GAM cDNA稳定转染的M1细胞系的建立与鉴定
作者：刘飞 刘崟 金伯泉 朱勇 陈丽华 张建平x{)z:2, 百拇医药
单位：刘飞(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；刘崟(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；金伯泉(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；朱勇(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；陈丽华(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；张建平(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)x{)z:2, 百拇医药
关键词：gp130结合分子；信号传导；基因转染x{)z:2, 百拇医药
免疫学杂志000305x{)z:2, 百拇医药
[摘 要]目的 为搞清GAM在gp130介导的信号传导中所起的作用。方法 选择在IL-6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系，分别用正向和反向插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS与pSV2-neo质粒共转染，经G418选择培养筛选得到稳定转染的细胞，并用半套式PCR方法证实了GAM基因与这两种细胞基因组DNA的整合。结果 流式细胞仪分析表明正向GAM cDNA转染的M1细胞中GAM的表达水平明显升高，3H掺入实验表明GAM表达水平升高使M1细胞对IL-6的反应性下降。结论 GAM高表达M1细胞的建立为深入研究GAM在gp130介导的信号传导中的作用提供了良好的实验模型。x{)z:2, 百拇医药
[中图分类号]R186 [文献标识码]Ax{)z:2, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)03-0179-04x{)z:2, 百拇医药
Establishment and verificatin of GAM cDNA stably transfected M1 cell linex{)z:2, 百拇医药
LIU Fei，LIU Yin，JIN Bo-quan，ZHU Yong，CHEN Li-hua，ZHANG Jian-pingx{)z:2, 百拇医药
(Department of Immunology，the forth Military Medical University，Xi’an 710032，China)x{)z:2, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate the role of GAM gp130 associated molecule in the gp130 mediated signaling.Me-thods Under the stimulation of IL-6 and sIL-6R，whose signal is transducted by gp130，M1 cells，a murine myeloid leukemia cell line，go into growth arrest.To investigate the role of GAM in the gp130 mediated signaling，the mammalian expressing vector pEF-BOS containing GAM cDNA or anti-sense cDNA of GAM was constructed and transfected permanently into the M1 cells.Nest-PCR and flow cytometric analysis verified the stable transfectants and increased level of GAM.Resulst The increase of GAM expression inhibited the growth arrest effect of IL-6 on M1 cells significantly，while the decreasing of GAM enhanced this effect slightly.Conclusion These results indicated that GAM might play a role of negative regulator in gp130 signaling.
[Key words]gp130；signal transduction； gene transfectionc*9o, 百拇医药
gp130是白细胞介素6(IL-6)、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)和心肌营养因子1(CT-1)等多种细胞因子受体中的共用信号传导链，在体内分布广泛，具有多种重要功能。已知JAK-Stat途径和MAPK途径均参与gp130的信号传导，但其调控过程尚未完全搞清[1]。gp130结合分子(gp130 associated molecule，GAM)是以gp130胞浆区-GST融合蛋白为探针筛选人胎盘cDNA文库而得到的分子，其cDNA全长为1.6kb，具有一个588个核苷酸的开放读框，编码一个由196个氨基酸组成、分子量为24kDa的蛋白分子[2]。Nothern印迹表明人体多种脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胰腺、骨骼肌、胎盘和睾丸等，均有GAM分子的表达。已证实体内GAM与gp130胞浆区近膜部分结合。GAM与JAK激酶和gp130分子在COS细胞中的共同表达可抑制JAK激酶与gp130的结合及这两者的磷酸化，而GAM分子本身无论有无IL-6刺激均未见有磷酸化现象[3]。从目前对GAM及其同源分子的研究结果推测，该分子可能通过蛋白质相互作用的形式参与gp130的信号传导。为探讨GAM在gp130介导的信号传导中所起的作用，我们选择在IL-6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系，用插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS与pSV2-neo质粒共转染，以观察GAM表达水平对M1细胞IL-6反应性的影响。c*9o, 百拇医药
