ACI血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2表达
作者：薛慎伍 孙晓明 尹格平 李云峰 陈 青!0/#.6, 百拇医药
单位：济南军区总医院神经内科 济南 250031!0/#.6, 百拇医药
关键词：脑梗塞 血小板 淋巴细胞 Fas APO2.7 bcl-2!0/#.6, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990315 摘 要 测急性脑梗死(ACI)患者血浆中血小板和淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率，为研究上述促、抑凋亡基因对ACI形成机制及预后的影响，寻找超早期防治措施。用流式细胞仪对制备好的血小板和淋巴细胞膜样本进行测定。结果：ACI组血小板、Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率均显著高于对照组，P<0.05。淋巴细胞膜除bcl-2显著低于对照组外，余均高于健康对照组，P<0.01。血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率改变参与ACI形成机制,可将上述指标改变列为超早期诊断和治疗ACI客观指标之一。!0/#.6, 百拇医药
中图号 R743.33!0/#.6, 百拇医药
ACI THROMBOCYTE AND LYMPHOCYTE MEMBRANE FAS APO2.7 bcl-2 EXPRESSION!0/#.6, 百拇医药
Xue Shenwu， Sun Xiaoming， Yin Geping，Li Yunfeng，Chen Qing!0/#.6, 百拇医药
(Jinan Military General Hospital PLA， Jinan 250031)!0/#.6, 百拇医药
Abstract To research promote or inhibit gene influence on the mechanism and prognosis of ACI， we measured hematoplasma thrombocyte and lymphocyte membrane FasAPO2.7， bcl-2 positive expression rate in the patients with acute cerebral ischemia (ACI). The samples of thrombocyte and lymphocyte were inspected with FCM. The results shew that Fas APO2.7 bcl-2 positive expression rate in the groups of patients with ACI was higher than the groups of normal group significantely， P<0.05. Lymphocyte membrane bcl-2 in the group of patients was lower singificantily than the group of control， the others were higher than group of control， P<0.01. These revealed the alterration that of Fas， APO2.7 and bcl-2 positive expression rate in thrombocyte and lymphocyte mabrane probably participated in the mechanism of ACI.
Key words Cerebral infarction； Thrombocyte， Lymphocyte， Fas，APO2.7，bcl-2g+dr, 百拇医药
急性脑梗死(ACI)患者血小板膜和淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率的流式细胞测定尚未见报告。本文目的是探讨Fas、APO2.7促细胞凋亡基因和bcl-2抑细胞凋亡基因对脑梗死形成机制及预后的影响，寻找早期防治脑梗死的有利措施。现将本文自1996.10-1998.8研究26例患者结果报告如下。g+dr, 百拇医药
1 资料与方法g+dr, 百拇医药
1.1 临床资料 本组26例，均为男性，平均年龄66.5(60～73)岁。设健康组20例做对照，性别和年龄与患病组相搭配。脑梗死患者按1995年全国第4届成都脑血管病会议制定的标准诊断。受试者平素均无血小板及淋巴细胞性免疫缺陷疾病，2周前未服用激素类药物。g+dr, 百拇医药
1.2 方法g+dr, 百拇医药
1.2.1 特殊试剂：①异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体Fas、Bcl-2(鼠抗人-FITC)及免疫阳性对照抗体(羊抗鼠IgG1-FITC)。②藻红蛋白(PE)APO2.7(鼠抗人-PE)、免疫阳性对照PE-IgG1、APO2.7。以上试剂均由法国国际免疫公司生产。淋巴细胞分离液由中国医学科学院血研所生产。g+dr, 百拇医药
