人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达
作者：刘永全 高杰英 彭虹 罗振革 梅俊杰1p, http://www.100md.com
单位：刘永全(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；高杰英(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；彭虹(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；罗振革(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；梅俊杰(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)1p, http://www.100md.com
关键词：整合素；α4亚基；RT-PCR；cDNA克隆1p, http://www.100md.com
免疫学杂志000306 [摘要]目的 克隆并原核表达α4亚基片段。方法 从IL-60细胞系中提取总RNA，以RT-PCR方法分两段扩增人整合素分子α4亚基片段2.0kb cDNA，将两片段连接，并将其中的1.7kb基因片段亚克隆至表达载体PGEX-KG中，IPTG诱导表达。结果 RT-PCR扩增并克隆了α4的两段cDNA，序列分析表明：与文献报道的α4 cDNA序列基本一致。两片段成功连接后，将其中的1.7kb亚克隆至表达载体PGEX-KG中，经诱导在大肠杆菌中得到高效表达。结论 获得了α4亚基2.0kbcDNA片段，及其中1.7kb的原核表达产物对于研究α4整合素的功能有重要意义。1p, http://www.100md.com
[中图分类号]R392.11 [文献标识码]A1p, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0182-041p, http://www.100md.com
Cloning of the fragment of α4 subunit of human integrin and it’s expression from E.coli1p, http://www.100md.com
LIU Yong-quan，GAO Jie-ying，PENG Hong，LUO Zheng-ge，MEI Jun-jie1p, http://www.100md.com
(Department of Immunology，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China)1p, http://www.100md.com
[Abstract]Objective To clone and express the fragment of α4 subunit.Methods The 2.0kb cNDA of human integrin α4 subunit fragment was amplified from HL-60 total RNA by RT-PCR as two seperate segments，after the two segments were linked together，1.7kb of it was subcloned into expression vector PGEX-KG and induced by IPTG.Resulst The sequence of our cDNA is identical with the reported α4 cDNA.Then the two segments were linked together，and 1.7kb of it was subcloned into expression vector PGEX-KG.The α4 fragment was overexpressed by E.coli after inducing with IPTG.Conclusion The 2.0kb cDNA fragment of α4 subunit.was obtained，and 1.7kb of it was overexpressed by E.coil，it’s very important to study the function of α4 integrins.
[Key words]Integrin；α4 subunit；RT-PCR；cDNA cloningvaa, 百拇医药
整合素是由α和β亚基通过非共价连接而形成的一类异二聚体，目前已发现20多种。其中α4整合素有α4β1和α4β7两种。前者主要介导淋巴细胞向炎症部位的迁移和聚集，从而在多种病理反应如实验诱导性脑脊髓炎、变态反应性哮喘等多种疾病中发挥重要作用。后者主要介导淋巴细胞向粘膜部位的迁移和归巢，并对该部位的免疫应答起关键作用[1]。抗α4的多种单克隆抗体可有效阻断α4整合素介导的多种反应，这些单抗所对应的抗原表位主要集中在α4 N端1-500氨基酸残基区域[2]。α4的cDNA长达3.1kb，本文用RT-PCR方法分两段扩增了其中不带信号肽的2.0kb，并将其中的1.7kb克隆入表达载体PGEX-KG，在大肠杆菌中得到高效表达。由于表达产物完全包括了α4 N端500个氨基酸残基，因此应当包含α4的主要抗原表位。vaa, 百拇医药
1 材料与方法vaa, 百拇医药
1.1 主要材料 HL-60细胞由何福初教授惠赠；M-MLV反转录酶、PGEM-T载体购自Promega公司；Taq DNA多聚酶、限制性内切酶EcoRI、HindⅢ、PstI、XbaI、XhoI、异硫氰酸胍购自华美公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；焦磷酸二乙酯(DEPC)为Sigma公司产品。vaa, 百拇医药
1.2 总RAN提取 异硫氰酸胍一步法提取总RNA[3]。vaa, 百拇医药
