树突状细胞体外定向诱导扩增及其分离纯化
作者：白慈贤 冯凯 李梁 裴雪涛
单位：白慈贤(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)；冯凯(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)；李梁(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)；裴雪涛(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)
关键词：树突状细胞；诱导分化；分离纯化
中国免疫学杂志000807 摘 要 目的：探讨定向诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法：利用免疫磁珠法(MACS)分离纯化脐血CD34+细胞，在液体培养体系中加入FL、GM-CSF、TNF-α、IL-4及SCF，培养12 d后光镜检测细胞形态及流式细胞仪分析表面标志(CDla、HLA-DR及CD80)；利用抗树突状细胞单克隆抗体(X-11)及免疫磁珠分离纯化树突状细胞，流式细胞仪检测纯化后DC的纯度。结果：经体外定向诱导扩增，可成功地将CD34+细胞定向诱导为树突状细胞，CDla+细胞的比例可升至(27.18±1.56)%〔对照为(0.65±0.38)%)〕，诱导出的DC具有典型的树枝状突起，有较高的CDla、HLA-DR及CD80表达，经免疫磁珠分选，树突状细胞(CDla+)的纯度可达(94.61±2.24)%以上。结论：经特定细胞因子的组合，可将CD34+细胞定向诱导成DC，并可通过免疫磁珠法分选出纯度达90%以上的DC。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392-33
Studies on the committed differentiation and purification of dendritic cells
BAI Ci-Xian，FENG Kai，LI Liang et al.
Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850
Abstract Objective:To elucidate and provide methods for inducing CD34+ cells to differentiate to dendritic cells(DCs) and for purifying DC.Methods:CD34+ cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system(MACS) and cultured with cytokines including FL、GM-CSF、TNF-α、IL-4 and SCF in a liquid culture system.Cells harvested after 12 days were detected for morphological and phenotypic analysis by microscope，and FACS respectively.DCs were purified by using monoclonal antibody X-11 and magnetic beads.Results:CD34+ cells can be induced into DCs in the culture system and the DCs can be purified at the grade of (94.61±2.24)% by using magnetic beads labeled monoclonal antibody mediated cell sorting system.The induced cells have the typic morphology and high expression of CDla，HLA-DR and CD80.Conclusion:It is possible to induce CD34+ cells to DCs and induced DCs can be purified at the grade of about 90%.
, 百拇医药
Key words Dendritic cells Induction of differentiation Purifying
树突状细胞(Dendritic cells，DC)是目前为止发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，它对诱导初次免疫应答具有独特的功能，在对抗原的摄取、加工、处理及提呈过程中，DC既具有一般APC的共性，也表现出一些独特的生物学特性。由于它在机体的抗感染免疫及抗肿瘤免疫应答中的作用极其重要而备受重视，成为近年来免疫学研究的热点。但DC在体内分布广泛且数量较少，因此如何获得大量的纯化的DC就成为进一步研究DC特性及功能的前提。为进一步研究树突状细胞的功能及特性，我们建立了利用脐血CD34+细胞诱导DC及其纯化的方法，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞来源 脐血样品采自解放军总医院，肝素抗凝终浓度为20 U/ml，平均采血量为50～80 ml，样品在采集24 h内分选，细胞经PBS缓冲液稀释，Ficoll(相对密度1.077)梯度离心，收集界面层单个核细胞(MNC)，洗涤备用。
