SLE T细胞功能的改变
作者：邬秀娣 孙凌云/, http://www.100md.com
单位：邬秀娣(南京大学医学院附属鼓楼医院免疫科，江苏 南京 210008)； 孙凌云(南京大学医学院附属鼓楼医院免疫科，江苏 南京 210008)/, http://www.100md.com
关键词：系统性红斑狼疮；E花环形成；淋转反应；细胞因子/, http://www.100md.com
免疫学杂志000115 摘 要：目的 探讨T细胞免疫功能改变与系统性红斑狼疮(SLE)的关系。方法 检测38例SLE患者淋巴细胞的E花环形成率(ERF-R)、PHA刺激的PBMC活化反应(PHA淋转反应)、治疗前后血清可溶性IL-2R(sIL-2R)、IL-6及尿sIL-2R、IL-6水平、抗ds-DNA抗体，用疾病活动性评分(SLAM)判断疾病活动性，并进行分析。结果 SLE患者腺苷处理前ERF-R显著低于正常(P<0.05)，处理后ERF-R则显著高于正常(P<0.001)；PBMC的PHA淋转反应较正常显著减弱(P<0.001)；血清sIL-2R和尿IL-6水平较正常显著升高(P<0.001，P<0.01)。治疗1月后抗ds-DNA抗体水平与SLAM评分显著下降(P<0.01，P<0.001)。相关分析表明腺苷处理前后的ERF-R之间显著相关(r＝0.605，P<0.001)；PHA淋转反应与腺苷处理前ERF-R相关(r＝0.355，P<0.05)；血清IL-6与尿IL-6有显著正相关(r＝0.788，P<0.01)；血清sIL-2R与SLAM评分相关(r＝0.379，P<0.05)。结论 SLE患者T细胞表面受体和细胞因子表达异常、体外抗原刺激反应减弱。/, http://www.100md.com
中图分类号：R593.24 文献标识码：A/, http://www.100md.com
Function changes of T cells in systemic lupus erythematosus/, http://www.100md.com
WU Xiu-di，SUN Ling-yun/, http://www.100md.com
(Immunology Department of the Affiliated， Gulou Hospital of Nanjing University Medical College， Nanjing 210008，China)/, http://www.100md.com
Abstract：Objective To study the correlation between T cells immuno-function changes and SLE .Methods 38 SLE patients were accepted to measure their Erythrocyte-Rosette-Forming Rate(ERF-R)of lymphocytes，activation response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC)to PHA，and their serum and urine levels of cytokines，while we evaluated the disease activity with SLE activity measurement(SLAM) criteria.Results IN SLE，the EFR-R of lymphocytes before being dealt with adenosine was significantly lower than the controls(P<0.05)，which was higher than the controls after being dealt with adenosine(P<0.001).The activation response of PBMC to PHA was weakened much more than the controls(P<0.001).The serum levels of soluble IL-2R(sIL-2R)and urine IL-6 were significantly higher in SLE patients than in controls 0.001，P<0.01 respectively).After one months treatment，both levels of anti-ds-DNA and SLAM cores decreased(P<0.01，P<0.001 respectively)，but urine sIL-2R rose(P<0.01).Both ERF-R of lymphocytes after being dealt with adenosine and the activation response of PMBC to PHA correlated with ERF-R of lymphocytes before being dealt with adenosine(r＝0.605，P<0.001；r＝0.355，P<0.05 respectively).The level of serum IL-6 correlated with that of urine IL-6.Conclusion There was much abnorma?ity in SLE T cells including expressions of membrane receptors and cytokines，and vitro activation response to antigen was weakened.
