利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞
作者：李一荣 吴健民 邹萍
单位：李一荣(同济医科大学附属协和医院检验科，武汉 430022)；吴健民(同济医科大学附属协和医院检验科，武汉 430022)；邹萍(同济医科大学附属协和医院血液科，武汉 430022)
关键词：磁性微球；哮喘；嗜酸性粒细胞
中国免疫学杂志000809 摘 要 目的：从健康献血者和哮喘等变态反应性疾病病人的外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞。方法：采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，并检测分离后嗜酸性粒细胞的纯度、存活率，计算其回收率。结果：①健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69.7%±6.8%，存活率95.4%±1.8%，纯度为90.7%±4.3%；②哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为60.4%±5.4%，存活率为96.1%±0.7%，纯度为92.6%±5.1%。结论：采用磁性细胞分选技术的阴性选择法，能从外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞，因此该方法是一种高效的分离外周血嗜酸性粒细胞的免疫学方法。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.33
Isolation of eosinophils from peripheral blood by the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting
LI Yi-Rong，WU Jian-Min，ZOU Ping.
Laboratory Department，Union Hospital，Tong Ji Medical University，Wuhan，430022
Abstract Objective:To isolate eosinophils of high purity and viability from peripheral blood of healthy donors and patients with allergic disease(such as asthma).Methods:Eosinophils of peripheral blood were isolated by the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting and their purity and the ratio of viability and recovery were assessed.Results:(1)The purity and the ratio of viability and recovery of eosinophils from healthy donors were 90.7%±4.3%，95.4%±1.8% and 69.7%±6.8% respectively.(2)The purity and the ratio of viability and recovery of eosinophils form patients with allergic disease (such as asthma) were 92.6%±5.1%，96.1%±0.7% and 60.4%±5.4% respectively.Conclusion:By the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting，eosinophils of high purity and viability were acquired from peripheral blood.So the procedure is a highly effective immunological method which used to isolate eosinophils.
, 百拇医药
Key words Magnetic microbead Asthma Eosinophil
长期以来，嗜酸性粒细胞的分离多采用不连续的密度梯度离心法，但是由于外周血中嗜酸性粒细胞的含量较少，约为白细胞的0.5%～5%，而且其密度范围与中性粒细胞部分重叠，因此高度纯化外周血中嗜酸性粒细胞有一定的难度。1979年，Vadas采用高渗的Metrizamide进行密度梯度离心分离外周血中嗜酸性粒细胞[1]，随后Gartner将高渗的Metrizamide换成等渗Percoll液分离外周血嗜酸性粒细胞[2]，尽管能够达到一定的纯度和回收率，但是Metrizamide法要求外周血中的嗜酸性粒细胞数至少为白细胞的2%，且易造成嗜酸性粒细胞的皱缩，而Percoll法更是要求嗜酸性粒细胞至少为外周血白细胞的4%，因此采用以上2种不连续的密度梯度离心法很难从正常人群中分离出大量的高纯度嗜酸性粒细胞。我们采用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，获得较好的效果。
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1 材料与方法