, 百拇医药
1.2 CD34+细胞的分离纯化 如我们以往的报道，利用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统(MACS)进行分离，所用抗CD34抗体为QBEND-10，磁珠为羊抗鼠IgG1免疫磁珠(德国Miltenyi Biotec公司)。标记细胞通过置于磁场中的分离柱，洗脱去除CD34-细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD34+细胞，每份脐血(50～80 ml)可分离纯化出(2.58±1.04)×106 CD34+细胞。流式细胞仪(FACScan，美国BD公司)检测其纯度，标记抗体为FITC结合的抗HPCA-2(CD34)抗体8G12(BD公司)。
1.3 CD34+细胞体外诱导分化体系 IMDM(Gibco公司)培养基中含体积分数为12.5%的HS、12.5%的FCS、5×10-7mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103 ml-1及不同组合的重组细胞因子。上述体系接种于24孔板(Costar公司)中，每孔1 ml，复种5孔，37℃、体积分数为5%CO2空气条件下培养2 w，每2 d 加入细胞因子1次，共加5次，12 d后收获细胞用于细胞表面标志检测及纯化。
, 百拇医药
1.4 重组细胞因子及实验分组 细胞因子来源及浓度见表1。按4种细胞因子的组合分为6组：对照组(不加任何细胞因子)；SCF+GM-CSF；SCF+GM-CSF+IL-4；FL+GM-CSF+IL-4；SCF+GM-CSF+IL-4+TNF-α；FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α。
1.5 细胞形态学分析 倒置显微镜(Olympus)下观察细胞并摄影。
1.6 树突状细胞的分离纯化 采用Immunotech公司的免疫磁珠分选系统，抗树突状细胞单克隆抗体为X-11(小鼠IgGl)，用此单克隆抗体与抗鼠IgG的免疫磁珠4℃孵育30 min，再加入到诱导后的细胞中，孵育30 min后，将试管放到带有强磁场的试管架(Immunotech公司)上，吸掉未吸附的细胞，将试管移开磁场，收获细胞，PBS缓冲液洗涤2次，用于检测CDla。
1.7 细胞表面的流式细胞仪分析 用于表面标志细胞检测的单克隆抗体为PE结合的鼠抗人CDla单抗、FITC结合的CD80(B71)单抗及PE结合的HLA-DR单抗(Pharmigen公司，深圳晶美)。抗体1：10稀释，与细胞4℃孵育20～25 min，PBS洗涤2次，重新悬浮，流式细胞仪检测，所用流式细胞仪为Coulter公司的ELITE型，分析软件为ELITE，每个样品分析细胞数≥5×104。
, 百拇医药
表1 细胞因子来源及终浓度
Tab.1 Sources and working concentration of different cytokines Cytokines
Source
End concentration(ml-1)
SCF
Sandoz Co.
100 ng
GM-CSF
Glaxo Co.
40 ng
, 百拇医药
TNF-α
Pepro Tech Co.
50 U
IL-4
Promega Co.
1 000 U
FL
Immunex Co.
40 ng
1.8 统计学分析 采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 CD34+细胞向树突状细胞的定向诱导分化 DC表达CDla抗原，在SCF、GM-CSF、TNF-α及IL-4等细胞因子的诱导下，CD34+细胞可分化形成大量的DC(CDla+)。图1显示了不同细胞因子组合对DC生成的诱导效率，可见诱导培养2 w后，不含细胞因子的对照组，CDla+细胞仅占细胞总数的(0.65±0.38)%，而不同细胞因子的组合则可使CDla+细胞的比例增至(3.13±0.39)%～(27.18±1.56)%，且培养细胞中可见大量的DC(图2)，其中GM-CSF和TNF-α及IL-4是诱导生成DC的基本细胞因子，SCF和FL对诱导CD34+细胞生成DC具有明显的协同作用，FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α的组合诱导扩增效率最高(组间比较，P<0.01)。
, http://www.100md.com
2.2 扩增后的DC的表面标志 CDla+、CD80+(B71)及HLA-DR+细胞的比例分别由扩增前的(0.65±0.38)%，(0.36±0.25)%及(2.39±0.27)%增加至纯化后的(27.18±1.56)%、(22.26±2.23)%及(87.68±3.81)%。
图1 脐血CD34+细胞诱导生成DC
Fig.1 Efficiency of DC induction from cord blood CD34+ cells Note:1：control(no cytokine)；2：SCF+GM-CSF；3：SCF+GM-CSF+IL-4；4：FL+GM-CSF+IL-4；5：SCF+GM-CSF+IL-4+TNF-α；6：FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α
, http://www.100md.com
图2 脐血CD34+细胞定向诱导生成DC形态
Fig.2 Morphology of DC induced from cord blood CD34+ cells
图3 诱导扩增前后及纯化后CDla+细胞检测的FACS结果