Key words：SLE；Erythrocyte-Rosette-Forming；lymphocyte change reaction；cytokine▲7j]](t, 百拇医药
系统性红斑狼疮(SLE)是一病因未明的自身免疫病，许多研究证实T淋巴细胞的免疫异常起着非常重要的作用。T细胞免疫功能的改变在很大程度上反映了SLE患者体内细胞免疫的活化状态。了解T细胞的功能，对探讨SLE的发病机制和判断病情活动与否及疗效、预后有很大的意义。我们检测了SLE患者T细胞腺苷处理前后的E玫瑰花环形成率(ERF-R)、PHA刺激的PBMC活化反应(简称PHA淋转反应)、血清中可溶性IL-2R(sIL-2R)、IL-6及尿中sIL-2R、IL-6的水平，旨在探讨这些因素与SLE的关系，从而进一步阐明SLE可能的发病机制，以指导临床治疗。7j]](t, 百拇医药
1 材料与方法7j]](t, 百拇医药
1.1 研究对象 所选病例为1997年9月至1998年4月间在南京市鼓楼医院免疫科住院治疗的SLE患者共38例，均符合1982年美国风湿病学会修订的诊断标准(其他病变及妊娠除外)，平均年龄34.03岁±10.87岁(15～62岁)，其中男性3例，女性35例。病情活动性判断：按Matthew的SLE疾病活动测定(SLAM)标准[1，2]评分。对照组：正常人21例，平均年龄31.14岁±9.87岁(20～56岁)，男性2例，女性19例，其中15例检测了血、尿细胞因子水平和抗ds-DNA抗体；与患者组年龄、性别相匹配。7j]](t, 百拇医药
1.2 主要试剂 RPMI-1640完全培养液(Sigma公司产品，加15%灭活小牛血清、肝素2.5u/ml、Hepes 6mg/ml)；MTT稀释液(Sigma公司产品，溶于PBS，4°C避光保存，不超过2周)；细胞因子ELISA试剂盒(购自上海森雄公司，美国进口分装)；抗ds-DNA抗体检测试剂盒(购自北方生物技术研究所)。7j]](t, 百拇医药
1.3 实验方法7j]](t, 百拇医药
1.3.1 密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)，用RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为1×107/ml。各取100μl细胞悬液于两只无菌培养瓶中，实验组再加100μl浓度为1mg/ml的PHA-M溶液(溶于RPMI-1640完全培养液中)，阴性对照组则加100μl RPMI 1640完全培养液；补充RPMI-1640完全培养液使每个培养瓶内液体总量达1.0ml。置37°C、5%CO2培养箱中培养72h。收集培养的PBMC，用MTT法及酶联免疫检测仪测定波长＝570nm时各孔的光密度(OD值)。取4复孔平均值即为实验所得OD值。
1.3.2 各取10μl PBMC悬液于小试管中，一管不用腺苷处理，另一管用0.5mmol/L的腺苷处理，然后均与1×108个/ml的新鲜绵羊红细胞悬液混合，分别测定其ERF-R，即为腺苷处理前后的ERF-R。{z'$(, http://www.100md.com
1.3.3 留取患者治疗前及治疗1月后的血清和晨尿各5ml，-20°C冰箱保存。血清sIL-2R、IL-6及尿sIL-2R、IL-6水平的检测均采用ELISA法，sIL-2R单位为pmol/L，其他细胞因子单位为ng/L。放免法检测抗ds-DNA抗体(正常结合率≤20%)。{z'$(, http://www.100md.com
1.3.4 实验结果以均数±标准差表示，ERF-R为百分率，PHA淋转反应值为OD值；用双侧t检验作显著性检验；直线回归分析判断两变量间的相关性。{z'$(, http://www.100md.com
2 结 果{z'$(, http://www.100md.com
2.1 SLE患者ERF-R及PHA淋转反应的改变 见表1。SLE患者淋巴细胞腺苷处理前的ERF-R较正常显著降低，腺苷处理后的ERF-R较正常显著升高；PBMC的PHA淋转反应显著低于正常。{z'$(, http://www.100md.com
表1 SLE患者与正常人ERF-R及淋转反应的比较{z'$(, http://www.100md.com
Tab1 Comparing the ERF-R and PBMC activation response of SLE with that of the controls{z'$(, http://www.100md.com
n{z'$(, http://www.100md.com
ERF-R{z'$(, http://www.100md.com
Activation response of PBMC{z'$(, http://www.100md.com
No adenosine{z'$(, http://www.100md.com
dealing{z'$(, http://www.100md.com
After adenosine{z'$(, http://www.100md.com
dealing{z'$(, http://www.100md.com
with PHA{z'$(, http://www.100md.com
no PHA{z'$(, http://www.100md.com
Controls\c7y]sy, 百拇医药
21\c7y]sy, 百拇医药
61.92±4.09\c7y]sy, 百拇医药
36.51±3.22\c7y]sy, 百拇医药
0.924±0.123\c7y]sy, 百拇医药
0.732±0.096\c7y]sy, 百拇医药
SLE\c7y]sy, 百拇医药
38\c7y]sy, 百拇医药
58.42±6.59\c7y]sy, 百拇医药
41.59±4.79\c7y]sy, 百拇医药
0.701±0.138\c7y]sy, 百拇医药
0.679±0.149\c7y]sy, 百拇医药
P\c7y]sy, 百拇医药
0.039\c7y]sy, 百拇医药
<0.001\c7y]sy, 百拇医药
<0.001\c7y]sy, 百拇医药