1 材料与方法c*9o, 百拇医药
1.1 主要材料 M1细胞系为本室冻存的标准细胞株，正向和反向插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS(正向插入者称为pO，反向插入者称为pR)、pSV2-Neo质粒及上述质粒转化的DH5α菌均由本室自备[4]。脂质体Dosper购自宝灵曼公司。PCR引物P1、P2和P3均采用Steve Rozen等人的Primer3程序自行设计、P1、P2针对pEF-BOS中外源基因插入区(即填充区)的上下游，P3针对GAM cDNA 5′端第431-450位碱基序列(见图1)，由上海生工公司合成。引物序列P1：TTCTCAAGCC-TCAGACAGTGG；P2：GATACTCTCAAGGGTC-CCAGG；P3：CCTGCTAATCCGACTTCTCG。
图1 pEF-BOS-GAM的Pst I酶切位点及PCR引物位置nr}*%, 百拇医药
Fig 1 Pst I sites and PCR primers locations in pEF-BOS-GAMnr}*%, 百拇医药
The PCR product of pOby P3+P2 is 288bp，the amplified product of pR by P1+P3 is 258bp.nr}*%, 百拇医药
1.2 质粒的制备、纯化与鉴定 分别扩增pEF-BOS空载体、pO、pR或pSV2-Neo质粒转化的DH5α菌，用碱裂解法大量制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA。紫外分光光度法测定纯化产物的纯度与含量，用PstI酶切鉴定3种不同的pEF-BOS质粒。nr}*%, 百拇医药
1.3 M1细胞基因转染与筛选培养 将处于对数生长期的M1细胞接种于6孔板中，纯化的pSV2-Neo质粒分别与pR或pO质粒按1∶10的比例混匀，按操作手册在脂质体Dosper介导下转染M1细胞。转染后48h开始用含0.8g/L G418的相应培养液筛选3周。筛选出的耐药细胞株改用含0.2g/L G418的DMEM培养液，并通过有限稀释法进行克隆化。nr}*%, 百拇医药
1.4 半套式PCR鉴定稳定转染的细胞株 每种耐药克隆各收集5×105个细胞，离心、洗涤后加去离子水0.2ml煮沸3min离心，取20μl上清液做半套式PCR，即用引物P1、P2扩增后，再分别用引物P1+P3或P3+P2扩增。PCR条件为(1)95°C 8min；(2)95°C 1min；(3)52°C 1min；(4)72°C 1.5min；(5)重复2～4步29个循环；(6)72°C 5min。同时取微量pO或pR质粒进行PCR扩增作为阳性对照。PCR结束后1.5%琼脂糖电泳观察结果。nr}*%, 百拇医药
1.5 流式细胞仪检测鉴定GAM重组体 分别收集亲本M1细胞和各种转染的M1细胞，4%多聚甲醛4°C固定10min，0.1%皂角素-PBS室温下处理10min，加入GAM特异性单抗4E3[5]4°C孵育30min，0.1%皂角素-PBS充分洗涤后，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG 4°C孵育30min，同上洗涤后，用美国Coulter公司ELITE ESP型流式细胞仪检测。
1.6 GAM稳定转染的M1细胞对IL-6的反应性 亲本M1细胞和各种转染的M1细胞在不同浓度IL-6作用48h后，加入3H-TdR再培养8h后收集细胞，用美国Beckman公司LS6500型液闪记数仪测定β射线cpm值，以未经IL-6刺激细胞的cpm值为100%计算3H掺入率cpm%。i*aier, 百拇医药
2 结果i*aier, 百拇医药
2.1 质粒的纯化与鉴定 纯化的质粒OD260∶OD280均为1.80。用PstI酶切各种pEF-BOS质粒所得结果与预期相符。i*aier, 百拇医药
2.2 GAM稳定转染细胞系的建立及半套式PCR检测鉴定 pEF-BOS-GAM与pSV2共转染的M1细胞经3周的G418筛选及有限稀释后得到单克隆来源的耐药细胞株。上述耐药细胞经煮沸处理后取上清液行半套式PCR检测，各种pEF-BOS质粒转染细胞的扩增结果中与相应质粒得到的结果一致(见图2)。
i*aier, 百拇医药
图2半套式PCR检测鉴定GAM稳定转染的M1细胞i*aier, 百拇医药
Fig 2Identification of GAM stable transfected M1 cells by semi-nest PCRi*aier, 百拇医药
lane 1，2：products of pO amplified with P3+P2 or P1+P3 respectivlyi*aier, 百拇医药
lane 3，4：PCR procudts of pO transfected M1 cells amplifiedi*aier, 百拇医药
with (P1+P2，P3+P2)or (P1+P2，P1+P3) respectivly.i*aier, 百拇医药
lane 5：DNA marker(1543，994，695，515，377，237bp)
lane 6，7：PCR products of pR transfected M1 cells amplifiedep, 百拇医药
with (P1+P2，P3+P2) or (P1+P2，P1+P3) respectivly.ep, 百拇医药