1.3 引物设计与合成 根据文献报道的人整合素分子α4亚基cDNA序列[4]，设计并合成四条引物，分两段(830bp、1200bp)扩增无信号肽的α4 2.0kb cDNA片段。在引物5’端引入酶切位点XbaI、HindⅢ、PstI使扩增片段易于克隆，其中的HindⅢ是扩增片段内的酶切位点，以方便A、B两段的连接(见图1)。
vaa, 百拇医药
图1α4片段cDNA的克隆vaa, 百拇医药
Fig 1Cloning of α4 fragment cDNAvaa, 百拇医药
P1＝GCT CTA GAC TAC AAC GTG GAC ACT GAG A
P2＝GTA CGA TCC AAG CTT TTT ACC TTT C@;, http://www.100md.com
P3＝GGT AAA AAG CTT GGA TCG TAC@;, http://www.100md.com
P4＝GCC AAT ACT GCA GTC AAG TTG TAC@;, http://www.100md.com
1.4 RT-PCR、片段克隆及序列分析 以提取的总RNA为模板，以oligodT为下游引物，参照M-MLV反转录酶产品说明进行反转录。以反转录产物为模板，分别以P1、P2；P3、P4为引物扩增A、B段(见图1)。PCR条件为：94°C变性30s，56°C退火1min，72°C延伸1min，共30个循环，最后72°C延伸10min。然后回收PCR产物，将A段按照产品说明书连入PGEM-T载体；B段经HindⅢ/PstI酶切连入经同样处理的pBSM13载体。由赛百胜公司分别对两段进行序列分析。@;, http://www.100md.com
1.5 A、B段的拼接及表达载体构建 为便于片段连接先将B段通过XhoI/BamHI酶切由pBS M13-B亚克隆至PGEM-7Z，再用XbaI/HindⅢ切点连入A段，而完成A、B段的拼接。然后用XbaI/EcoRI切下其中的1.7kb亚克隆入pBS M13，再用XbaI/XhoI切点将该片段连入PGEX-KG，而完成表达载体KG-1.7α4的构建(见图2)。
@;, http://www.100md.com
图2 重组表达质粒KG-A+B的构建@;, http://www.100md.com
Fig2 The constructed recombinant expression plasmid KG-A+B@;, http://www.100md.com
1.6 大肠杆菌重组蛋白的诱导表达 挑取单菌落，在5ml LB培养基(含100mg/L氨苄西林)中37°C过夜培养，按1%比例接种到200ml LB(amp+)中，37°C振荡培养至OD600～1.0加IPTG至终浓度1.0mmol/L，同样条件培养4h。@;, http://www.100md.com
1.7 包涵体的分离 参见文献[5]。@;, http://www.100md.com
2 结果@;, http://www.100md.com
2.1 RT-PCR获取A、B片段及序列分析 以HL-60总RNA为模板，用两对引物分别扩增A、B段，回收目的片段并分别克隆进PGEM-T和pBS M13载体，并分别筛选出PGEM-T—A和pBS M13-B的阳性克隆(见图2)。测序发现：A段的两个克隆分别出现一处突变，将它们拼接则可消除突变；B段只有一处同义突变(ACA→ACG：Thr)。由A、B段的测序结果可得到α4片段2.0kb cDNA序列及由此导出的氨基酸序列(见图3)。
图3 α4 2.0kb cDNA片段序列及由此导出的氨基酸序列\, 百拇医药
Fig3 DNA and deduced amino acid sequences of the 2.0kb cDNA fragment of α4 underlined are mutation codon.\, 百拇医药
2.2 表达载体构建及重组蛋白表达 表达载体构建(见图2)，先将A、B段拼接在一起，并经酶切鉴定正确(见图4)。然后将其中的1.7kb克隆入PGEX-KG而完成表达载体KG-1.7α4的构建。将阳性克隆过夜活化，并接种200ml LB(amp+)肉汤，培养至OD600～1.0加IPTG至终浓度1.0mmol/L，继续培养4h。菌体经SDS-PAGE分析在94kD左右出现一条明亮的表达带，与理论计算的分子量相符，经扫描分析，表达量占菌体蛋白的18%。将菌体超声破碎，分别取上清及8mol尿素溶解上清行SDS-PAGE分析，发现表达产物主要以包涵体形式存在(见图5)。
\, 百拇医药
图4 重组质粒7Z-A+B的鉴定\, 百拇医药
Fig4 Identification of the recombinant plasmid 7Z-A+B\, 百拇医药
1：λDNA/EcoRI+HindⅢ marker；2：7Z-A+B/XbaI+PstI；3：7Z-A+B/XbaI+HindⅢ；4：7Z-A+B
\, 百拇医药
图5 SDS-PAGE分析重组蛋白表达\, 百拇医药
Fig 5SDS-PAGE analysis of recombinant protein\, 百拇医药
1：protein marker；2：E.coli JM109；3：E.coli Jm109\, 百拇医药
(KG-1.7α4)；4：supernatant；5：8M urea soluble product\, 百拇医药
3 讨论
当利用RT-PCR扩增较长的片段时，分段进行扩增是较好的选择。它不仅可提高扩增的效率，减少实验失败的风险，而且由于片段较短而更方便序列分析。当序列出现突变时，也更容易利用片段的拼接或其它手段去除突变。本文即利用这一技术获得了α4片段2.0kb cDNA，并将其中的1.7kb克隆入表达载体，在大肠杆菌中得到了高效表达。实验中也曾试图表达2.0kb cDNA编码的片段，但未获成功。结合作者其它的实验结果，可以认为较长的外源片段在大肠杆菌中表达会更加困难。由于α4的抗原表位主要集中在N端1-500氨基酸残基区域，因此得到的表达产物应当包含α4的主要抗原表位。抗α4的多种单克隆抗体可有效阻断α4整合素的多种功能，因此α4片段在大肠杆菌的成功表达为α4抗体的研制和α4整合素功能的研究奠定了重要基础。81, 百拇医药
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39789010)81, 百拇医药