1.2.2 血样本制备：①血小板制备：取2%EDTA抗凝血2ml，800r/min，离心5min，取富含血小板血浆、8%甲醛固定20min，离心1 500r/min、10min，PBS清洗1次，离心同上，弃上清液待用。②淋巴细胞制备：取肝素抗凝血2ml，重层于淋巴细胞分离液上，1 500r/min，离心15min，提取其中淋巴细胞层，再用PBS清洗2次，弃上清液，备用。③免疫反应：取5支试管，各加细胞悬液100μl，再分别加入单抗溶液20μl(Fas-FITC、Bcl-2-FITC、APO2.7-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE)，室温避光反应30min。④流式细胞仪检测；光源488nm的氢离子激光，上机前以标准微球调整仪器，使变异系数在2%以内，上机后收集1 000个细胞及血小板，测试完后Macintosh 650计算机上用Cell Quest Plot软件程序(美国BD公司产)分析数据，用HP 1200C/PS打印机打印结果。
2 结果qv0+(, 百拇医药
脑梗死组血小板膜Fas、APO2.7、bcl-2均显著高于健康对照组，两组差异显著，P<0.05～0.01；而淋巴细胞膜除bcl-2显著低于对照组外，余均高于健康对照组，这种降低和增高的水平具有显著统计学意义，P<0.001，见表1。qv0+(, 百拇医药
表1 两组血浆中血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2表达率(%)qv0+(, 百拇医药
Tab 1 Thrombocyte and Lymphocyte mamnbrane Fas、APO2.7、bcl-2 positive expression rate Groupsqv0+(, 百拇医药
Caseqv0+(, 百拇医药
Platlet Perameters(%)qv0+(, 百拇医药
Lymphocte perameters(%)qv0+(, 百拇医药
Fasqv0+(, 百拇医药
APO2.7qv0+(, 百拇医药
bcl-2qv0+(, 百拇医药
Fasqv0+(, 百拇医药
APO2.7qv0+(, 百拇医药
bcl-2qv0+(, 百拇医药
ACI Groupsqv0+(, 百拇医药
31qv0+(, 百拇医药
2.06±0.6*qv0+(, 百拇医药
2.16±1.7△qv0+(, 百拇医药
2.66±1.4qv0+(, 百拇医药
13.56±2.3△★qv0+(, 百拇医药
6.56±1.7△★qv0+(, 百拇医药
8.92±2.7★
Control Groupsl-fmhuy, 百拇医药
20l-fmhuy, 百拇医药
1.51±0.9l-fmhuy, 百拇医药
0.81±0.3l-fmhuy, 百拇医药
0.91±0.6l-fmhuy, 百拇医药
7.26±2.7 l-fmhuy, 百拇医药
3.14±1.2l-fmhuy, 百拇医药
37.13±4.6△l-fmhuy, 百拇医药
*P<0.05(Compared with control group)； ★P<0.05(Compared platelet with lymphocte)； △P<0.01l-fmhuy, 百拇医药
3 讨论l-fmhuy, 百拇医药
Fas的结构提示它属于肿瘤坏死因子(TNF)及神经生长因子(NGF)受体家族。Fas由多种细胞表达，但主要在淋巴细胞中表达[1]。Fas是一种细胞表面蛋白，被细胞毒单克隆抗体所辨认，是Fas配体的接收器，每当Fas配体与Fas结合时靶细胞即出现凋亡。Zhang[2]报告：细胞刚开始出现凋亡时7A6能被检测出来，证实7A6表达代表凋亡的早期阶段而不是细胞死亡的最后产物。Liao报道在脑炎病毒诱导的培养细胞凋亡中人类bcl-2有增强表达作用。本文研究脑梗死患者与健康人血浆中血小板膜Fas、APO2.7、bcl-2，目的是探讨两组阳性表达率之间的差异程度，进一步阐明血小板膜上述基因蛋白与脑梗死发病机制形成的关系。本文结果初步表明：脑梗死组血浆血小板膜Fas、APO2.7、bcl-2百分表达率分别以2.06、2.16、2.66高于健康对照组的1.51、0.81、0.91，差异非常显著，P<0.05～0.01。上述结果说明：脑梗死形成的急性期血小板膜Fas、APO2.7凋亡基因是增高的，而增高的上述两种基因可有改变血小板功能的调节作用，促使细胞凋亡，也可以说Fas、APO2.7增高间接或直接地参与了脑梗死的形成机制。目前已知bcl-2是对抗细胞凋亡基因，在有代偿能力的抗体中，bcl-2的增高水平更敏感，本文观测指标也证实此观点。因为bcl-2是抑制细胞凋亡基因，所以本文中血小板膜bcl-2的增高，具有两方面意义：1.bcl-2增高改变是标志着细胞凋亡存在。2.bcl-2水平越高脑梗死形成面积可能越大。
Nagata等人报道[3]Fas可以介导淋巴细胞死亡。研究发现：小鼠自发的Lpr与gld突变分别是FasL丧失功能的突变。Lpr与gld小鼠体内淋巴细胞的异常增多，提示Fas与Fasl可能参与了正常淋巴细胞的死亡。本文结果显示：患病组在血小板膜上Fas、APO2.7百分表达率均不如淋巴细胞膜表达率高，而Fas、APO2.7阳性表达率是对照组的2倍，但bcl-2阳性表达率低于对照组4倍，上述结果提示(1)Fas、APO2.7含量分布在淋巴细胞膜多于血小板。(2)Fas、APO2.7阳性表达率对淋巴细胞的功能有影响，并参与淋巴细胞凋亡。(3)机体正常情况下血小板膜对上述物质含量较少，病理突然升高，这种阳性表达率虽升高的不如淋巴细胞膜那样显著，但对脑梗死早期诊断确有实际临床价值，而淋巴细胞膜阳性表达率改变在无免疫系统疾病的情况下是否可以认为是与脑缺血后Fas、APO2.7促细胞凋亡基因影响了淋巴细胞免疫功能有关。因此可将Fas、APO2.7、bcl-2的表达率改变作为脑梗死超早期治疗的客观指标，以减少脑缺血半暗带内的神经元及其周围的各类胶质细胞的凋亡发生率，从而有利于脑神经功能的保护，降低致残率。s%y, http://www.100md.com