Fig.3 FACS analysis of the CD1a+ cells before and after induction and after purification
Note:A：before induction；B：after induction；C：after purification
, 百拇医药
2.3 树突状细胞的分离纯化 扩增前的细胞CDla+细胞为(0.65±0.38)%，定向诱导扩增后为(27.18±1.56)%，经过免疫磁珠的分离筛选，纯化后的DC的CDla表达可增加至(94.61±2.24)%，见图3。
3 讨论
造血干/祖细胞是具有高度增殖能力和多向分化潜能的细胞群体，它们主要存在于成人骨髓、胎儿肝脏及脐带血中，利用其表达CD34抗原的特性，我们可将其分离纯化出来。脐带血则是较易获得、价格低廉且又是造血干/祖细胞含量丰富的资源，因而，成为造血细胞工程最主要的资源之一，在干细胞移植、基因治疗及免疫治疗等领域具有广阔的应用前景。扩增造血干/祖细胞的同时，也明显加速了其分化，这是造血细胞扩增所面临的一个难题，但同时也为我们展开了一个新的研究领域，即利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，通过细胞因子的不同组合，定向地诱导其分化，产生大量我们所需的功能细胞，满足基础研究及临床应用的需要。
, http://www.100md.com
DC是一类专职的抗原递呈细胞，在肿瘤免疫、移植免疫和免疫缺陷病中发挥关键作用[1]，而且也是最近新兴的造血细胞工程中细胞治疗的重要组成部分[2]，因此，诱导扩增及获取大量纯化的DC无论在有关DC的基础研究及其临床应用方面都具有十分重要的意义。
我们利用SCF、FL、GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子的不同组合对脐带血CD34+细胞进行了DC的定向诱导和扩增，获得了较满意的结果。从图1中我们可以看出FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α的扩增效率最高，细胞因子配伍及应用顺序在不同细胞来源DC的诱生中是不同的[3-5]，我们在实验中发现，脐血CD34+细胞作为DC的一种来源，其细胞因子组合中除需要GM-CSF和TNF-α的支持外，SCF和FL也是有明显协同扩增效应的2种因子，且FL表现出的作用更强。现在认为FL的作用与CD34+细胞表达高水平的Flt-3有关，两者结合可促进细胞的增殖并可刺激某些在体外对细胞因子不敏感的干细胞分化。在含有基质的长期培养环境中，FL的作用远远大于SCF。GM-CSF的作用是使CD34+细胞向DC及巨噬细胞分化，IL-4及TNF-α的作用则抑制巨噬细胞的生成，从而保证该细胞因子组合，使更多的CD34+细胞向DC定向诱导分化。
, 百拇医药
CDla被公认为是DC的重要表面分子。DC发挥其生理功能一方面离不开MHC-Ⅱ类及Ⅰ类抗原，另一方面共刺激信号B7(CD80及CD86)和ICAM-1等分子的表达也必不可少。我们的实验表明，诱导前的CD34+细胞仅表达极少量的上述分子，但经诱导后细胞的CDla、HLA-DR及CD80的表达明显增高。X-11单克隆抗体是Immunotech公司研制出的针对DC的特异性单抗，将它与磁珠结合再与细胞共同孵育，孵育后的细胞经过磁场后所收集的细胞均是被X-11所标记的细胞从而达到纯化DC的目的，我们的结果表明，经上述方法纯化的DC，其纯度可达90%以上，从而可以满足进一步的基础研究和临床应用的需要。在DC研究的初期，DC本身的特性限制了它成为抗原的载体，首先DC在血液中含量甚微，淋巴器官中稍多但也难收集到治疗所需的数量；其次DC缺乏特异性表面标志，不易分离纯化；再有DC高度分化，难以体外建系大量培养，我们的上述研究结果为DC的扩增及纯化提供了有效可行的方法，并为进一步研究DC的功能、特性及临床应用奠定了基础。
, 百拇医药 本课题受国家杰出青年科学基金(39825111)及人类基因组计划南方中心基金资助
作者简介：裴雪涛，男，38岁，教授，博士生导师，主要从事干细胞工程的研究
参考文献
[1]Wright B V，McClain K L，Talpaz M et al.Physiology and pathophysiology of dendritic cells.Hum Pathol，1997;28:563
[2]裴雪涛.造血细胞工程——一个新兴的研究与应用领域.上海医学，1999；22(4)：199
[3]Chapuis F，Rosenzwajg M，Yagello M et al.Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.Eur J Immunol，1997；27:431
, 百拇医药
[4]Hermans I F，Daish A，Rawson P M et al.Tumor-peptide-pulsed dendritic cells isolated from spleen or cultured in vivo from bone marrow precursors can provide protection against tumor challenge.Cancer Immunol Immunother，1997；44:341
[5]Caux C，Vanbervliet B，Massacrier C et al.CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF-α.J Exp Med，1996；184:695