0.147\c7y]sy, 百拇医药
2.2 SLE患者血、尿中的细胞因子水平 如表2。SLE患者血sIL-2R及尿IL-6水平均显著高于正常，其他细胞因子与正常相比无显著差异。表2 SLE患者与正常人血、尿细胞因子水平的比较\c7y]sy, 百拇医药
Tab2 Compairing the serum and urine cytokines of SLE with the controls\c7y]sy, 百拇医药
sIL-2R\c7y]sy, 百拇医药
IL-6\c7y]sy, 百拇医药
Serum\c7y]sy, 百拇医药
Urine\c7y]sy, 百拇医药
Serum\c7y]sy, 百拇医药
Urine
Controls4tv^?+, http://www.100md.com
53.89±29.044tv^?+, http://www.100md.com
117.22±81.824tv^?+, http://www.100md.com
6.23±4.124tv^?+, http://www.100md.com
4.49±3.034tv^?+, http://www.100md.com
n4tv^?+, http://www.100md.com
154tv^?+, http://www.100md.com
134tv^?+, http://www.100md.com
154tv^?+, http://www.100md.com
134tv^?+, http://www.100md.com
SLE4tv^?+, http://www.100md.com
245.55±179.044tv^?+, http://www.100md.com
83.45±99.284tv^?+, http://www.100md.com
14.24±17.194tv^?+, http://www.100md.com
25.47±22.744tv^?+, http://www.100md.com
n4tv^?+, http://www.100md.com
374tv^?+, http://www.100md.com
154tv^?+, http://www.100md.com
324tv^?+, http://www.100md.com
144tv^?+, http://www.100md.com
P4tv^?+, http://www.100md.com
<0.0014tv^?+, http://www.100md.com
0.3394tv^?+, http://www.100md.com
0.0844tv^?+, http://www.100md.com
0.0034tv^?+, http://www.100md.com
2.3 SLE患者治疗前后血、尿细胞因子水平的变化 对住院治疗满1月的患者再测定其细胞因子水平，与治疗前作配对比较结果见表3。除尿sIL-2R治疗后显著高于治疗前水平外，其他细胞因子治疗前后都未出现明显改变。表3 SLE治疗前后血、尿细胞因子的变化4tv^?+, http://www.100md.com
Tab3 The change of serum and urine cytokines after treatment compairing to that of before treatment
sIL-2Ro, 百拇医药
IL-6o, 百拇医药
Serumo, 百拇医药
Urineo, 百拇医药
Serumo, 百拇医药
Urineo, 百拇医药
Beforeo, 百拇医药
treatmeno, 百拇医药
189.44±165.02o, 百拇医药
83.45±99.28o, 百拇医药
9.16±8.62o, 百拇医药
26.64±23.23o, 百拇医药
Aftero, 百拇医药
treatmento, 百拇医药
212.33±219.66o, 百拇医药
244.83±136.48o, 百拇医药
6.23±6.17o, 百拇医药
15.52±18.75o, 百拇医药
no, 百拇医药
17o, 百拇医药
15o, 百拇医药
10o, 百拇医药
13o, 百拇医药
Po, 百拇医药
0.741o, 百拇医药
0.002o, 百拇医药
0.397o, 百拇医药
0.209o, 百拇医药
2.4 SLE患者治疗前后其他指标的变化 见表4。治疗后SLE患者的SLAM评分及抗ds-DNA抗体水平均显著下降。表4 SLE治疗前后其他指标的变化
Tab4 The changes of SLAM scores and anti-dsDNA levels after treatment compairing to that of before treatment3efd, http://www.100md.com
SLAM score3efd, http://www.100md.com
Anti-dsDNA antibody(%)3efd, http://www.100md.com
Before treatment3efd, http://www.100md.com
18.39±6.933efd, http://www.100md.com
32.29±18.173efd, http://www.100md.com
After treatment3efd, http://www.100md.com
10.44±6.063efd, http://www.100md.com
20.99±13.113efd, http://www.100md.com
n3efd, http://www.100md.com
183efd, http://www.100md.com
173efd, http://www.100md.com
P3efd, http://www.100md.com
<0.0013efd, http://www.100md.com
0.0043efd, http://www.100md.com