lane 8，9：PCR products of pR amplified with P1+P3 or P3+P2 respectively.ep, 百拇医药
2.3 GAM重组体中GAM分子的表达水平 流式细胞仪分析表明，pO转染的M1细胞中，GAM分子的表达水平明显高于亲本M1细胞及空载体或pR转染细胞(P<0.01)，而pR转染的M1细胞中，GAM表达水平略低于亲本M1细胞与空载体转染细胞(见图3)。
ep, 百拇医药
图3 流式细胞仪检测M1细胞GAM分子的表达水平ep, 百拇医药
Fig3 GAM expression levels in wild type and transfected M1 cellsep, 百拇医药
2.4 GAM表达水平与M1细胞对IL-6的反应 3H-TdR掺入实验(见图4)表明，IL-6对pO转染的M1细胞(即高表达GAM的M1细胞)的增殖抑制效应明显低于对亲本M1细胞、空载体(pE)或pR转染M1细胞的作用(在IL-6为100和1000U/ml时P<0.01，IL-6为10 U/ml时P<0.05)。而GAM表达水平较低的pR转染的M1细胞对IL-6的反应性略有升高，但与亲本M1细胞及空载体转染细胞相比无明显差异。
ep, 百拇医药
图4 3H-TdR掺入实验检测M1细胞对IL-6的反应性
Fig4 3H-TdR incorporation assay of IL-6 response of M1 cellsn, 百拇医药
3 讨论n, 百拇医药
pEF-BOS是一种高效真核表达载体，含有人多肽链延长因子1α(EF-1α)基因启动子，但不含选择标记基因，EF-1α是真核细胞中表达最广泛、含量最高的蛋白质之一，该启动子可强烈地促进插入基因在多种真核细胞内的表达。WIGLER等人1979年发现，能够摄入DNA的哺乳动物细胞的摄入效率很高，两种不同的质粒共转染的频率大于90%。共转染免却了构建复杂重组载体的要求，已成为一种稳定转染真核细胞的常规方法。因此本文用高浓度的pEF-BOS载体与低浓度的pSV2-neo质粒共转染，以便用G418对稳定表达GAM或GAM反义RNA的细胞系进行筛选。n, 百拇医药
GAM的N-末端约130个氨基酸中富含谷氨酰氨(Q)残基，与介导细胞分化抑制信号的Notch途径中的主要效应分子TLE(transducin like enhancer of split)的氨基端高度同源[6]。C-末端约50个氨基酸组成的序列及其相应的cDNA序列特异性很高，Genebank检索未发现与其同源的基因序列，针对此段序列设计的PCR引物能特异地对GAM cDNA进行扩增。pEF-BOS中填充区上下游的碱基序列，即pEF-BOS-GAM中GAM cDNA上、下游的序列，分别来自EF-1α基因启动子和G-CSFcDNA中编码polyA的序列，针对这两段序列的一对PCR引物在野生型细胞中无法进行有限扩增，只有在基因组DNA中整合了pEF-BOS载体的细胞中才能扩出一段包含有填充区或外源基因的扩增产物。为了确定外源GAM基因与M1细胞基因组的整合及其插入方向，并提高检测的敏感度，我们采用套式PCR方法，先对整合进细胞基因组DNA中的pEF-BOS载体进行扩增，再对该扩增产物中的正向或反向GAM cDNA进行扩增，证实了GAM的稳定转染。n, 百拇医药
通过流式细胞仪技术检测M1细胞中GAM分子的表达水平，具有准确、快捷等优点。由于GAM是一种胞浆分子，在检测前需进行者固定、打孔等步骤。本文中的方法参考了细胞内细胞因子的检测方法[7]，用4%多聚甲醛固定，0.1%皂角素打孔，取得了较满意的结果。所用的抗GAM单抗4E3为本室自行制备，已证实该单抗具有很强的特异性，与TLE1等GAM同源分子无交叉反应。n, 百拇医药
M1细胞是一种小鼠髓样白血病细胞系，在IL-6或LIF诱导下出现增殖停滞并向巨噬细胞分化，这种反应是通过与gp130结合的JAK激酶活化Stat3实现的[8]。以往研究发现，M1细胞中GAM表达水平较低，本文通过GAM cDNA稳定转染建立了高表达GAM的M1细胞系。初步的生物学实验结果表明，高表达GAM的M1细胞对IL-6诱导的分化效应的敏感性降低，而GAM表达下降的M1细胞的敏感性轻度升高，提示GAM在体内对JAK-Stat途径有一定抑制作用。已发现GAM与JAK激酶和gp130分子在COS细胞中的共同表达可抑制JAK激酶与gp130的结合及这两者的磷酸化，与本研究的结果一致,提示GAM分子可能在gp130介导的信号转导中起一定负调控作用。na+}, 百拇医药
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39700073)na+}, 百拇医药
[作者简介]刘飞(1971-)，男，陕西临潼市人，助教，博士生，主要从事细胞因子的信号转导研究。na+}, 百拇医药
[参考文献]na+}, 百拇医药
[1]HEINRICH PC，BEHRMANN I，MULLER-NEWEN G，et al.Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway[J].Biochem-J，1998，334(Pt2)：297～303.na+}, 百拇医药
[2]刘崟，金伯泉.一种新的gp130结合分子的序列分析和真核表达[J].中华微生物学与免疫学杂志，1998，18(2)：107～110.na+}, 百拇医药
[3]刘崟，金伯泉.gp130结合分子抑制JAK激酶与gp130的结合[J].单克隆抗体通讯，1995，11(3～4)：48～53.na+}, 百拇医药
[4]刘崟，金伯泉.一种新的真核细胞表达载体pEF-BOS的应用[J].细胞与分子免疫学杂志，1996，12(2)：24～27.na+}, 百拇医药
[5]刘 飞，刘崟，金伯泉，等.GAM-Thiodoxin融合蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志，1998，14(1)：23～28.na+}, 百拇医药