[收稿：1999-11-17], 百拇医药
单位：白慈贤(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)；冯凯(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)；李梁(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)；裴雪涛(军事医学科学院放射医学研究所国家生物医学分析中心，北京 100850)
关键词：树突状细胞；诱导分化；分离纯化
中国免疫学杂志000807 摘 要 目的：探讨定向诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法：利用免疫磁珠法(MACS)分离纯化脐血CD34+细胞，在液体培养体系中加入FL、GM-CSF、TNF-α、IL-4及SCF，培养12 d后光镜检测细胞形态及流式细胞仪分析表面标志(CDla、HLA-DR及CD80)；利用抗树突状细胞单克隆抗体(X-11)及免疫磁珠分离纯化树突状细胞，流式细胞仪检测纯化后DC的纯度。结果：经体外定向诱导扩增，可成功地将CD34+细胞定向诱导为树突状细胞，CDla+细胞的比例可升至(27.18±1.56)%〔对照为(0.65±0.38)%)〕，诱导出的DC具有典型的树枝状突起，有较高的CDla、HLA-DR及CD80表达，经免疫磁珠分选，树突状细胞(CDla+)的纯度可达(94.61±2.24)%以上。结论：经特定细胞因子的组合，可将CD34+细胞定向诱导成DC，并可通过免疫磁珠法分选出纯度达90%以上的DC。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392-33
Studies on the committed differentiation and purification of dendritic cells
BAI Ci-Xian，FENG Kai，LI Liang et al.
Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850
Abstract Objective:To elucidate and provide methods for inducing CD34+ cells to differentiate to dendritic cells(DCs) and for purifying DC.Methods:CD34+ cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system(MACS) and cultured with cytokines including FL、GM-CSF、TNF-α、IL-4 and SCF in a liquid culture system.Cells harvested after 12 days were detected for morphological and phenotypic analysis by microscope，and FACS respectively.DCs were purified by using monoclonal antibody X-11 and magnetic beads.Results:CD34+ cells can be induced into DCs in the culture system and the DCs can be purified at the grade of (94.61±2.24)% by using magnetic beads labeled monoclonal antibody mediated cell sorting system.The induced cells have the typic morphology and high expression of CDla，HLA-DR and CD80.Conclusion:It is possible to induce CD34+ cells to DCs and induced DCs can be purified at the grade of about 90%.
, 百拇医药
Key words Dendritic cells Induction of differentiation Purifying
树突状细胞(Dendritic cells，DC)是目前为止发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，它对诱导初次免疫应答具有独特的功能，在对抗原的摄取、加工、处理及提呈过程中，DC既具有一般APC的共性，也表现出一些独特的生物学特性。由于它在机体的抗感染免疫及抗肿瘤免疫应答中的作用极其重要而备受重视，成为近年来免疫学研究的热点。但DC在体内分布广泛且数量较少，因此如何获得大量的纯化的DC就成为进一步研究DC特性及功能的前提。为进一步研究树突状细胞的功能及特性，我们建立了利用脐血CD34+细胞诱导DC及其纯化的方法，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞来源 脐血样品采自解放军总医院，肝素抗凝终浓度为20 U/ml，平均采血量为50～80 ml，样品在采集24 h内分选，细胞经PBS缓冲液稀释，Ficoll(相对密度1.077)梯度离心，收集界面层单个核细胞(MNC)，洗涤备用。
, 百拇医药