1.1 试剂 磁性微球，武汉工业大学与本校免疫教研室共同研制，球形，表面功能基团为羧基；鼠抗人CD16单克隆抗体，北京邦定生物医学公司生产，与人中性粒细胞表面CD16特异结合；Percoll贮存液，Pharmacia公司生产，密度1.13±0.001，根据有关文献配成密度为1.083的Percoll应用液[3，4]；乙醇胺，郑州市化学试剂三厂生产，用以封闭磁性微球余下的活性基团；SPA(葡萄球菌A蛋白)，上海生物制品研究所生产，与单克隆抗体Fc段有强结合力；FCS(胎牛血清)，中德三利生物制品厂生产；异硫氰基荧光黄(FITC)标记的羊抗鼠IgG抗体，上海生物制品研究所生产。
1.2 器材 自制MACS(Magnetic Activated Cell Sorter，磁性细胞分选仪)，由武汉冶金研究所与本科共同研制，主要由永久磁场(磁场强度为0.54特斯拉)和分离柱组成，分离柱内含不锈钢丝绒，提供细胞停留的表面及强磁场，便于细胞的分离；低温冷冻离心机：美国贝克曼公司生产；CELL-DYN3500血细胞计数仪：美国雅培公司生产；荧光显微镜：日本奥林巴斯公司生产。
, 百拇医药
1.3 标本 健康献血者28例，外周血嗜酸性粒细胞计数(0.05×109～0.40×109) L-1。哮喘等各种变态反应性疾病病人21例，外周血嗜酸性粒细胞计数(0.5×109～1.78×109) L-1。
1.4 方法
1.4.1 磁性微球的标记 空白磁性微球悬液，加入等体积的SPA溶液，4℃过夜孵育，不断振摇，用磁场收集磁性微球，加5倍体积乙醇胺溶液(1 mol/L、pH=8.0)，室温放置1 h，不断振摇，用以封闭磁性微球余下的活性基团。然后用PBS洗涤，加入鼠抗人CD16单克隆抗体，4℃孵育1 h，PBS洗涤，然后配成一定浓度的鼠抗人CD16单克隆抗体标记的免疫磁性微球(Immunomagnetic Microbeads，IMB)，4℃无菌保存。
, http://www.100md.com 1.4.2 外周血粒细胞的分离 静脉血20 ml，肝素钠抗凝，用CELL-DYN3500血细胞计数仪进行细胞分类计数，PBS对倍稀释，置于20 ml的Percoll应用液上，1000 g离心30 min，保留红细胞、粒细胞层。加入5倍体积冰冷的155 mmol/L NH4Cl溶液，0℃冰浴15 min，用冰冷的PBS(含2%FCS)洗涤粒细胞2次，4℃离心7 min(400 g)，保留10 μl沉淀，加入90 μl冰冷的PBS(含2%FCS)，冰浴保存。
1.4.3 嗜酸性粒细胞的分离 将免疫磁性微球与已分离的粒细胞悬液混合(免疫磁性微球数∶细胞总数=20∶1)，4℃孵育1 h。然后加入冰冷的PBS 4 ml(含2%FCS)，并将液体转移至自制MACS的分离柱，用50 ml的刻度试管收集过柱液，再次加入冰冷的PBS 32 ml(含2%FCS)，收集过柱液，400 g离心7 min，用CELL-DYN3500血细胞计数仪对嗜酸性粒细胞进行计数，并进行瑞氏染色和台盼蓝染色，计算分离的嗜酸性粒细胞的纯度、存活率与回收率。
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1.4.4 残留CD16+的细胞的检测 将分离后的细胞用PBS(含2%FCS)悬浮，使细胞浓度2×106 ml-1，取100 μl的细胞悬液于试管中，加入20 μl的鼠抗人CD16单克隆抗体，混匀后4℃孵育1 h，然后用PBS(含2%FCS)洗涤3次，4℃离心7 min(400 g)，保留约50 μl液体，再加入20 μl的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，混匀后孵育、洗涤、离心(条件同前)，保留少许液体于试管中，混匀，吸一滴于玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜计数产生特异性荧光的细胞，并用普通光源计数细胞总数，计算两者的比率(即为残留的CD16+的细胞比率)。
2 结果
2.1 由于CD16存在中性粒细胞表面，而不存在于嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞表面，因此中性粒细胞与鼠抗人CD16单克隆抗体标记的IMB结合(见图1、2)，而嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞则不与该IMB结合，能自由通过自制的MACS的分离柱，由于嗜碱性粒细胞在正常人及哮喘等变态反应性疾病人外周血含量极少，故分离后的细胞绝大部分为嗜酸性粒细胞(见图3)。
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2.2 健康献血者(简称健康组)外周血嗜酸性粒细胞的分离前后通过CELL-DYN 3500计数嗜酸性粒细胞，发现嗜酸性粒细胞的回收率为69.7%±6.8%，台盼蓝染色示细胞存活率为95.4%±1.8%，瑞氏染色发现嗜酸性粒细胞的纯度为90.7%±4.3%，残留CD16+的细胞的比率为8.8%±3.9%，详见表1。
图1 粒细胞与IMB的结合(瑞氏染色×400)
Fig.1 The combination of granule cell(Wright stain×400)
图2 粒细胞与IMB的结合(瑞氏染色×1000)
, 百拇医药
Fig.2 The combination of granule cell(Wright stain×1000)
图3 分离后的嗜酸性粒细胞(瑞氏染色×1 000)
Fig.3 The eosinophils after isolation (Wright stain×1 000)
表1 外周血嗜酸性粒细胞分离结果(
±s)
Tab.1 The results of isolating eosinophil from peripheral blood(±s) Group