2.5 相关性分析 SLE患者的ERF-R及PHA淋转反应与SLAM活动性评分均不相关；腺苷处理前后的ERF-R间有非常显著的相关性(r＝0.605，P<0.001)；PHA淋转反应与腺苷处理前的ERF-R显著相关(r＝0.355，P＝0.029)。3efd, http://www.100md.com
SLE患者细胞因子仅血清sIL-2R与SLAM评分有显著相关性(r＝0.379，P<0.05)，其他细胞因子与SLAM评分、抗ds-DNA抗体及24h尿蛋白都不相关。SLE患者血清IL-6水平与尿IL-6水平密切相关(r＝0.788，P＝0.001)，血清sIL-2R与尿sIL-2R水平则无相关性。3efd, http://www.100md.com
3 讨 论3efd, http://www.100md.com
我们发现SLE T细胞的腺苷处理前后ERF-R、PBMC的PHA淋转反应、sIL-2R、IL-6、IL-4细胞因子水平等均有改变。
有实验证明，人外周T细胞经腺苷处理后分为腺苷敏感细胞(AS细胞)和腺苷抵抗细胞(AR细胞)两个亚群：AS细胞的SRBC-R脱落，失去形成E花环的功能；AR细胞的SRBC-R不受影响。其中AS细胞与Ts细胞有关，因此经腺苷处理后的ERF-R不仅能反映AR细胞的SRBC-R表达，同时其与腺苷处理前ERF-R的差值亦反映了Ts细胞的比率。实际工作中，可用此法估计外周血T细胞中Ts细胞的比率。本实验结果发现SLE患者腺苷处理前ERF-R较正常下降，处理后ERF-R较正常升高，说明T细胞SRBC-R表达下降，同时AR细胞比率升高(即AS细胞比率下降)，证实了SLE患者外周血淋巴细胞中Ts细胞数量相对减少。此外，患者腺苷处理前后的ERF-R之间存在非常显著的正相关(r＝0.605，P<0.001)，说明AR细胞在T细胞中占多数，这也与SLE T细胞的亚群分布相符。1@:\9eh, http://www.100md.com
PHA淋转反应是用来检测T细胞免疫反应的常用指标。用MTT法检测淋巴细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶浓度，即可反映淋巴细胞的活化程度[3]。本研究揭示患者外周血淋巴细胞体外培养中对PHA的刺激反应明显减弱，表明SLE患者T细胞免疫功能有缺陷。患者PHA淋转反应减弱还与T细胞SRBC-R表达的下降存在正相关，推测T细胞表面多种受体表达异常，导致T细胞对抗原刺激的反应异常。但是，患者ERF-R和PHA淋转反应与SLAM评分间均无相关，因此两者对判断SLE病情活动其意义不大。1@:\9eh, http://www.100md.com
体内T淋巴细胞活化后产生大量的IL-2、IL-4、IL-6和IL-2R等，sIL-2R水平升高是T细胞活化的标志之一。本研究结果显示SLE患者血清sIL-2R水平显著高于正常，说明SLE患者T细胞高度活化。SLE血清sIL-2R水平的升高报道很多，但结合尿sIL-2R水平动态观察其治疗前后的变化却少见报告。我们发现治疗1月后患者血清sIL-2R水平与治疗前配对比较未见显著下降，而疾病活动性评分SLAM值下降非常显著(P<0.001)，表明血清sIL-2R的变化滞后于临床症状的改善。有趣的是治疗后尿sIL-2R的水平却显著高于治疗前(P＝0.002)。而有报道SLE病情缓解后血清sIL-2R水平下降[4]；肾病综合征缓解后血清和尿sIL-2R水平皆下降至正常[5]。本研究出现此结果的可能解释为：①治疗出现明显疗效需要一段时间，在这段时间里血清sIL-2R水平有一个累积过程，故在治疗1月后SLE病情尚未完全缓解的情况下，血清sIL-2R水平下降不明显；②尿sIL-2R治疗后水平升高可能是机体早期的一种代偿：一方面通过药物抑制T细胞表达释放sIL-2R，另一方面治疗后肾脏炎症减轻、肾功能改善后，对分子量较大的sIL-2R的排泄增加。推测在治疗后期随着病情的缓解，血清和尿sIL-2R水平将渐趋于正常。近年来血sIL-2R已被作为狼疮活动的指标[6]，我们认为尿sIL-2R水平的升高也许反映了狼疮病情开始缓解和肾功能出现改善，推测其可以作为预测病情变化和判断疗效的一个指标。SLE患者血清IL-6水平升高已见报道，但本研究未见类似结果，却发现SLE患者尿IL-6水平显著高于正常(P<0.01)，治疗对血、尿IL-6水平无明显影响。我们还发现血IL-6水平与尿IL-6水平显著相关(r＝0.788，P＝0.001)，两者与24h尿蛋白定量均无相关性，推测尿IL-6水平升高的可能原因为：①肾功能受损，小分子量的IL-6排泄增多；②狼疮性肾炎活动，肾脏局部细胞产生IL-6增多。因此，我们认为IL-6在SLE肾损害中可能有病理意义，尿IL-6水平的升高或许是狼疮性肾炎的另一个有意义的活动指标。
SLAM评分、抗ds-DNA抗体是SLE病情活动的敏感指标，本文研究结果也显示两者在治疗后均出现明显下降(P<0.001，P<0.01)。除血sIL-2R外，其余细胞因子水平与SLAM评分和抗ds-DNA抗体均无相关性，因此不宜用来评价SLE病情的活动性。血sIL-2R与SLAM评分有相关性(r＝0.379，P<0.05)，但其水平在治疗1月后无明显改变。也有人报道在一些活动性较轻的SLE中观察到血清sIL-2R的水平反而较严重SLE升高明显[7]。显然，用sIL-2R水平来预测狼疮缓解会得出相反的结论，对早期判断SLE病情缓解也不如SLAM评分和抗ds-DNA抗体意义大。)r58w4a, 百拇医药
SLE患者T细胞功能存在多种异常：Ts细胞数量减少；T细胞表面受体表达下降，导致对抗原刺激的免疫反应减弱；多种细胞因子分泌异常。血清sIL-2R与病情活动性相关，尿sIL-2R、IL-6升高可分别作为预测狼疮病情缓解和狼疮性肾炎活动的参考指标；血清细胞因子水平的下降滞后于SLAM评分和抗ds-DNA抗体的下降；T细胞的ERF-T和PBMC的PHA淋转反应能反映机体细胞免疫状态，而对评价SLE病情活动性意义不大；SLAM评分和抗ds-DNA抗体对早期判断SLE病情的缓解意义大于细胞因子。■)r58w4a, 百拇医药
基金项目：南京市科委资助课题(NO 94611))r58w4a, 百拇医药