[6]STIFANI S，BLAUMUELLER CM，TSAKONAS SA，et al.Human homologs of a drosophila enhancer of split gene product define a novel family of nuclear proteins[J].Nature Genetics，1992，2：119～127.na+}, 百拇医药
[7]MAINO VC，PICKER LJ.Identification of functional subsets by flow cytometry：intracellular detection of cytokine expression[J].Cytometry，1998，34(5)：207～215.na+}, 百拇医药
[8]MINAMI M，INOUE M，WEI S，et al.STAT3 activation is a critical step in gp130-mediated terminal differentiation and growth arrest of a myeloid cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(9)：3963～3971.na+}, 百拇医药
[收稿日期]1999-08-23；[修回日期]1999-12-08(刘飞 刘崟 金伯泉 朱勇 陈丽华 张建平)
单位：刘飞(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；刘崟(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；金伯泉(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；朱勇(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；陈丽华(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)；张建平(第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032)x{)z:2, 百拇医药
关键词：gp130结合分子；信号传导；基因转染x{)z:2, 百拇医药
免疫学杂志000305x{)z:2, 百拇医药
[摘 要]目的 为搞清GAM在gp130介导的信号传导中所起的作用。方法 选择在IL-6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系，分别用正向和反向插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS与pSV2-neo质粒共转染，经G418选择培养筛选得到稳定转染的细胞，并用半套式PCR方法证实了GAM基因与这两种细胞基因组DNA的整合。结果 流式细胞仪分析表明正向GAM cDNA转染的M1细胞中GAM的表达水平明显升高，3H掺入实验表明GAM表达水平升高使M1细胞对IL-6的反应性下降。结论 GAM高表达M1细胞的建立为深入研究GAM在gp130介导的信号传导中的作用提供了良好的实验模型。x{)z:2, 百拇医药
[中图分类号]R186 [文献标识码]Ax{)z:2, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)03-0179-04x{)z:2, 百拇医药
Establishment and verificatin of GAM cDNA stably transfected M1 cell linex{)z:2, 百拇医药
LIU Fei，LIU Yin，JIN Bo-quan，ZHU Yong，CHEN Li-hua，ZHANG Jian-pingx{)z:2, 百拇医药
(Department of Immunology，the forth Military Medical University，Xi’an 710032，China)x{)z:2, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate the role of GAM gp130 associated molecule in the gp130 mediated signaling.Me-thods Under the stimulation of IL-6 and sIL-6R，whose signal is transducted by gp130，M1 cells，a murine myeloid leukemia cell line，go into growth arrest.To investigate the role of GAM in the gp130 mediated signaling，the mammalian expressing vector pEF-BOS containing GAM cDNA or anti-sense cDNA of GAM was constructed and transfected permanently into the M1 cells.Nest-PCR and flow cytometric analysis verified the stable transfectants and increased level of GAM.Resulst The increase of GAM expression inhibited the growth arrest effect of IL-6 on M1 cells significantly，while the decreasing of GAM enhanced this effect slightly.Conclusion These results indicated that GAM might play a role of negative regulator in gp130 signaling.