, http://www.100md.com
n
Recoverh
Viability(%)
Purity(%)
CD16+cell(%)
Healty
28
69.7±6.8
95.4±1.8
90.7±4.3
8.8±3.9
Asthma
, http://www.100md.com
21
60.4±5.4
96.1±0.7
92.6±5.1
6.5±4.7
2.3 哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为60.4%±5.4%，存活率为96.1%±0.7%，纯度为92.6%±5.1%，残留CD16+的细胞的比率为6.5%±4.7%，详见表1。
3 讨论
磁性细胞分选技术是本世纪80年代发展起来的一种高效的细胞分离方法，在国外已广泛用于细胞分离，如CD4、CD8、CD34等[5-7]，但是由于磁性细胞分选技术所需试剂价格较贵，国内目前尚未普遍开展，其主要原理是通过特异性单克隆抗体对细胞表面抗原的特异性识别，将偶联在抗体上的磁性微球标记在细胞上，从而将细胞进行分离。磁性细胞分选技术的阴性选择法是将非目的细胞带上特异性单克隆抗体标记的磁性微球，收集未标记细胞。
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本研究采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，包括4个步骤：首先，通过SPA将鼠抗人CD16的单克隆抗体与磁性微球偶联，制备免疫磁性微球，这是因为SPA不仅能通过其氨基与磁性微球的羧基缩合，而且与特异性单克隆抗体的Fc段有强结合力却不影响该抗体的活性；其次，用密度为1.083的Percoll应用液去除单个核细胞，保留富含红细胞、粒细胞层；其次用155 mmol/L的NH4Cl溶液裂解红细胞，得到粒细胞悬液；最后将鼠抗人CD16的单克隆抗体标记的免疫磁性微球与粒细胞孵育，通过自制的MACS的分离柱，采用阴性选择法分离嗜酸性粒细胞。结果发现，①健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69.7%±6.8%，存活率为95.4%±1.8%，纯度为90.7%±4.3%，残留CD16+的细胞的比率为8.8%±3.9%；②哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为60.4%±5.4%，存活率为96.1%±0.7%，纯度为92.6%±5.1%，残留CD16+的细胞的比率为6.5%±4.7%。以上结果表明：①此方法能成功地分离正常人以及高嗜酸性粒细胞血症病人嗜酸性粒细胞，这是其它几种方法所不能比拟的。如使用Percoll液的不连续密度梯度离心法要求外周血中嗜酸性粒细胞至少为白细胞的4%，而Metrizamide法则要求嗜酸性粒细胞的比率大于2%。②具有较高的灵敏度和特异性。尽管分离后含有少量的CD16+的中性粒细胞，但本研究结果基本接近于国外的报道，Hanse报道利用Dynal磁性微球分离的纯度>95%[8，9]，回收率约为60%，而利用MACS磁性微球分离的纯度则为99.5%±0.1%，回收率高达80%。③存活率高，有利于嗜酸性粒细胞的培养与功能研究。④不影响嗜酸性粒细胞的功能，尽管目前已有文献报道，采用磁性细胞分选技术会影响细胞的功能，但是影响仅限于阳性选择分离的细胞[6，10]，而阴性选择的细胞目前还未见此方面的报道，而研究分离嗜酸性粒细胞采用了阴性选择法，故不会影响嗜酸性粒细胞的功能。
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通过以上分析可看出，磁性细胞分选技术阴性选择法，是一种高效率的外周血嗜酸性粒细胞的分离方法，为其后嗜酸性粒细胞的功能研究提供了有利的基础，而且本实验利用国产磁性微球分离嗜酸性粒细胞，其效果接近于采用Dynal磁性微球和MACS磁性微球，为国内广泛开展磁性细胞分选技术提供了一定的理论与实践基础。
作者简介：李一荣，男，29岁，硕士，主要从事临床免疫学的检验工作
4 参考文献
[1]Vadas M A，David J R，Butterworth A et al.A new method for purification of human neutrophils and eosinophils.J Immunol，1979;122:1228
[2]Gartner I.Seperation of human eosinophils in density gradients of polyvinylpyrrolidone-coated silica gel(Percoll).Immunology，1980;40:133
, 百拇医药
[3]Szucs S，Varga C，Ember I et al.The seperation of the granulocytes from different rat strains.J Immunol Methods，1994;167:245
[4]Scriba A，Luciano L，Steiniger B.High-yield purification of rat monocytes by combined density gradient and immunomagnetic separation. J Immunol Methods，1996;189:203
[5]Semple J W，Allen D，Chang W et al.Rapid separation of CD4+ and CD19+lymphocyte populations from human peripheral blood by a Magnetic Activated Cell Sorter(MACS).Cytometry，1993;14:955