作者简介：邬秀娣(1974-)，女，浙江宁波人，住院医师，硕士，主要从事免疫病的临床和基础研究。)r58w4a, 百拇医药
参考文献：)r58w4a, 百拇医药
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收稿日期：1999-03-24)r58w4a, 百拇医药
修回日期：1999-09-30(邬秀娣 孙凌云)
单位：邬秀娣(南京大学医学院附属鼓楼医院免疫科，江苏 南京 210008)； 孙凌云(南京大学医学院附属鼓楼医院免疫科，江苏 南京 210008)/, http://www.100md.com
关键词：系统性红斑狼疮；E花环形成；淋转反应；细胞因子/, http://www.100md.com
免疫学杂志000115 摘 要：目的 探讨T细胞免疫功能改变与系统性红斑狼疮(SLE)的关系。方法 检测38例SLE患者淋巴细胞的E花环形成率(ERF-R)、PHA刺激的PBMC活化反应(PHA淋转反应)、治疗前后血清可溶性IL-2R(sIL-2R)、IL-6及尿sIL-2R、IL-6水平、抗ds-DNA抗体，用疾病活动性评分(SLAM)判断疾病活动性，并进行分析。结果 SLE患者腺苷处理前ERF-R显著低于正常(P<0.05)，处理后ERF-R则显著高于正常(P<0.001)；PBMC的PHA淋转反应较正常显著减弱(P<0.001)；血清sIL-2R和尿IL-6水平较正常显著升高(P<0.001，P<0.01)。治疗1月后抗ds-DNA抗体水平与SLAM评分显著下降(P<0.01，P<0.001)。相关分析表明腺苷处理前后的ERF-R之间显著相关(r＝0.605，P<0.001)；PHA淋转反应与腺苷处理前ERF-R相关(r＝0.355，P<0.05)；血清IL-6与尿IL-6有显著正相关(r＝0.788，P<0.01)；血清sIL-2R与SLAM评分相关(r＝0.379，P<0.05)。结论 SLE患者T细胞表面受体和细胞因子表达异常、体外抗原刺激反应减弱。/, http://www.100md.com
中图分类号：R593.24 文献标识码：A/, http://www.100md.com
Function changes of T cells in systemic lupus erythematosus/, http://www.100md.com
WU Xiu-di，SUN Ling-yun/, http://www.100md.com
(Immunology Department of the Affiliated， Gulou Hospital of Nanjing University Medical College， Nanjing 210008，China)/, http://www.100md.com
Abstract：Objective To study the correlation between T cells immuno-function changes and SLE .Methods 38 SLE patients were accepted to measure their Erythrocyte-Rosette-Forming Rate(ERF-R)of lymphocytes，activation response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC)to PHA，and their serum and urine levels of cytokines，while we evaluated the disease activity with SLE activity measurement(SLAM) criteria.Results IN SLE，the EFR-R of lymphocytes before being dealt with adenosine was significantly lower than the controls(P<0.05)，which was higher than the controls after being dealt with adenosine(P<0.001).The activation response of PBMC to PHA was weakened much more than the controls(P<0.001).The serum levels of soluble IL-2R(sIL-2R)and urine IL-6 were significantly higher in SLE patients than in controls 0.001，P<0.01 respectively).After one months treatment，both levels of anti-ds-DNA and SLAM cores decreased(P<0.01，P<0.001 respectively)，but urine sIL-2R rose(P<0.01).Both ERF-R of lymphocytes after being dealt with adenosine and the activation response of PMBC to PHA correlated with ERF-R of lymphocytes before being dealt with adenosine(r＝0.605，P<0.001；r＝0.355，P<0.05 respectively).The level of serum IL-6 correlated with that of urine IL-6.Conclusion There was much abnorma?ity in SLE T cells including expressions of membrane receptors and cytokines，and vitro activation response to antigen was weakened.