[Key words]gp130；signal transduction； gene transfectionc*9o, 百拇医药
gp130是白细胞介素6(IL-6)、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)和心肌营养因子1(CT-1)等多种细胞因子受体中的共用信号传导链，在体内分布广泛，具有多种重要功能。已知JAK-Stat途径和MAPK途径均参与gp130的信号传导，但其调控过程尚未完全搞清[1]。gp130结合分子(gp130 associated molecule，GAM)是以gp130胞浆区-GST融合蛋白为探针筛选人胎盘cDNA文库而得到的分子，其cDNA全长为1.6kb，具有一个588个核苷酸的开放读框，编码一个由196个氨基酸组成、分子量为24kDa的蛋白分子[2]。Nothern印迹表明人体多种脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胰腺、骨骼肌、胎盘和睾丸等，均有GAM分子的表达。已证实体内GAM与gp130胞浆区近膜部分结合。GAM与JAK激酶和gp130分子在COS细胞中的共同表达可抑制JAK激酶与gp130的结合及这两者的磷酸化，而GAM分子本身无论有无IL-6刺激均未见有磷酸化现象[3]。从目前对GAM及其同源分子的研究结果推测，该分子可能通过蛋白质相互作用的形式参与gp130的信号传导。为探讨GAM在gp130介导的信号传导中所起的作用，我们选择在IL-6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系，用插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS与pSV2-neo质粒共转染，以观察GAM表达水平对M1细胞IL-6反应性的影响。c*9o, 百拇医药
1 材料与方法c*9o, 百拇医药
1.1 主要材料 M1细胞系为本室冻存的标准细胞株，正向和反向插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS(正向插入者称为pO，反向插入者称为pR)、pSV2-Neo质粒及上述质粒转化的DH5α菌均由本室自备[4]。脂质体Dosper购自宝灵曼公司。PCR引物P1、P2和P3均采用Steve Rozen等人的Primer3程序自行设计、P1、P2针对pEF-BOS中外源基因插入区(即填充区)的上下游，P3针对GAM cDNA 5′端第431-450位碱基序列(见图1)，由上海生工公司合成。引物序列P1：TTCTCAAGCC-TCAGACAGTGG；P2：GATACTCTCAAGGGTC-CCAGG；P3：CCTGCTAATCCGACTTCTCG。
图1 pEF-BOS-GAM的Pst I酶切位点及PCR引物位置nr}*%, 百拇医药
Fig 1 Pst I sites and PCR primers locations in pEF-BOS-GAMnr}*%, 百拇医药
The PCR product of pOby P3+P2 is 288bp，the amplified product of pR by P1+P3 is 258bp.nr}*%, 百拇医药
1.2 质粒的制备、纯化与鉴定 分别扩增pEF-BOS空载体、pO、pR或pSV2-Neo质粒转化的DH5α菌，用碱裂解法大量制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA。紫外分光光度法测定纯化产物的纯度与含量，用PstI酶切鉴定3种不同的pEF-BOS质粒。nr}*%, 百拇医药
1.3 M1细胞基因转染与筛选培养 将处于对数生长期的M1细胞接种于6孔板中，纯化的pSV2-Neo质粒分别与pR或pO质粒按1∶10的比例混匀，按操作手册在脂质体Dosper介导下转染M1细胞。转染后48h开始用含0.8g/L G418的相应培养液筛选3周。筛选出的耐药细胞株改用含0.2g/L G418的DMEM培养液，并通过有限稀释法进行克隆化。nr}*%, 百拇医药
1.4 半套式PCR鉴定稳定转染的细胞株 每种耐药克隆各收集5×105个细胞，离心、洗涤后加去离子水0.2ml煮沸3min离心，取20μl上清液做半套式PCR，即用引物P1、P2扩增后，再分别用引物P1+P3或P3+P2扩增。PCR条件为(1)95°C 8min；(2)95°C 1min；(3)52°C 1min；(4)72°C 1.5min；(5)重复2～4步29个循环；(6)72°C 5min。同时取微量pO或pR质粒进行PCR扩增作为阳性对照。PCR结束后1.5%琼脂糖电泳观察结果。nr}*%, 百拇医药