, 百拇医药
[6]Stanciu L A，Shute J，Holgate S T et al.Production of IL-8 and IL-4 by positively and negatively selected CD4+ and CD8+ human T cells following a four-step cell separation method including magnetic cell sorting(MACS).J Immunol Methods，1996;189:107
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[9]Hansel T T，De Vries I J M，Iff T et al.An improved immunomagnetic procedure for the isolation of highly purified human blood eosinophils.J Immunol Methods，1991;145:105
[10]Rubbi C P，Patel D，Rickwood D.Evidence of surface antigan detachment during incubation of cells with immunomagnetic beads.J Immunol Methods，1993;166:233
[收稿1999-09-31 修回1999-12-22], http://www.100md.com
单位：李一荣(同济医科大学附属协和医院检验科，武汉 430022)；吴健民(同济医科大学附属协和医院检验科，武汉 430022)；邹萍(同济医科大学附属协和医院血液科，武汉 430022)
关键词：磁性微球；哮喘；嗜酸性粒细胞
中国免疫学杂志000809 摘 要 目的：从健康献血者和哮喘等变态反应性疾病病人的外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞。方法：采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，并检测分离后嗜酸性粒细胞的纯度、存活率，计算其回收率。结果：①健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69.7%±6.8%，存活率95.4%±1.8%，纯度为90.7%±4.3%；②哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为60.4%±5.4%，存活率为96.1%±0.7%，纯度为92.6%±5.1%。结论：采用磁性细胞分选技术的阴性选择法，能从外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞，因此该方法是一种高效的分离外周血嗜酸性粒细胞的免疫学方法。
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Isolation of eosinophils from peripheral blood by the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting
LI Yi-Rong，WU Jian-Min，ZOU Ping.
Laboratory Department，Union Hospital，Tong Ji Medical University，Wuhan，430022
Abstract Objective:To isolate eosinophils of high purity and viability from peripheral blood of healthy donors and patients with allergic disease(such as asthma).Methods:Eosinophils of peripheral blood were isolated by the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting and their purity and the ratio of viability and recovery were assessed.Results:(1)The purity and the ratio of viability and recovery of eosinophils from healthy donors were 90.7%±4.3%，95.4%±1.8% and 69.7%±6.8% respectively.(2)The purity and the ratio of viability and recovery of eosinophils form patients with allergic disease (such as asthma) were 92.6%±5.1%，96.1%±0.7% and 60.4%±5.4% respectively.Conclusion:By the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting，eosinophils of high purity and viability were acquired from peripheral blood.So the procedure is a highly effective immunological method which used to isolate eosinophils.
