中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶表型分析研究
作者：尹晓娟 李为明 魏红光 奚敏 邱荆安0p, http://www.100md.com
单位：尹晓娟(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；李为明(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；魏红光(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；奚敏(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；邱荆安(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)0p, http://www.100md.com
关键词：α1-抗糜蛋白酶；表型；等电聚焦0p, http://www.100md.com
免疫学杂志000413 [摘 要] 目的 了解中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶表型的分布情况。方法 建立测定α1-抗糜蛋白酶表型的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦免疫固定技术并应用这种方法对居住在重庆市汉族群体的200例个体的α1-抗糜蛋白酶表型进行分析。结果 发现中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶具有3种表型。结论 据此推测α1-抗糜蛋白酶有希望成为人类遗传学新的遗传标记，同时为进一步开展α1-抗糜蛋白酶遗传多态性与疾病的相互关系研究拓宽了视野。0p, http://www.100md.com
[中图分类号] Q556.9 [文献标识码] A0p, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)04-0287-020p, http://www.100md.com
Study of phenotypes of α1-antichymotrypsin in a Han Population in China0p, http://www.100md.com
YIN Xiao-juan，LI Wei-ming，WEI Hong-guang， XI Min，QIU Jing-an0p, http://www.100md.com
(Department of Pediatrics，Xinqiao Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400037，China)0p, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To understand distribution of phenotypes of α1-antichymotrypsin (α1-ACT) in a Han Population in China.Methods Phenotypes of α1-ACT have been determined by isoelectric focusing on the polyacrylamide gel followed by immunofixation.The phenotype frequencies of α1-ACT were investigated using this method in the Han Population in Chongqing.Results Three phenotypes of α1-ACT were found in the Han Population in Chongqing.Conclusions This study provide clues for α1-ACT to be a new and promising genetic marker and build a basis of related study between genetic polymorphism of α1-ACT and diseases.
[Key words] α1-antichymotrypsin；phenotypes；isoelectric focusingvaa, 百拇医药
α1-抗糜蛋白酶(α1-antichymotrypsin，α1-ACT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，是一种分子量为68kd的糖蛋白，能特异性地灭活丝氨酸蛋白水解酶。研究发现，α1-ACT的遗传缺陷与许多疾病(哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性肝病、阿滋海默氏病)相关联[1]。而有关α1-ACT表型的研究国内外未见报道。鉴于寻找遗传标记一直是遗传学、人类学和法医学的重要任务，本研究建立了测定α1-抗糜蛋白酶表型的聚丙烯酰胺凝胺等电聚焦和免疫固定技术，并应用这种方法对居住在重庆市的汉族群体的200例个体的α1-抗糜蛋白酶表型进行了研究，现将研究结果报告如下。vaa, 百拇医药
1 材料与方法vaa, 百拇医药
1.1 材料 用于群体调查的200份血样，系按分层随机抽样采自重庆市彼此无血缘关系的汉族青年男女。所有血样均为不抗凝血。静脉采血后分离血清，置-80 °C保存备用。兔抗人α1-ACT抗血清购自DAKO公司，V型唾液酸苷酶购自美国Sigma公司，载体两性电解质Pharmalyte购自Pharmacia-LKB公司，聚丙烯酰胶凝胶电泳试剂为德国Gibco BRL公司产品，醋酸纤维素膜为浙江黄岩生化厂产品，其余化学试剂均为国产分析纯级。vaa, 百拇医药