1.2 CD34+细胞的分离纯化 如我们以往的报道，利用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统(MACS)进行分离，所用抗CD34抗体为QBEND-10，磁珠为羊抗鼠IgG1免疫磁珠(德国Miltenyi Biotec公司)。标记细胞通过置于磁场中的分离柱，洗脱去除CD34-细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD34+细胞，每份脐血(50～80 ml)可分离纯化出(2.58±1.04)×106 CD34+细胞。流式细胞仪(FACScan，美国BD公司)检测其纯度，标记抗体为FITC结合的抗HPCA-2(CD34)抗体8G12(BD公司)。
1.3 CD34+细胞体外诱导分化体系 IMDM(Gibco公司)培养基中含体积分数为12.5%的HS、12.5%的FCS、5×10-7mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103 ml-1及不同组合的重组细胞因子。上述体系接种于24孔板(Costar公司)中，每孔1 ml，复种5孔，37℃、体积分数为5%CO2空气条件下培养2 w，每2 d 加入细胞因子1次，共加5次，12 d后收获细胞用于细胞表面标志检测及纯化。
, 百拇医药
1.4 重组细胞因子及实验分组 细胞因子来源及浓度见表1。按4种细胞因子的组合分为6组：对照组(不加任何细胞因子)；SCF+GM-CSF；SCF+GM-CSF+IL-4；FL+GM-CSF+IL-4；SCF+GM-CSF+IL-4+TNF-α；FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α。
1.5 细胞形态学分析 倒置显微镜(Olympus)下观察细胞并摄影。
1.6 树突状细胞的分离纯化 采用Immunotech公司的免疫磁珠分选系统，抗树突状细胞单克隆抗体为X-11(小鼠IgGl)，用此单克隆抗体与抗鼠IgG的免疫磁珠4℃孵育30 min，再加入到诱导后的细胞中，孵育30 min后，将试管放到带有强磁场的试管架(Immunotech公司)上，吸掉未吸附的细胞，将试管移开磁场，收获细胞，PBS缓冲液洗涤2次，用于检测CDla。
1.7 细胞表面的流式细胞仪分析 用于表面标志细胞检测的单克隆抗体为PE结合的鼠抗人CDla单抗、FITC结合的CD80(B71)单抗及PE结合的HLA-DR单抗(Pharmigen公司，深圳晶美)。抗体1：10稀释，与细胞4℃孵育20～25 min，PBS洗涤2次，重新悬浮，流式细胞仪检测，所用流式细胞仪为Coulter公司的ELITE型，分析软件为ELITE，每个样品分析细胞数≥5×104。
, 百拇医药
表1 细胞因子来源及终浓度
Tab.1 Sources and working concentration of different cytokines Cytokines
Source
End concentration(ml-1)
SCF
Sandoz Co.
100 ng
GM-CSF
Glaxo Co.
40 ng
, 百拇医药
TNF-α
Pepro Tech Co.
50 U
IL-4
Promega Co.
1 000 U
FL
Immunex Co.
40 ng
1.8 统计学分析 采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 CD34+细胞向树突状细胞的定向诱导分化 DC表达CDla抗原，在SCF、GM-CSF、TNF-α及IL-4等细胞因子的诱导下，CD34+细胞可分化形成大量的DC(CDla+)。图1显示了不同细胞因子组合对DC生成的诱导效率，可见诱导培养2 w后，不含细胞因子的对照组，CDla+细胞仅占细胞总数的(0.65±0.38)%，而不同细胞因子的组合则可使CDla+细胞的比例增至(3.13±0.39)%～(27.18±1.56)%，且培养细胞中可见大量的DC(图2)，其中GM-CSF和TNF-α及IL-4是诱导生成DC的基本细胞因子，SCF和FL对诱导CD34+细胞生成DC具有明显的协同作用，FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α的组合诱导扩增效率最高(组间比较，P<0.01)。
, http://www.100md.com
2.2 扩增后的DC的表面标志 CDla+、CD80+(B71)及HLA-DR+细胞的比例分别由扩增前的(0.65±0.38)%，(0.36±0.25)%及(2.39±0.27)%增加至纯化后的(27.18±1.56)%、(22.26±2.23)%及(87.68±3.81)%。
图1 脐血CD34+细胞诱导生成DC
Fig.1 Efficiency of DC induction from cord blood CD34+ cells Note:1：control(no cytokine)；2：SCF+GM-CSF；3：SCF+GM-CSF+IL-4；4：FL+GM-CSF+IL-4；5：SCF+GM-CSF+IL-4+TNF-α；6：FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α
, http://www.100md.com
图2 脐血CD34+细胞定向诱导生成DC形态
Fig.2 Morphology of DC induced from cord blood CD34+ cells
图3 诱导扩增前后及纯化后CDla+细胞检测的FACS结果