第一作者：男，49岁，本科，主任医师s%y, http://www.100md.com
参考文献s%y, http://www.100md.com
1 Christine M， Eischen Christopher J， Pick Paul J， et al. Tyrosine kinase activation provides an early and requistite signal for fas-Induced apoptosis. The Journay of Immunology， 1994， 153：1947s%y, http://www.100md.com
2 Zhang Chonghui， Zhao huiao， Aruna Seth， et al. A mitochondriaal membrane protein defined by a novel monocbnal antibody is preferen tially detected in apoptotic cells. The Journal of Immunology， 1996， 157：3980s%y, http://www.100md.com
3 Nagata Shigekazu， Golstein Pirre. Fas mediated death of lymphocytes. Science， 1995， 267(10)：1453s%y, http://www.100md.com
(1998-10-19收稿；1999-02-12修回)(薛慎伍 孙晓明 尹格平 李云峰 陈 青)
单位：济南军区总医院神经内科 济南 250031!0/#.6, 百拇医药
关键词：脑梗塞 血小板 淋巴细胞 Fas APO2.7 bcl-2!0/#.6, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990315 摘 要 测急性脑梗死(ACI)患者血浆中血小板和淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率，为研究上述促、抑凋亡基因对ACI形成机制及预后的影响，寻找超早期防治措施。用流式细胞仪对制备好的血小板和淋巴细胞膜样本进行测定。结果：ACI组血小板、Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率均显著高于对照组，P<0.05。淋巴细胞膜除bcl-2显著低于对照组外，余均高于健康对照组，P<0.01。血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率改变参与ACI形成机制,可将上述指标改变列为超早期诊断和治疗ACI客观指标之一。!0/#.6, 百拇医药
中图号 R743.33!0/#.6, 百拇医药
ACI THROMBOCYTE AND LYMPHOCYTE MEMBRANE FAS APO2.7 bcl-2 EXPRESSION!0/#.6, 百拇医药
Xue Shenwu， Sun Xiaoming， Yin Geping，Li Yunfeng，Chen Qing!0/#.6, 百拇医药
(Jinan Military General Hospital PLA， Jinan 250031)!0/#.6, 百拇医药
Abstract To research promote or inhibit gene influence on the mechanism and prognosis of ACI， we measured hematoplasma thrombocyte and lymphocyte membrane FasAPO2.7， bcl-2 positive expression rate in the patients with acute cerebral ischemia (ACI). The samples of thrombocyte and lymphocyte were inspected with FCM. The results shew that Fas APO2.7 bcl-2 positive expression rate in the groups of patients with ACI was higher than the groups of normal group significantely， P<0.05. Lymphocyte membrane bcl-2 in the group of patients was lower singificantily than the group of control， the others were higher than group of control， P<0.01. These revealed the alterration that of Fas， APO2.7 and bcl-2 positive expression rate in thrombocyte and lymphocyte mabrane probably participated in the mechanism of ACI.