[作者简介]刘永全(1971-)，男，河南淮阳县人，博士，主要从事抗感染免疫的研究。81, 百拇医药
[参考文献]81, 百拇医药
[1]刘永全，高杰英.α4整合素及其配体的分子结构和功能[J].国外医学分子生物学分册，1997，19：204～208.81, 百拇医药
[2]SCHIFFER SG，HEMLER ME，LOBB RR，et al.Molecular mapping of functional antibody binding sites of α4 integrin[J].J Biol Chem，1995，270(24)：14270～14273.81, 百拇医药
[3]CHOMCZYNSKI P，SACCHI N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem，1987，162：156～159.81, 百拇医药
[4]TAKADA Y，ELICES MJ，CROUSE C，et al.The primary structure of the α4 subunit of VLA-4：homo-logy to other integrins and a possible cell-cell adhesion function[J].EMBO J，1989，8：1361～1368.81, 百拇医药
[5]SAMBROOK J，FRITSCH EF，MANIATIS T，et al.Molecular cloning：A laboratory manual[M].In：2nd ed.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，845～849.81, 百拇医药
[收稿日期]1999-06-22；[修回日期]2000-01-17(刘永全 高杰英 彭虹 罗振革 梅俊杰)
单位：刘永全(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；高杰英(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；彭虹(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；罗振革(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)；梅俊杰(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850)1p, http://www.100md.com
关键词：整合素；α4亚基；RT-PCR；cDNA克隆1p, http://www.100md.com
免疫学杂志000306 [摘要]目的 克隆并原核表达α4亚基片段。方法 从IL-60细胞系中提取总RNA，以RT-PCR方法分两段扩增人整合素分子α4亚基片段2.0kb cDNA，将两片段连接，并将其中的1.7kb基因片段亚克隆至表达载体PGEX-KG中，IPTG诱导表达。结果 RT-PCR扩增并克隆了α4的两段cDNA，序列分析表明：与文献报道的α4 cDNA序列基本一致。两片段成功连接后，将其中的1.7kb亚克隆至表达载体PGEX-KG中，经诱导在大肠杆菌中得到高效表达。结论 获得了α4亚基2.0kbcDNA片段，及其中1.7kb的原核表达产物对于研究α4整合素的功能有重要意义。1p, http://www.100md.com
[中图分类号]R392.11 [文献标识码]A1p, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0182-041p, http://www.100md.com
Cloning of the fragment of α4 subunit of human integrin and it’s expression from E.coli1p, http://www.100md.com
LIU Yong-quan，GAO Jie-ying，PENG Hong，LUO Zheng-ge，MEI Jun-jie1p, http://www.100md.com
(Department of Immunology，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China)1p, http://www.100md.com
[Abstract]Objective To clone and express the fragment of α4 subunit.Methods The 2.0kb cNDA of human integrin α4 subunit fragment was amplified from HL-60 total RNA by RT-PCR as two seperate segments，after the two segments were linked together，1.7kb of it was subcloned into expression vector PGEX-KG and induced by IPTG.Resulst The sequence of our cDNA is identical with the reported α4 cDNA.Then the two segments were linked together，and 1.7kb of it was subcloned into expression vector PGEX-KG.The α4 fragment was overexpressed by E.coli after inducing with IPTG.Conclusion The 2.0kb cDNA fragment of α4 subunit.was obtained，and 1.7kb of it was overexpressed by E.coil，it’s very important to study the function of α4 integrins.