1.5 流式细胞仪检测鉴定GAM重组体 分别收集亲本M1细胞和各种转染的M1细胞，4%多聚甲醛4°C固定10min，0.1%皂角素-PBS室温下处理10min，加入GAM特异性单抗4E3[5]4°C孵育30min，0.1%皂角素-PBS充分洗涤后，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG 4°C孵育30min，同上洗涤后，用美国Coulter公司ELITE ESP型流式细胞仪检测。
1.6 GAM稳定转染的M1细胞对IL-6的反应性 亲本M1细胞和各种转染的M1细胞在不同浓度IL-6作用48h后，加入3H-TdR再培养8h后收集细胞，用美国Beckman公司LS6500型液闪记数仪测定β射线cpm值，以未经IL-6刺激细胞的cpm值为100%计算3H掺入率cpm%。i*aier, 百拇医药
2 结果i*aier, 百拇医药
2.1 质粒的纯化与鉴定 纯化的质粒OD260∶OD280均为1.80。用PstI酶切各种pEF-BOS质粒所得结果与预期相符。i*aier, 百拇医药
2.2 GAM稳定转染细胞系的建立及半套式PCR检测鉴定 pEF-BOS-GAM与pSV2共转染的M1细胞经3周的G418筛选及有限稀释后得到单克隆来源的耐药细胞株。上述耐药细胞经煮沸处理后取上清液行半套式PCR检测，各种pEF-BOS质粒转染细胞的扩增结果中与相应质粒得到的结果一致(见图2)。
i*aier, 百拇医药图2半套式PCR检测鉴定GAM稳定转染的M1细胞i*aier, 百拇医药
Fig 2Identification of GAM stable transfected M1 cells by semi-nest PCRi*aier, 百拇医药
lane 1，2：products of pO amplified with P3+P2 or P1+P3 respectivlyi*aier, 百拇医药
lane 3，4：PCR procudts of pO transfected M1 cells amplifiedi*aier, 百拇医药
with (P1+P2，P3+P2)or (P1+P2，P1+P3) respectivly.i*aier, 百拇医药
lane 5：DNA marker(1543，994，695，515，377，237bp)
lane 6，7：PCR products of pR transfected M1 cells amplifiedep, 百拇医药
with (P1+P2，P3+P2) or (P1+P2，P1+P3) respectivly.ep, 百拇医药
lane 8，9：PCR products of pR amplified with P1+P3 or P3+P2 respectively.ep, 百拇医药
2.3 GAM重组体中GAM分子的表达水平 流式细胞仪分析表明，pO转染的M1细胞中，GAM分子的表达水平明显高于亲本M1细胞及空载体或pR转染细胞(P<0.01)，而pR转染的M1细胞中，GAM表达水平略低于亲本M1细胞与空载体转染细胞(见图3)。
ep, 百拇医药图3 流式细胞仪检测M1细胞GAM分子的表达水平ep, 百拇医药
Fig3 GAM expression levels in wild type and transfected M1 cellsep, 百拇医药
2.4 GAM表达水平与M1细胞对IL-6的反应 3H-TdR掺入实验(见图4)表明，IL-6对pO转染的M1细胞(即高表达GAM的M1细胞)的增殖抑制效应明显低于对亲本M1细胞、空载体(pE)或pR转染M1细胞的作用(在IL-6为100和1000U/ml时P<0.01，IL-6为10 U/ml时P<0.05)。而GAM表达水平较低的pR转染的M1细胞对IL-6的反应性略有升高，但与亲本M1细胞及空载体转染细胞相比无明显差异。
ep, 百拇医药图4 3H-TdR掺入实验检测M1细胞对IL-6的反应性
Fig4 3H-TdR incorporation assay of IL-6 response of M1 cellsn, 百拇医药
3 讨论n, 百拇医药
