μl内含250 μmol/L dNTP，50 μmol/L设计引物，1.7 mmol/L MgCl2，67 mmol/L tris-HCl(pH8.8)，1.25 U Taq DNA 聚合酶，50 μl矿物油，反应条件94℃50 s，60℃50 s，72℃50 s，共35个循环后72℃延伸10 min。cNOS PCR 除进行37个循环和引物不同外其余条件相同。取10 μl PCR产物在2%琼脂糖和7%聚丙稀酰胺凝胶电泳上鉴定。A549和U937分别作为iNOS和cNOS mRNA的阳性对照。
1.6 iNOS和cNOS蛋白的FACS分析[3] 采用特异细胞渗透和固定试剂盒(英国Serotec提供)，通过FACS分析胞内iNOS和cNOS蛋白表达。处理后的细胞依次分别与抗人iNOS(或cNOS)单抗及抗鼠IgG-FITC反应，反应后的细胞直接上FACS仪分析。
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2 结果
2.1 iNOS mRNA表达(RT-PCR) 以逆转录得到的cDNA为模板，用特异性人iNOS、cNOS或β2-微球蛋白5’端引物进行PCR反应，结果显示在三株LC上均得到一条259 bp的扩增片段，与阳性对照(A549)基因大小吻合。而且CD23配体可诱导iNOS表达如图1(三株LC结果相同)，却未得到cNOS为扩增片段(未显示)。
2.2 FACS法检测iNOS蛋白 通过直接免疫荧光法FACS技术分析了iNOS及cNOS在LC细胞的表达，FITC-抗iNOS标记的平均阳性率为54%，n=3，如图2所示，灰线为IgG1标记的阴性对照，黑线为抗-iNOS标记，图中1、2、3为三株白血病细胞株。
图1 iNOS mRNA 在LC中的检测(RT-PCR)
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Fig.1 Examining of iNOS mRNA in LC
Note:Lane1.Marker;Lane2.A549;Lane3.LC;Lane4.LC+anti-CD23(10 μg/ml);Lane5.LC+mIgG1(10 μg/ml)
2.3 CD23配体刺激LC表达iNOS 我们用抗-CD23McAb(10 μg/ml)刺激LC来分析iNOS mRNA表达(图1)和iNOS蛋白水平表达。与对照(FITC-IgG2a标记的细胞)比较iNOS表达情况(见图3)，灰线为培养的细胞，黑线为与抗-CD23(10 μg/ml)共育48 h的细胞。CD23配体不能诱导cNOS在LC上的表达(结果未显示)。
图2 iNOS 蛋白在LC中的表达(FACS)
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Fig.2 Expression of iNOS in LC by FACS
图3 CD23配体刺激LC表达iNOS
Fig.3 Expression of iNOS in LC stimulated by CD23 McAb
图4 Western-blotting 测iNOS在LC的表达
Fig.4 Expression of iNOS in LC by Western blotting
2.4 Western-blotting法测iNOS蛋白 将LC裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将胶进行Western-blotting，结果如图4所示，图中1、2、3为三株LC，显示iNOS阳性，阳性对照为A549细胞。
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本文采用了RT-PCR和FACS方法在mRNA和蛋白质水平检测了NOS在人CD23+白血病细胞的表达，国内目前一般采用化学方法检测NOS，本文所用的方法具有敏感性高、准确性强的特点，为NOS的检测提供了新方法。我们虽然发现iNOS mRNA和蛋白存在于LC，此种细胞属B细胞系，而cNOS却未检测到，Reiling等发现正常人B淋巴细胞的某一亚群可以表达NOS mRNA和蛋白，但还未确定具体阳性亚群[6]。有趣的是，我们观察到CD23分子的配体可以增加iNOS的表达，而NO与细胞凋亡有关，渴望为CD23+白血病的治疗提出了一条新途径。Fournier也报道CD23分子在人慢性B淋巴细胞瘤(CD23+)分化调节中有一定作用[6]，与我们的结果一致。iNOS途径产生的NO是否和人CD23+白血病细胞的凋亡有关?下一步我们将用NOS抑制剂或促进剂或CD23分子的其它配体调节NO的生成来观察NO对人白血病细胞生存与凋亡的影响，这方面尚需进一步探讨。
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作者简介：赵海霞，硕士研究生
4 参考文献
[1]Moncada S，Palmer R M J， Higgs E A. Nitric oxide physiology， patophysiology and pharmacology.Pharmacol Rcv， 1991;43:109
[2]Stamler J S. Redox signling:nitrosylation and related target interaction of nitric oxide. Cell，1994;78:931
[3]赵海霞，王秀梅，徐德胜.CD23特异配体与BC增殖分化的关系.中国免疫学杂志，1995；11(1)：14
[4]ZHAO H X，Dagas N，Nathiot cl et al.B cell chronec lymphocytic leukemia cells express a functional inducible nitrc oxide synthase displaying anti-apoptotic.Blood，1998;92(3):1031
, 百拇医药
[5]Reiling N，Kroncke R， Ulmer A J et al. Nitric oxide synthase: expressing of the endothelial，cazt/calmodulin dependent isoform in human B and T lymphocytes. Eur J Immunol，1996;26:511
[6]Fournier S， Yang L P， Delespesse G et al.The two CD23 isoforms display differential regulation in chronic lymphyocytic leukaemia. Br J Hematol，1995;89:337
[收稿1999-07-29 二次修回1999-11-25], 百拇医药