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Key words Magnetic microbead Asthma Eosinophil
长期以来，嗜酸性粒细胞的分离多采用不连续的密度梯度离心法，但是由于外周血中嗜酸性粒细胞的含量较少，约为白细胞的0.5%～5%，而且其密度范围与中性粒细胞部分重叠，因此高度纯化外周血中嗜酸性粒细胞有一定的难度。1979年，Vadas采用高渗的Metrizamide进行密度梯度离心分离外周血中嗜酸性粒细胞[1]，随后Gartner将高渗的Metrizamide换成等渗Percoll液分离外周血嗜酸性粒细胞[2]，尽管能够达到一定的纯度和回收率，但是Metrizamide法要求外周血中的嗜酸性粒细胞数至少为白细胞的2%，且易造成嗜酸性粒细胞的皱缩，而Percoll法更是要求嗜酸性粒细胞至少为外周血白细胞的4%，因此采用以上2种不连续的密度梯度离心法很难从正常人群中分离出大量的高纯度嗜酸性粒细胞。我们采用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，获得较好的效果。
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1 材料与方法
1.1 试剂 磁性微球，武汉工业大学与本校免疫教研室共同研制，球形，表面功能基团为羧基；鼠抗人CD16单克隆抗体，北京邦定生物医学公司生产，与人中性粒细胞表面CD16特异结合；Percoll贮存液，Pharmacia公司生产，密度1.13±0.001，根据有关文献配成密度为1.083的Percoll应用液[3，4]；乙醇胺，郑州市化学试剂三厂生产，用以封闭磁性微球余下的活性基团；SPA(葡萄球菌A蛋白)，上海生物制品研究所生产，与单克隆抗体Fc段有强结合力；FCS(胎牛血清)，中德三利生物制品厂生产；异硫氰基荧光黄(FITC)标记的羊抗鼠IgG抗体，上海生物制品研究所生产。
1.2 器材 自制MACS(Magnetic Activated Cell Sorter，磁性细胞分选仪)，由武汉冶金研究所与本科共同研制，主要由永久磁场(磁场强度为0.54特斯拉)和分离柱组成，分离柱内含不锈钢丝绒，提供细胞停留的表面及强磁场，便于细胞的分离；低温冷冻离心机：美国贝克曼公司生产；CELL-DYN3500血细胞计数仪：美国雅培公司生产；荧光显微镜：日本奥林巴斯公司生产。
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1.3 标本 健康献血者28例，外周血嗜酸性粒细胞计数(0.05×109～0.40×109) L-1。哮喘等各种变态反应性疾病病人21例，外周血嗜酸性粒细胞计数(0.5×109～1.78×109) L-1。
1.4 方法
1.4.1 磁性微球的标记 空白磁性微球悬液，加入等体积的SPA溶液，4℃过夜孵育，不断振摇，用磁场收集磁性微球，加5倍体积乙醇胺溶液(1 mol/L、pH=8.0)，室温放置1 h，不断振摇，用以封闭磁性微球余下的活性基团。然后用PBS洗涤，加入鼠抗人CD16单克隆抗体，4℃孵育1 h，PBS洗涤，然后配成一定浓度的鼠抗人CD16单克隆抗体标记的免疫磁性微球(Immunomagnetic Microbeads，IMB)，4℃无菌保存。
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1.4.3 嗜酸性粒细胞的分离 将免疫磁性微球与已分离的粒细胞悬液混合(免疫磁性微球数∶细胞总数=20∶1)，4℃孵育1 h。然后加入冰冷的PBS 4 ml(含2%FCS)，并将液体转移至自制MACS的分离柱，用50 ml的刻度试管收集过柱液，再次加入冰冷的PBS 32 ml(含2%FCS)，收集过柱液，400 g离心7 min，用CELL-DYN3500血细胞计数仪对嗜酸性粒细胞进行计数，并进行瑞氏染色和台盼蓝染色，计算分离的嗜酸性粒细胞的纯度、存活率与回收率。
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1.4.4 残留CD16+的细胞的检测 将分离后的细胞用PBS(含2%FCS)悬浮，使细胞浓度2×106 ml-1，取100 μl的细胞悬液于试管中，加入20 μl的鼠抗人CD16单克隆抗体，混匀后4℃孵育1 h，然后用PBS(含2%FCS)洗涤3次，4℃离心7 min(400 g)，保留约50 μl液体，再加入20 μl的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，混匀后孵育、洗涤、离心(条件同前)，保留少许液体于试管中，混匀，吸一滴于玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜计数产生特异性荧光的细胞，并用普通光源计数细胞总数，计算两者的比率(即为残留的CD16+的细胞比率)。
2 结果
2.1 由于CD16存在中性粒细胞表面，而不存在于嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞表面，因此中性粒细胞与鼠抗人CD16单克隆抗体标记的IMB结合(见图1、2)，而嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞则不与该IMB结合，能自由通过自制的MACS的分离柱，由于嗜碱性粒细胞在正常人及哮喘等变态反应性疾病人外周血含量极少，故分离后的细胞绝大部分为嗜酸性粒细胞(见图3)。