[Key words]Integrin；α4 subunit；RT-PCR；cDNA cloningvaa, 百拇医药
整合素是由α和β亚基通过非共价连接而形成的一类异二聚体，目前已发现20多种。其中α4整合素有α4β1和α4β7两种。前者主要介导淋巴细胞向炎症部位的迁移和聚集，从而在多种病理反应如实验诱导性脑脊髓炎、变态反应性哮喘等多种疾病中发挥重要作用。后者主要介导淋巴细胞向粘膜部位的迁移和归巢，并对该部位的免疫应答起关键作用[1]。抗α4的多种单克隆抗体可有效阻断α4整合素介导的多种反应，这些单抗所对应的抗原表位主要集中在α4 N端1-500氨基酸残基区域[2]。α4的cDNA长达3.1kb，本文用RT-PCR方法分两段扩增了其中不带信号肽的2.0kb，并将其中的1.7kb克隆入表达载体PGEX-KG，在大肠杆菌中得到高效表达。由于表达产物完全包括了α4 N端500个氨基酸残基，因此应当包含α4的主要抗原表位。vaa, 百拇医药
1 材料与方法vaa, 百拇医药
1.1 主要材料 HL-60细胞由何福初教授惠赠；M-MLV反转录酶、PGEM-T载体购自Promega公司；Taq DNA多聚酶、限制性内切酶EcoRI、HindⅢ、PstI、XbaI、XhoI、异硫氰酸胍购自华美公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；焦磷酸二乙酯(DEPC)为Sigma公司产品。vaa, 百拇医药
1.2 总RAN提取 异硫氰酸胍一步法提取总RNA[3]。vaa, 百拇医药
1.3 引物设计与合成 根据文献报道的人整合素分子α4亚基cDNA序列[4]，设计并合成四条引物，分两段(830bp、1200bp)扩增无信号肽的α4 2.0kb cDNA片段。在引物5’端引入酶切位点XbaI、HindⅢ、PstI使扩增片段易于克隆，其中的HindⅢ是扩增片段内的酶切位点，以方便A、B两段的连接(见图1)。
vaa, 百拇医药图1α4片段cDNA的克隆vaa, 百拇医药
Fig 1Cloning of α4 fragment cDNAvaa, 百拇医药
P1＝GCT CTA GAC TAC AAC GTG GAC ACT GAG A
P2＝GTA CGA TCC AAG CTT TTT ACC TTT C@;, http://www.100md.com
P3＝GGT AAA AAG CTT GGA TCG TAC@;, http://www.100md.com
P4＝GCC AAT ACT GCA GTC AAG TTG TAC@;, http://www.100md.com
1.4 RT-PCR、片段克隆及序列分析 以提取的总RNA为模板，以oligodT为下游引物，参照M-MLV反转录酶产品说明进行反转录。以反转录产物为模板，分别以P1、P2；P3、P4为引物扩增A、B段(见图1)。PCR条件为：94°C变性30s，56°C退火1min，72°C延伸1min，共30个循环，最后72°C延伸10min。然后回收PCR产物，将A段按照产品说明书连入PGEM-T载体；B段经HindⅢ/PstI酶切连入经同样处理的pBSM13载体。由赛百胜公司分别对两段进行序列分析。@;, http://www.100md.com
1.5 A、B段的拼接及表达载体构建 为便于片段连接先将B段通过XhoI/BamHI酶切由pBS M13-B亚克隆至PGEM-7Z，再用XbaI/HindⅢ切点连入A段，而完成A、B段的拼接。然后用XbaI/EcoRI切下其中的1.7kb亚克隆入pBS M13，再用XbaI/XhoI切点将该片段连入PGEX-KG，而完成表达载体KG-1.7α4的构建(见图2)。
@;, http://www.100md.com图2 重组表达质粒KG-A+B的构建@;, http://www.100md.com
Fig2 The constructed recombinant expression plasmid KG-A+B@;, http://www.100md.com
1.6 大肠杆菌重组蛋白的诱导表达 挑取单菌落，在5ml LB培养基(含100mg/L氨苄西林)中37°C过夜培养，按1%比例接种到200ml LB(amp+)中，37°C振荡培养至OD600～1.0加IPTG至终浓度1.0mmol/L，同样条件培养4h。@;, http://www.100md.com
1.7 包涵体的分离 参见文献[5]。@;, http://www.100md.com
2 结果@;, http://www.100md.com
2.1 RT-PCR获取A、B片段及序列分析 以HL-60总RNA为模板，用两对引物分别扩增A、B段，回收目的片段并分别克隆进PGEM-T和pBS M13载体，并分别筛选出PGEM-T—A和pBS M13-B的阳性克隆(见图2)。测序发现：A段的两个克隆分别出现一处突变，将它们拼接则可消除突变；B段只有一处同义突变(ACA→ACG：Thr)。由A、B段的测序结果可得到α4片段2.0kb cDNA序列及由此导出的氨基酸序列(见图3)。