Key words Cerebral infarction； Thrombocyte， Lymphocyte， Fas，APO2.7，bcl-2g+dr, 百拇医药
急性脑梗死(ACI)患者血小板膜和淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率的流式细胞测定尚未见报告。本文目的是探讨Fas、APO2.7促细胞凋亡基因和bcl-2抑细胞凋亡基因对脑梗死形成机制及预后的影响，寻找早期防治脑梗死的有利措施。现将本文自1996.10-1998.8研究26例患者结果报告如下。g+dr, 百拇医药
1 资料与方法g+dr, 百拇医药
1.1 临床资料 本组26例，均为男性，平均年龄66.5(60～73)岁。设健康组20例做对照，性别和年龄与患病组相搭配。脑梗死患者按1995年全国第4届成都脑血管病会议制定的标准诊断。受试者平素均无血小板及淋巴细胞性免疫缺陷疾病，2周前未服用激素类药物。g+dr, 百拇医药
1.2 方法g+dr, 百拇医药
1.2.1 特殊试剂：①异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体Fas、Bcl-2(鼠抗人-FITC)及免疫阳性对照抗体(羊抗鼠IgG1-FITC)。②藻红蛋白(PE)APO2.7(鼠抗人-PE)、免疫阳性对照PE-IgG1、APO2.7。以上试剂均由法国国际免疫公司生产。淋巴细胞分离液由中国医学科学院血研所生产。g+dr, 百拇医药
1.2.2 血样本制备：①血小板制备：取2%EDTA抗凝血2ml，800r/min，离心5min，取富含血小板血浆、8%甲醛固定20min，离心1 500r/min、10min，PBS清洗1次，离心同上，弃上清液待用。②淋巴细胞制备：取肝素抗凝血2ml，重层于淋巴细胞分离液上，1 500r/min，离心15min，提取其中淋巴细胞层，再用PBS清洗2次，弃上清液，备用。③免疫反应：取5支试管，各加细胞悬液100μl，再分别加入单抗溶液20μl(Fas-FITC、Bcl-2-FITC、APO2.7-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE)，室温避光反应30min。④流式细胞仪检测；光源488nm的氢离子激光，上机前以标准微球调整仪器，使变异系数在2%以内，上机后收集1 000个细胞及血小板，测试完后Macintosh 650计算机上用Cell Quest Plot软件程序(美国BD公司产)分析数据，用HP 1200C/PS打印机打印结果。
2 结果qv0+(, 百拇医药
脑梗死组血小板膜Fas、APO2.7、bcl-2均显著高于健康对照组，两组差异显著，P<0.05～0.01；而淋巴细胞膜除bcl-2显著低于对照组外，余均高于健康对照组，这种降低和增高的水平具有显著统计学意义，P<0.001，见表1。qv0+(, 百拇医药
表1 两组血浆中血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2表达率(%)qv0+(, 百拇医药
Tab 1 Thrombocyte and Lymphocyte mamnbrane Fas、APO2.7、bcl-2 positive expression rate Groupsqv0+(, 百拇医药
Caseqv0+(, 百拇医药
Platlet Perameters(%)qv0+(, 百拇医药
Lymphocte perameters(%)qv0+(, 百拇医药
Fasqv0+(, 百拇医药
APO2.7qv0+(, 百拇医药
bcl-2qv0+(, 百拇医药
Fasqv0+(, 百拇医药
APO2.7qv0+(, 百拇医药
bcl-2qv0+(, 百拇医药
ACI Groupsqv0+(, 百拇医药
31qv0+(, 百拇医药
2.06±0.6*qv0+(, 百拇医药
2.16±1.7△qv0+(, 百拇医药
2.66±1.4qv0+(, 百拇医药
13.56±2.3△★qv0+(, 百拇医药
6.56±1.7△★qv0+(, 百拇医药
8.92±2.7★
Control Groupsl-fmhuy, 百拇医药
20l-fmhuy, 百拇医药
1.51±0.9l-fmhuy, 百拇医药
0.81±0.3l-fmhuy, 百拇医药
0.91±0.6l-fmhuy, 百拇医药
7.26±2.7 l-fmhuy, 百拇医药
3.14±1.2l-fmhuy, 百拇医药
37.13±4.6△l-fmhuy, 百拇医药