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2.2 健康献血者(简称健康组)外周血嗜酸性粒细胞的分离前后通过CELL-DYN 3500计数嗜酸性粒细胞，发现嗜酸性粒细胞的回收率为69.7%±6.8%，台盼蓝染色示细胞存活率为95.4%±1.8%，瑞氏染色发现嗜酸性粒细胞的纯度为90.7%±4.3%，残留CD16+的细胞的比率为8.8%±3.9%，详见表1。
图1 粒细胞与IMB的结合(瑞氏染色×400)
Fig.1 The combination of granule cell(Wright stain×400)
图2 粒细胞与IMB的结合(瑞氏染色×1000)
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Fig.2 The combination of granule cell(Wright stain×1000)
图3 分离后的嗜酸性粒细胞(瑞氏染色×1 000)
Fig.3 The eosinophils after isolation (Wright stain×1 000)
表1 外周血嗜酸性粒细胞分离结果(
±s)Tab.1 The results of isolating eosinophil from peripheral blood(
±s) Group, http://www.100md.com
n
Recoverh
Viability(%)
Purity(%)
CD16+cell(%)
Healty
28
69.7±6.8
95.4±1.8
90.7±4.3
8.8±3.9
Asthma
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21
60.4±5.4
96.1±0.7
92.6±5.1
6.5±4.7
2.3 哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为60.4%±5.4%，存活率为96.1%±0.7%，纯度为92.6%±5.1%，残留CD16+的细胞的比率为6.5%±4.7%，详见表1。
3 讨论
磁性细胞分选技术是本世纪80年代发展起来的一种高效的细胞分离方法，在国外已广泛用于细胞分离，如CD4、CD8、CD34等[5-7]，但是由于磁性细胞分选技术所需试剂价格较贵，国内目前尚未普遍开展，其主要原理是通过特异性单克隆抗体对细胞表面抗原的特异性识别，将偶联在抗体上的磁性微球标记在细胞上，从而将细胞进行分离。磁性细胞分选技术的阴性选择法是将非目的细胞带上特异性单克隆抗体标记的磁性微球，收集未标记细胞。
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本研究采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，包括4个步骤：首先，通过SPA将鼠抗人CD16的单克隆抗体与磁性微球偶联，制备免疫磁性微球，这是因为SPA不仅能通过其氨基与磁性微球的羧基缩合，而且与特异性单克隆抗体的Fc段有强结合力却不影响该抗体的活性；其次，用密度为1.083的Percoll应用液去除单个核细胞，保留富含红细胞、粒细胞层；其次用155 mmol/L的NH4Cl溶液裂解红细胞，得到粒细胞悬液；最后将鼠抗人CD16的单克隆抗体标记的免疫磁性微球与粒细胞孵育，通过自制的MACS的分离柱，采用阴性选择法分离嗜酸性粒细胞。结果发现，①健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69.7%±6.8%，存活率为95.4%±1.8%，纯度为90.7%±4.3%，残留CD16+的细胞的比率为8.8%±3.9%；②哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为60.4%±5.4%，存活率为96.1%±0.7%，纯度为92.6%±5.1%，残留CD16+的细胞的比率为6.5%±4.7%。以上结果表明：①此方法能成功地分离正常人以及高嗜酸性粒细胞血症病人嗜酸性粒细胞，这是其它几种方法所不能比拟的。如使用Percoll液的不连续密度梯度离心法要求外周血中嗜酸性粒细胞至少为白细胞的4%，而Metrizamide法则要求嗜酸性粒细胞的比率大于2%。②具有较高的灵敏度和特异性。尽管分离后含有少量的CD16+的中性粒细胞，但本研究结果基本接近于国外的报道，Hanse报道利用Dynal磁性微球分离的纯度>95%[8，9]，回收率约为60%，而利用MACS磁性微球分离的纯度则为99.5%±0.1%，回收率高达80%。③存活率高，有利于嗜酸性粒细胞的培养与功能研究。④不影响嗜酸性粒细胞的功能，尽管目前已有文献报道，采用磁性细胞分选技术会影响细胞的功能，但是影响仅限于阳性选择分离的细胞[6，10]，而阴性选择的细胞目前还未见此方面的报道，而研究分离嗜酸性粒细胞采用了阴性选择法，故不会影响嗜酸性粒细胞的功能。
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通过以上分析可看出，磁性细胞分选技术阴性选择法，是一种高效率的外周血嗜酸性粒细胞的分离方法，为其后嗜酸性粒细胞的功能研究提供了有利的基础，而且本实验利用国产磁性微球分离嗜酸性粒细胞，其效果接近于采用Dynal磁性微球和MACS磁性微球，为国内广泛开展磁性细胞分选技术提供了一定的理论与实践基础。
作者简介：李一荣，男，29岁，硕士，主要从事临床免疫学的检验工作
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[收稿1999-09-31 修回1999-12-22], http://www.100md.com