pEF-BOS是一种高效真核表达载体，含有人多肽链延长因子1α(EF-1α)基因启动子，但不含选择标记基因，EF-1α是真核细胞中表达最广泛、含量最高的蛋白质之一，该启动子可强烈地促进插入基因在多种真核细胞内的表达。WIGLER等人1979年发现，能够摄入DNA的哺乳动物细胞的摄入效率很高，两种不同的质粒共转染的频率大于90%。共转染免却了构建复杂重组载体的要求，已成为一种稳定转染真核细胞的常规方法。因此本文用高浓度的pEF-BOS载体与低浓度的pSV2-neo质粒共转染，以便用G418对稳定表达GAM或GAM反义RNA的细胞系进行筛选。n, 百拇医药
GAM的N-末端约130个氨基酸中富含谷氨酰氨(Q)残基，与介导细胞分化抑制信号的Notch途径中的主要效应分子TLE(transducin like enhancer of split)的氨基端高度同源[6]。C-末端约50个氨基酸组成的序列及其相应的cDNA序列特异性很高，Genebank检索未发现与其同源的基因序列，针对此段序列设计的PCR引物能特异地对GAM cDNA进行扩增。pEF-BOS中填充区上下游的碱基序列，即pEF-BOS-GAM中GAM cDNA上、下游的序列，分别来自EF-1α基因启动子和G-CSFcDNA中编码polyA的序列，针对这两段序列的一对PCR引物在野生型细胞中无法进行有限扩增，只有在基因组DNA中整合了pEF-BOS载体的细胞中才能扩出一段包含有填充区或外源基因的扩增产物。为了确定外源GAM基因与M1细胞基因组的整合及其插入方向，并提高检测的敏感度，我们采用套式PCR方法，先对整合进细胞基因组DNA中的pEF-BOS载体进行扩增，再对该扩增产物中的正向或反向GAM cDNA进行扩增，证实了GAM的稳定转染。n, 百拇医药
通过流式细胞仪技术检测M1细胞中GAM分子的表达水平，具有准确、快捷等优点。由于GAM是一种胞浆分子，在检测前需进行者固定、打孔等步骤。本文中的方法参考了细胞内细胞因子的检测方法[7]，用4%多聚甲醛固定，0.1%皂角素打孔，取得了较满意的结果。所用的抗GAM单抗4E3为本室自行制备，已证实该单抗具有很强的特异性，与TLE1等GAM同源分子无交叉反应。n, 百拇医药
M1细胞是一种小鼠髓样白血病细胞系，在IL-6或LIF诱导下出现增殖停滞并向巨噬细胞分化，这种反应是通过与gp130结合的JAK激酶活化Stat3实现的[8]。以往研究发现，M1细胞中GAM表达水平较低，本文通过GAM cDNA稳定转染建立了高表达GAM的M1细胞系。初步的生物学实验结果表明，高表达GAM的M1细胞对IL-6诱导的分化效应的敏感性降低，而GAM表达下降的M1细胞的敏感性轻度升高，提示GAM在体内对JAK-Stat途径有一定抑制作用。已发现GAM与JAK激酶和gp130分子在COS细胞中的共同表达可抑制JAK激酶与gp130的结合及这两者的磷酸化，与本研究的结果一致,提示GAM分子可能在gp130介导的信号转导中起一定负调控作用。na+}, 百拇医药
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39700073)na+}, 百拇医药
[作者简介]刘飞(1971-)，男，陕西临潼市人，助教，博士生，主要从事细胞因子的信号转导研究。na+}, 百拇医药
[参考文献]na+}, 百拇医药
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[2]刘崟，金伯泉.一种新的gp130结合分子的序列分析和真核表达[J].中华微生物学与免疫学杂志，1998，18(2)：107～110.na+}, 百拇医药
[3]刘崟，金伯泉.gp130结合分子抑制JAK激酶与gp130的结合[J].单克隆抗体通讯，1995，11(3～4)：48～53.na+}, 百拇医药
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[5]刘 飞，刘崟，金伯泉，等.GAM-Thiodoxin融合蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志，1998，14(1)：23～28.na+}, 百拇医药
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[收稿日期]1999-08-23；[修回日期]1999-12-08(刘飞 刘崟 金伯泉 朱勇 陈丽华 张建平)