图3 α4 2.0kb cDNA片段序列及由此导出的氨基酸序列\, 百拇医药
Fig3 DNA and deduced amino acid sequences of the 2.0kb cDNA fragment of α4 underlined are mutation codon.\, 百拇医药
2.2 表达载体构建及重组蛋白表达 表达载体构建(见图2)，先将A、B段拼接在一起，并经酶切鉴定正确(见图4)。然后将其中的1.7kb克隆入PGEX-KG而完成表达载体KG-1.7α4的构建。将阳性克隆过夜活化，并接种200ml LB(amp+)肉汤，培养至OD600～1.0加IPTG至终浓度1.0mmol/L，继续培养4h。菌体经SDS-PAGE分析在94kD左右出现一条明亮的表达带，与理论计算的分子量相符，经扫描分析，表达量占菌体蛋白的18%。将菌体超声破碎，分别取上清及8mol尿素溶解上清行SDS-PAGE分析，发现表达产物主要以包涵体形式存在(见图5)。
\, 百拇医药图4 重组质粒7Z-A+B的鉴定\, 百拇医药
Fig4 Identification of the recombinant plasmid 7Z-A+B\, 百拇医药
1：λDNA/EcoRI+HindⅢ marker；2：7Z-A+B/XbaI+PstI；3：7Z-A+B/XbaI+HindⅢ；4：7Z-A+B
\, 百拇医药图5 SDS-PAGE分析重组蛋白表达\, 百拇医药
Fig 5SDS-PAGE analysis of recombinant protein\, 百拇医药
1：protein marker；2：E.coli JM109；3：E.coli Jm109\, 百拇医药
(KG-1.7α4)；4：supernatant；5：8M urea soluble product\, 百拇医药
3 讨论
当利用RT-PCR扩增较长的片段时，分段进行扩增是较好的选择。它不仅可提高扩增的效率，减少实验失败的风险，而且由于片段较短而更方便序列分析。当序列出现突变时，也更容易利用片段的拼接或其它手段去除突变。本文即利用这一技术获得了α4片段2.0kb cDNA，并将其中的1.7kb克隆入表达载体，在大肠杆菌中得到了高效表达。实验中也曾试图表达2.0kb cDNA编码的片段，但未获成功。结合作者其它的实验结果，可以认为较长的外源片段在大肠杆菌中表达会更加困难。由于α4的抗原表位主要集中在N端1-500氨基酸残基区域，因此得到的表达产物应当包含α4的主要抗原表位。抗α4的多种单克隆抗体可有效阻断α4整合素的多种功能，因此α4片段在大肠杆菌的成功表达为α4抗体的研制和α4整合素功能的研究奠定了重要基础。81, 百拇医药
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39789010)81, 百拇医药
[作者简介]刘永全(1971-)，男，河南淮阳县人，博士，主要从事抗感染免疫的研究。81, 百拇医药
[参考文献]81, 百拇医药
[1]刘永全，高杰英.α4整合素及其配体的分子结构和功能[J].国外医学分子生物学分册，1997，19：204～208.81, 百拇医药
[2]SCHIFFER SG，HEMLER ME，LOBB RR，et al.Molecular mapping of functional antibody binding sites of α4 integrin[J].J Biol Chem，1995，270(24)：14270～14273.81, 百拇医药
[3]CHOMCZYNSKI P，SACCHI N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem，1987，162：156～159.81, 百拇医药
[4]TAKADA Y，ELICES MJ，CROUSE C，et al.The primary structure of the α4 subunit of VLA-4：homo-logy to other integrins and a possible cell-cell adhesion function[J].EMBO J，1989，8：1361～1368.81, 百拇医药
[5]SAMBROOK J，FRITSCH EF，MANIATIS T，et al.Molecular cloning：A laboratory manual[M].In：2nd ed.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，845～849.81, 百拇医药
[收稿日期]1999-06-22；[修回日期]2000-01-17(刘永全 高杰英 彭虹 罗振革 梅俊杰)