Fig.3 FACS analysis of the CD1a+ cells before and after induction and after purification
Note:A：before induction；B：after induction；C：after purification
, 百拇医药
2.3 树突状细胞的分离纯化 扩增前的细胞CDla+细胞为(0.65±0.38)%，定向诱导扩增后为(27.18±1.56)%，经过免疫磁珠的分离筛选，纯化后的DC的CDla表达可增加至(94.61±2.24)%，见图3。
3 讨论
造血干/祖细胞是具有高度增殖能力和多向分化潜能的细胞群体，它们主要存在于成人骨髓、胎儿肝脏及脐带血中，利用其表达CD34抗原的特性，我们可将其分离纯化出来。脐带血则是较易获得、价格低廉且又是造血干/祖细胞含量丰富的资源，因而，成为造血细胞工程最主要的资源之一，在干细胞移植、基因治疗及免疫治疗等领域具有广阔的应用前景。扩增造血干/祖细胞的同时，也明显加速了其分化，这是造血细胞扩增所面临的一个难题，但同时也为我们展开了一个新的研究领域，即利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，通过细胞因子的不同组合，定向地诱导其分化，产生大量我们所需的功能细胞，满足基础研究及临床应用的需要。
, http://www.100md.com
DC是一类专职的抗原递呈细胞，在肿瘤免疫、移植免疫和免疫缺陷病中发挥关键作用[1]，而且也是最近新兴的造血细胞工程中细胞治疗的重要组成部分[2]，因此，诱导扩增及获取大量纯化的DC无论在有关DC的基础研究及其临床应用方面都具有十分重要的意义。
我们利用SCF、FL、GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子的不同组合对脐带血CD34+细胞进行了DC的定向诱导和扩增，获得了较满意的结果。从图1中我们可以看出FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α的扩增效率最高，细胞因子配伍及应用顺序在不同细胞来源DC的诱生中是不同的[3-5]，我们在实验中发现，脐血CD34+细胞作为DC的一种来源，其细胞因子组合中除需要GM-CSF和TNF-α的支持外，SCF和FL也是有明显协同扩增效应的2种因子，且FL表现出的作用更强。现在认为FL的作用与CD34+细胞表达高水平的Flt-3有关，两者结合可促进细胞的增殖并可刺激某些在体外对细胞因子不敏感的干细胞分化。在含有基质的长期培养环境中，FL的作用远远大于SCF。GM-CSF的作用是使CD34+细胞向DC及巨噬细胞分化，IL-4及TNF-α的作用则抑制巨噬细胞的生成，从而保证该细胞因子组合，使更多的CD34+细胞向DC定向诱导分化。
, 百拇医药
CDla被公认为是DC的重要表面分子。DC发挥其生理功能一方面离不开MHC-Ⅱ类及Ⅰ类抗原，另一方面共刺激信号B7(CD80及CD86)和ICAM-1等分子的表达也必不可少。我们的实验表明，诱导前的CD34+细胞仅表达极少量的上述分子，但经诱导后细胞的CDla、HLA-DR及CD80的表达明显增高。X-11单克隆抗体是Immunotech公司研制出的针对DC的特异性单抗，将它与磁珠结合再与细胞共同孵育，孵育后的细胞经过磁场后所收集的细胞均是被X-11所标记的细胞从而达到纯化DC的目的，我们的结果表明，经上述方法纯化的DC，其纯度可达90%以上，从而可以满足进一步的基础研究和临床应用的需要。在DC研究的初期，DC本身的特性限制了它成为抗原的载体，首先DC在血液中含量甚微，淋巴器官中稍多但也难收集到治疗所需的数量；其次DC缺乏特异性表面标志，不易分离纯化；再有DC高度分化，难以体外建系大量培养，我们的上述研究结果为DC的扩增及纯化提供了有效可行的方法，并为进一步研究DC的功能、特性及临床应用奠定了基础。
, 百拇医药 本课题受国家杰出青年科学基金(39825111)及人类基因组计划南方中心基金资助
作者简介：裴雪涛，男，38岁，教授，博士生导师，主要从事干细胞工程的研究
参考文献
[1]Wright B V，McClain K L，Talpaz M et al.Physiology and pathophysiology of dendritic cells.Hum Pathol，1997;28:563
[2]裴雪涛.造血细胞工程——一个新兴的研究与应用领域.上海医学，1999；22(4)：199
[3]Chapuis F，Rosenzwajg M，Yagello M et al.Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.Eur J Immunol，1997；27:431
, 百拇医药
[4]Hermans I F，Daish A，Rawson P M et al.Tumor-peptide-pulsed dendritic cells isolated from spleen or cultured in vivo from bone marrow precursors can provide protection against tumor challenge.Cancer Immunol Immunother，1997；44:341
[5]Caux C，Vanbervliet B，Massacrier C et al.CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF-α.J Exp Med，1996；184:695
[收稿：1999-11-17], 百拇医药