1.2 方法 采用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦免疫固定技术测定α1-ACT表型。薄层聚丙烯酰胺凝胶(T＝10%，C＝3%)，载体两性电解质含量为6.4%，pH范围4.5～5.4，循环水温10 °C，采用阳极液为0.1 mol/L H3PO4，阴极液0.1 mol/L NaOH，电极间距离10 cm，预电泳30 min后，将唾液酸苷酶处理后的血清(酶与血清体积比为1∶2，酶浓度3 u/ml)加在离阴极1.5 cm的加样滤纸上，上样量为5 μl/样本，上样后1 500 v电泳2 h，1800 v电泳3 h。等电聚焦完成后立即行免疫固定，将浸有α1-ACT抗血清的醋酸纤维膜铺盖于凝胶表面，室温湿盒放置30 min，将膜置pH7.2 PBS中漂洗1 h，用0.1%考马斯亮蓝R250染色，脱色液为冰乙酸-无水乙醇-蒸馏水(1∶3∶6)，将染色的电泳带脱色至背景清晰为止。
2 结果@:, http://www.100md.com
唾液酸苷酶处理后的血清、经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分离，用特异性抗α1-ACT抗血清免疫固定后呈现多条蛋白带(见图1)。根据个体α1-ACT蛋白带的位置差异，可观察到3种表型，我们暂时命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。200名研究对象中，α1-ACT表型为Ⅰ型的占197/200，α1-ACT表型为Ⅱ型的占1/200，α1-ACT表型为Ⅲ型的占2/200。
@:, http://www.100md.com
图1α1-ACT等电聚焦和免疫固定分型(下为阴极)@:, http://www.100md.com
Fig 1α1-ACT phenotypes as revealed by IEF of desialyzed samples and Subsequent immunofixation(cathode at the bottom)@:, http://www.100md.com
1：α1-ACTⅠtype；2：α1-ACTⅡtype；3，4：α1-ACTⅢtype@:, http://www.100md.com
3 讨论@:, http://www.100md.com
α1-ACT和α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)同属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，它们的基因紧密相邻并定位于14q31～32.3[2]，它们不仅在氨基酸顺序和在基因排列上具有高度的同源性，而且具有相似的蛋白酶抑制活性，特异性地抑制丝氨酸蛋白水解酶。即往的研究表明，α1-AT在蛋白水平存在多种表型，而α1-ACT蛋白表型如何无人评估。为探讨α1-ACT遗传缺陷与慢性阻塞性疾病的关系，WEIDINGER等曾采用等电聚焦及免疫固定技术，在蛋白水平发现了Bochum-1变异体。本研究为了使电泳带更清晰，在文献[3]的基础上将等电聚焦技术进一步改良，建立了测定α1-抗糜蛋白酶表型的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦免疫固定技术，并初次对α1-ACT蛋白表型进行探讨。结果表明：中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶表型存在多态性，且以Ⅰ型表型频率为高。我们的工作是初步的，仅仅为遗传学、人类学、法医学和进一步研究提供一条线索，为寻找新的遗传标记及进一步开展α1-抗糜蛋白酶遗传多态性与疾病相互关系的研究打下基础。至于引起α1-ACT表型多态性的基因结构改变如何则需要依靠家系调查、更先进的技术来做进一步的研究。@:, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39570749)@:, http://www.100md.com
[作者简介] 尹晓娟(1966-)，女，湖南邵阳市人，主治医师，硕士，主要从事α1-抗糜蛋白酶遗传缺陷在中国人发病中的作用研究。@:, http://www.100md.com
[参考文献]@:, http://www.100md.com
[1] 尹晓娟，李为明.α1-抗糜蛋白酶的研究进展[J].四川医学，1999，20(3)：281-283.@:, http://www.100md.com
[2] ELZOUKI AN，VERBAAN H，LINDGREN S，et al.Serine protease inhitors in patients with chronic viral hepatitis[J].Hepatol，1997，27(1)：42-48.@:, http://www.100md.com
[3] WEIDINGER S，POLLER W，FABER JP，et al.Improved phenotyping of alphal-antichymotrypsin(ACT) by isoelectric focusing and immunoprinting：first demonstration of a deficient protein variant in the ACT system[J].Electrophoresis，1992，13(9)：778-780.@:, http://www.100md.com
[收稿日期] 1999-11-11; [修回日期] 1999-12-27(尹晓娟 李为明 魏红光 奚敏 邱荆安)