*P<0.05(Compared with control group)； ★P<0.05(Compared platelet with lymphocte)； △P<0.01l-fmhuy, 百拇医药
3 讨论l-fmhuy, 百拇医药
Fas的结构提示它属于肿瘤坏死因子(TNF)及神经生长因子(NGF)受体家族。Fas由多种细胞表达，但主要在淋巴细胞中表达[1]。Fas是一种细胞表面蛋白，被细胞毒单克隆抗体所辨认，是Fas配体的接收器，每当Fas配体与Fas结合时靶细胞即出现凋亡。Zhang[2]报告：细胞刚开始出现凋亡时7A6能被检测出来，证实7A6表达代表凋亡的早期阶段而不是细胞死亡的最后产物。Liao报道在脑炎病毒诱导的培养细胞凋亡中人类bcl-2有增强表达作用。本文研究脑梗死患者与健康人血浆中血小板膜Fas、APO2.7、bcl-2，目的是探讨两组阳性表达率之间的差异程度，进一步阐明血小板膜上述基因蛋白与脑梗死发病机制形成的关系。本文结果初步表明：脑梗死组血浆血小板膜Fas、APO2.7、bcl-2百分表达率分别以2.06、2.16、2.66高于健康对照组的1.51、0.81、0.91，差异非常显著，P<0.05～0.01。上述结果说明：脑梗死形成的急性期血小板膜Fas、APO2.7凋亡基因是增高的，而增高的上述两种基因可有改变血小板功能的调节作用，促使细胞凋亡，也可以说Fas、APO2.7增高间接或直接地参与了脑梗死的形成机制。目前已知bcl-2是对抗细胞凋亡基因，在有代偿能力的抗体中，bcl-2的增高水平更敏感，本文观测指标也证实此观点。因为bcl-2是抑制细胞凋亡基因，所以本文中血小板膜bcl-2的增高，具有两方面意义：1.bcl-2增高改变是标志着细胞凋亡存在。2.bcl-2水平越高脑梗死形成面积可能越大。
Nagata等人报道[3]Fas可以介导淋巴细胞死亡。研究发现：小鼠自发的Lpr与gld突变分别是FasL丧失功能的突变。Lpr与gld小鼠体内淋巴细胞的异常增多，提示Fas与Fasl可能参与了正常淋巴细胞的死亡。本文结果显示：患病组在血小板膜上Fas、APO2.7百分表达率均不如淋巴细胞膜表达率高，而Fas、APO2.7阳性表达率是对照组的2倍，但bcl-2阳性表达率低于对照组4倍，上述结果提示(1)Fas、APO2.7含量分布在淋巴细胞膜多于血小板。(2)Fas、APO2.7阳性表达率对淋巴细胞的功能有影响，并参与淋巴细胞凋亡。(3)机体正常情况下血小板膜对上述物质含量较少，病理突然升高，这种阳性表达率虽升高的不如淋巴细胞膜那样显著，但对脑梗死早期诊断确有实际临床价值，而淋巴细胞膜阳性表达率改变在无免疫系统疾病的情况下是否可以认为是与脑缺血后Fas、APO2.7促细胞凋亡基因影响了淋巴细胞免疫功能有关。因此可将Fas、APO2.7、bcl-2的表达率改变作为脑梗死超早期治疗的客观指标，以减少脑缺血半暗带内的神经元及其周围的各类胶质细胞的凋亡发生率，从而有利于脑神经功能的保护，降低致残率。s%y, http://www.100md.com
第一作者：男，49岁，本科，主任医师s%y, http://www.100md.com
参考文献s%y, http://www.100md.com
1 Christine M， Eischen Christopher J， Pick Paul J， et al. Tyrosine kinase activation provides an early and requistite signal for fas-Induced apoptosis. The Journay of Immunology， 1994， 153：1947s%y, http://www.100md.com
2 Zhang Chonghui， Zhao huiao， Aruna Seth， et al. A mitochondriaal membrane protein defined by a novel monocbnal antibody is preferen tially detected in apoptotic cells. The Journal of Immunology， 1996， 157：3980s%y, http://www.100md.com
3 Nagata Shigekazu， Golstein Pirre. Fas mediated death of lymphocytes. Science， 1995， 267(10)：1453s%y, http://www.100md.com
(1998-10-19收稿；1999-02-12修回)(薛慎伍 孙晓明 尹格平 李云峰 陈 青)