Key words：SLE；Erythrocyte-Rosette-Forming；lymphocyte change reaction；cytokine▲7j]](t, 百拇医药
系统性红斑狼疮(SLE)是一病因未明的自身免疫病，许多研究证实T淋巴细胞的免疫异常起着非常重要的作用。T细胞免疫功能的改变在很大程度上反映了SLE患者体内细胞免疫的活化状态。了解T细胞的功能，对探讨SLE的发病机制和判断病情活动与否及疗效、预后有很大的意义。我们检测了SLE患者T细胞腺苷处理前后的E玫瑰花环形成率(ERF-R)、PHA刺激的PBMC活化反应(简称PHA淋转反应)、血清中可溶性IL-2R(sIL-2R)、IL-6及尿中sIL-2R、IL-6的水平，旨在探讨这些因素与SLE的关系，从而进一步阐明SLE可能的发病机制，以指导临床治疗。7j]](t, 百拇医药
1 材料与方法7j]](t, 百拇医药
1.1 研究对象 所选病例为1997年9月至1998年4月间在南京市鼓楼医院免疫科住院治疗的SLE患者共38例，均符合1982年美国风湿病学会修订的诊断标准(其他病变及妊娠除外)，平均年龄34.03岁±10.87岁(15～62岁)，其中男性3例，女性35例。病情活动性判断：按Matthew的SLE疾病活动测定(SLAM)标准[1，2]评分。对照组：正常人21例，平均年龄31.14岁±9.87岁(20～56岁)，男性2例，女性19例，其中15例检测了血、尿细胞因子水平和抗ds-DNA抗体；与患者组年龄、性别相匹配。7j]](t, 百拇医药
1.2 主要试剂 RPMI-1640完全培养液(Sigma公司产品，加15%灭活小牛血清、肝素2.5u/ml、Hepes 6mg/ml)；MTT稀释液(Sigma公司产品，溶于PBS，4°C避光保存，不超过2周)；细胞因子ELISA试剂盒(购自上海森雄公司，美国进口分装)；抗ds-DNA抗体检测试剂盒(购自北方生物技术研究所)。7j]](t, 百拇医药
1.3 实验方法7j]](t, 百拇医药
1.3.1 密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)，用RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为1×107/ml。各取100μl细胞悬液于两只无菌培养瓶中，实验组再加100μl浓度为1mg/ml的PHA-M溶液(溶于RPMI-1640完全培养液中)，阴性对照组则加100μl RPMI 1640完全培养液；补充RPMI-1640完全培养液使每个培养瓶内液体总量达1.0ml。置37°C、5%CO2培养箱中培养72h。收集培养的PBMC，用MTT法及酶联免疫检测仪测定波长＝570nm时各孔的光密度(OD值)。取4复孔平均值即为实验所得OD值。
1.3.2 各取10μl PBMC悬液于小试管中，一管不用腺苷处理，另一管用0.5mmol/L的腺苷处理，然后均与1×108个/ml的新鲜绵羊红细胞悬液混合，分别测定其ERF-R，即为腺苷处理前后的ERF-R。{z'$(, http://www.100md.com
1.3.3 留取患者治疗前及治疗1月后的血清和晨尿各5ml，-20°C冰箱保存。血清sIL-2R、IL-6及尿sIL-2R、IL-6水平的检测均采用ELISA法，sIL-2R单位为pmol/L，其他细胞因子单位为ng/L。放免法检测抗ds-DNA抗体(正常结合率≤20%)。{z'$(, http://www.100md.com
1.3.4 实验结果以均数±标准差表示，ERF-R为百分率，PHA淋转反应值为OD值；用双侧t检验作显著性检验；直线回归分析判断两变量间的相关性。{z'$(, http://www.100md.com
2 结 果{z'$(, http://www.100md.com
2.1 SLE患者ERF-R及PHA淋转反应的改变 见表1。SLE患者淋巴细胞腺苷处理前的ERF-R较正常显著降低，腺苷处理后的ERF-R较正常显著升高；PBMC的PHA淋转反应显著低于正常。{z'$(, http://www.100md.com
表1 SLE患者与正常人ERF-R及淋转反应的比较{z'$(, http://www.100md.com
Tab1 Comparing the ERF-R and PBMC activation response of SLE with that of the controls{z'$(, http://www.100md.com
n{z'$(, http://www.100md.com
ERF-R{z'$(, http://www.100md.com
Activation response of PBMC{z'$(, http://www.100md.com
No adenosine{z'$(, http://www.100md.com
dealing{z'$(, http://www.100md.com
After adenosine{z'$(, http://www.100md.com
dealing{z'$(, http://www.100md.com
with PHA{z'$(, http://www.100md.com
no PHA{z'$(, http://www.100md.com
Controls\c7y]sy, 百拇医药
21\c7y]sy, 百拇医药
61.92±4.09\c7y]sy, 百拇医药
36.51±3.22\c7y]sy, 百拇医药
0.924±0.123\c7y]sy, 百拇医药
0.732±0.096\c7y]sy, 百拇医药
SLE\c7y]sy, 百拇医药
38\c7y]sy, 百拇医药
58.42±6.59\c7y]sy, 百拇医药
41.59±4.79\c7y]sy, 百拇医药
0.701±0.138\c7y]sy, 百拇医药
0.679±0.149\c7y]sy, 百拇医药
P\c7y]sy, 百拇医药
0.039\c7y]sy, 百拇医药
<0.001\c7y]sy, 百拇医药
<0.001\c7y]sy, 百拇医药
0.147\c7y]sy, 百拇医药
2.2 SLE患者血、尿中的细胞因子水平 如表2。SLE患者血sIL-2R及尿IL-6水平均显著高于正常，其他细胞因子与正常相比无显著差异。表2 SLE患者与正常人血、尿细胞因子水平的比较\c7y]sy, 百拇医药
Tab2 Compairing the serum and urine cytokines of SLE with the controls\c7y]sy, 百拇医药
sIL-2R\c7y]sy, 百拇医药
IL-6\c7y]sy, 百拇医药
Serum\c7y]sy, 百拇医药
Urine\c7y]sy, 百拇医药
Serum\c7y]sy, 百拇医药
Urine
Controls4tv^?+, http://www.100md.com
53.89±29.044tv^?+, http://www.100md.com
117.22±81.824tv^?+, http://www.100md.com
6.23±4.124tv^?+, http://www.100md.com
4.49±3.034tv^?+, http://www.100md.com
n4tv^?+, http://www.100md.com
154tv^?+, http://www.100md.com
134tv^?+, http://www.100md.com
154tv^?+, http://www.100md.com
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SLE4tv^?+, http://www.100md.com
245.55±179.044tv^?+, http://www.100md.com
83.45±99.284tv^?+, http://www.100md.com
14.24±17.194tv^?+, http://www.100md.com
25.47±22.744tv^?+, http://www.100md.com
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P4tv^?+, http://www.100md.com
<0.0014tv^?+, http://www.100md.com
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0.0844tv^?+, http://www.100md.com
0.0034tv^?+, http://www.100md.com
2.3 SLE患者治疗前后血、尿细胞因子水平的变化 对住院治疗满1月的患者再测定其细胞因子水平，与治疗前作配对比较结果见表3。除尿sIL-2R治疗后显著高于治疗前水平外，其他细胞因子治疗前后都未出现明显改变。表3 SLE治疗前后血、尿细胞因子的变化4tv^?+, http://www.100md.com
Tab3 The change of serum and urine cytokines after treatment compairing to that of before treatment
sIL-2Ro, 百拇医药
IL-6o, 百拇医药
Serumo, 百拇医药
Urineo, 百拇医药
Serumo, 百拇医药
Urineo, 百拇医药
Beforeo, 百拇医药
treatmeno, 百拇医药
189.44±165.02o, 百拇医药
83.45±99.28o, 百拇医药
9.16±8.62o, 百拇医药
26.64±23.23o, 百拇医药
Aftero, 百拇医药
treatmento, 百拇医药
212.33±219.66o, 百拇医药
244.83±136.48o, 百拇医药
6.23±6.17o, 百拇医药
15.52±18.75o, 百拇医药
no, 百拇医药
17o, 百拇医药
15o, 百拇医药
10o, 百拇医药
13o, 百拇医药
Po, 百拇医药
0.741o, 百拇医药
0.002o, 百拇医药
0.397o, 百拇医药
0.209o, 百拇医药
2.4 SLE患者治疗前后其他指标的变化 见表4。治疗后SLE患者的SLAM评分及抗ds-DNA抗体水平均显著下降。表4 SLE治疗前后其他指标的变化
Tab4 The changes of SLAM scores and anti-dsDNA levels after treatment compairing to that of before treatment3efd, http://www.100md.com
SLAM score3efd, http://www.100md.com
Anti-dsDNA antibody(%)3efd, http://www.100md.com
Before treatment3efd, http://www.100md.com
18.39±6.933efd, http://www.100md.com
32.29±18.173efd, http://www.100md.com
After treatment3efd, http://www.100md.com
10.44±6.063efd, http://www.100md.com
20.99±13.113efd, http://www.100md.com
n3efd, http://www.100md.com
183efd, http://www.100md.com
173efd, http://www.100md.com
P3efd, http://www.100md.com
<0.0013efd, http://www.100md.com
0.0043efd, http://www.100md.com
2.5 相关性分析 SLE患者的ERF-R及PHA淋转反应与SLAM活动性评分均不相关；腺苷处理前后的ERF-R间有非常显著的相关性(r＝0.605，P<0.001)；PHA淋转反应与腺苷处理前的ERF-R显著相关(r＝0.355，P＝0.029)。3efd, http://www.100md.com
SLE患者细胞因子仅血清sIL-2R与SLAM评分有显著相关性(r＝0.379，P<0.05)，其他细胞因子与SLAM评分、抗ds-DNA抗体及24h尿蛋白都不相关。SLE患者血清IL-6水平与尿IL-6水平密切相关(r＝0.788，P＝0.001)，血清sIL-2R与尿sIL-2R水平则无相关性。3efd, http://www.100md.com
3 讨 论3efd, http://www.100md.com
我们发现SLE T细胞的腺苷处理前后ERF-R、PBMC的PHA淋转反应、sIL-2R、IL-6、IL-4细胞因子水平等均有改变。
有实验证明，人外周T细胞经腺苷处理后分为腺苷敏感细胞(AS细胞)和腺苷抵抗细胞(AR细胞)两个亚群：AS细胞的SRBC-R脱落，失去形成E花环的功能；AR细胞的SRBC-R不受影响。其中AS细胞与Ts细胞有关，因此经腺苷处理后的ERF-R不仅能反映AR细胞的SRBC-R表达，同时其与腺苷处理前ERF-R的差值亦反映了Ts细胞的比率。实际工作中，可用此法估计外周血T细胞中Ts细胞的比率。本实验结果发现SLE患者腺苷处理前ERF-R较正常下降，处理后ERF-R较正常升高，说明T细胞SRBC-R表达下降，同时AR细胞比率升高(即AS细胞比率下降)，证实了SLE患者外周血淋巴细胞中Ts细胞数量相对减少。此外，患者腺苷处理前后的ERF-R之间存在非常显著的正相关(r＝0.605，P<0.001)，说明AR细胞在T细胞中占多数，这也与SLE T细胞的亚群分布相符。1@:\9eh, http://www.100md.com
PHA淋转反应是用来检测T细胞免疫反应的常用指标。用MTT法检测淋巴细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶浓度，即可反映淋巴细胞的活化程度[3]。本研究揭示患者外周血淋巴细胞体外培养中对PHA的刺激反应明显减弱，表明SLE患者T细胞免疫功能有缺陷。患者PHA淋转反应减弱还与T细胞SRBC-R表达的下降存在正相关，推测T细胞表面多种受体表达异常，导致T细胞对抗原刺激的反应异常。但是，患者ERF-R和PHA淋转反应与SLAM评分间均无相关，因此两者对判断SLE病情活动其意义不大。1@:\9eh, http://www.100md.com
体内T淋巴细胞活化后产生大量的IL-2、IL-4、IL-6和IL-2R等，sIL-2R水平升高是T细胞活化的标志之一。本研究结果显示SLE患者血清sIL-2R水平显著高于正常，说明SLE患者T细胞高度活化。SLE血清sIL-2R水平的升高报道很多，但结合尿sIL-2R水平动态观察其治疗前后的变化却少见报告。我们发现治疗1月后患者血清sIL-2R水平与治疗前配对比较未见显著下降，而疾病活动性评分SLAM值下降非常显著(P<0.001)，表明血清sIL-2R的变化滞后于临床症状的改善。有趣的是治疗后尿sIL-2R的水平却显著高于治疗前(P＝0.002)。而有报道SLE病情缓解后血清sIL-2R水平下降[4]；肾病综合征缓解后血清和尿sIL-2R水平皆下降至正常[5]。本研究出现此结果的可能解释为：①治疗出现明显疗效需要一段时间，在这段时间里血清sIL-2R水平有一个累积过程，故在治疗1月后SLE病情尚未完全缓解的情况下，血清sIL-2R水平下降不明显；②尿sIL-2R治疗后水平升高可能是机体早期的一种代偿：一方面通过药物抑制T细胞表达释放sIL-2R，另一方面治疗后肾脏炎症减轻、肾功能改善后，对分子量较大的sIL-2R的排泄增加。推测在治疗后期随着病情的缓解，血清和尿sIL-2R水平将渐趋于正常。近年来血sIL-2R已被作为狼疮活动的指标[6]，我们认为尿sIL-2R水平的升高也许反映了狼疮病情开始缓解和肾功能出现改善，推测其可以作为预测病情变化和判断疗效的一个指标。SLE患者血清IL-6水平升高已见报道，但本研究未见类似结果，却发现SLE患者尿IL-6水平显著高于正常(P<0.01)，治疗对血、尿IL-6水平无明显影响。我们还发现血IL-6水平与尿IL-6水平显著相关(r＝0.788，P＝0.001)，两者与24h尿蛋白定量均无相关性，推测尿IL-6水平升高的可能原因为：①肾功能受损，小分子量的IL-6排泄增多；②狼疮性肾炎活动，肾脏局部细胞产生IL-6增多。因此，我们认为IL-6在SLE肾损害中可能有病理意义，尿IL-6水平的升高或许是狼疮性肾炎的另一个有意义的活动指标。
SLAM评分、抗ds-DNA抗体是SLE病情活动的敏感指标，本文研究结果也显示两者在治疗后均出现明显下降(P<0.001，P<0.01)。除血sIL-2R外，其余细胞因子水平与SLAM评分和抗ds-DNA抗体均无相关性，因此不宜用来评价SLE病情的活动性。血sIL-2R与SLAM评分有相关性(r＝0.379，P<0.05)，但其水平在治疗1月后无明显改变。也有人报道在一些活动性较轻的SLE中观察到血清sIL-2R的水平反而较严重SLE升高明显[7]。显然，用sIL-2R水平来预测狼疮缓解会得出相反的结论，对早期判断SLE病情缓解也不如SLAM评分和抗ds-DNA抗体意义大。)r58w4a, 百拇医药
SLE患者T细胞功能存在多种异常：Ts细胞数量减少；T细胞表面受体表达下降，导致对抗原刺激的免疫反应减弱；多种细胞因子分泌异常。血清sIL-2R与病情活动性相关，尿sIL-2R、IL-6升高可分别作为预测狼疮病情缓解和狼疮性肾炎活动的参考指标；血清细胞因子水平的下降滞后于SLAM评分和抗ds-DNA抗体的下降；T细胞的ERF-T和PBMC的PHA淋转反应能反映机体细胞免疫状态，而对评价SLE病情活动性意义不大；SLAM评分和抗ds-DNA抗体对早期判断SLE病情的缓解意义大于细胞因子。■)r58w4a, 百拇医药
基金项目：南京市科委资助课题(NO 94611))r58w4a, 百拇医药
作者简介：邬秀娣(1974-)，女，浙江宁波人，住院医师，硕士，主要从事免疫病的临床和基础研究。)r58w4a, 百拇医药
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收稿日期：1999-03-24)r58w4a, 百拇医药
修回日期：1999-09-30(邬秀娣 孙凌云)