单位：尹晓娟(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；李为明(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；魏红光(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；奚敏(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)；邱荆安(第三军医大学附属新桥医院儿科，重庆 400037)0p, http://www.100md.com
关键词：α1-抗糜蛋白酶；表型；等电聚焦0p, http://www.100md.com
免疫学杂志000413 [摘 要] 目的 了解中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶表型的分布情况。方法 建立测定α1-抗糜蛋白酶表型的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦免疫固定技术并应用这种方法对居住在重庆市汉族群体的200例个体的α1-抗糜蛋白酶表型进行分析。结果 发现中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶具有3种表型。结论 据此推测α1-抗糜蛋白酶有希望成为人类遗传学新的遗传标记，同时为进一步开展α1-抗糜蛋白酶遗传多态性与疾病的相互关系研究拓宽了视野。0p, http://www.100md.com
[中图分类号] Q556.9 [文献标识码] A0p, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)04-0287-020p, http://www.100md.com
Study of phenotypes of α1-antichymotrypsin in a Han Population in China0p, http://www.100md.com
YIN Xiao-juan，LI Wei-ming，WEI Hong-guang， XI Min，QIU Jing-an0p, http://www.100md.com
(Department of Pediatrics，Xinqiao Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400037，China)0p, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To understand distribution of phenotypes of α1-antichymotrypsin (α1-ACT) in a Han Population in China.Methods Phenotypes of α1-ACT have been determined by isoelectric focusing on the polyacrylamide gel followed by immunofixation.The phenotype frequencies of α1-ACT were investigated using this method in the Han Population in Chongqing.Results Three phenotypes of α1-ACT were found in the Han Population in Chongqing.Conclusions This study provide clues for α1-ACT to be a new and promising genetic marker and build a basis of related study between genetic polymorphism of α1-ACT and diseases.
[Key words] α1-antichymotrypsin；phenotypes；isoelectric focusingvaa, 百拇医药
α1-抗糜蛋白酶(α1-antichymotrypsin，α1-ACT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，是一种分子量为68kd的糖蛋白，能特异性地灭活丝氨酸蛋白水解酶。研究发现，α1-ACT的遗传缺陷与许多疾病(哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性肝病、阿滋海默氏病)相关联[1]。而有关α1-ACT表型的研究国内外未见报道。鉴于寻找遗传标记一直是遗传学、人类学和法医学的重要任务，本研究建立了测定α1-抗糜蛋白酶表型的聚丙烯酰胺凝胺等电聚焦和免疫固定技术，并应用这种方法对居住在重庆市的汉族群体的200例个体的α1-抗糜蛋白酶表型进行了研究，现将研究结果报告如下。vaa, 百拇医药
1 材料与方法vaa, 百拇医药
1.1 材料 用于群体调查的200份血样，系按分层随机抽样采自重庆市彼此无血缘关系的汉族青年男女。所有血样均为不抗凝血。静脉采血后分离血清，置-80 °C保存备用。兔抗人α1-ACT抗血清购自DAKO公司，V型唾液酸苷酶购自美国Sigma公司，载体两性电解质Pharmalyte购自Pharmacia-LKB公司，聚丙烯酰胶凝胶电泳试剂为德国Gibco BRL公司产品，醋酸纤维素膜为浙江黄岩生化厂产品，其余化学试剂均为国产分析纯级。vaa, 百拇医药
1.2 方法 采用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦免疫固定技术测定α1-ACT表型。薄层聚丙烯酰胺凝胶(T＝10%，C＝3%)，载体两性电解质含量为6.4%，pH范围4.5～5.4，循环水温10 °C，采用阳极液为0.1 mol/L H3PO4，阴极液0.1 mol/L NaOH，电极间距离10 cm，预电泳30 min后，将唾液酸苷酶处理后的血清(酶与血清体积比为1∶2，酶浓度3 u/ml)加在离阴极1.5 cm的加样滤纸上，上样量为5 μl/样本，上样后1 500 v电泳2 h，1800 v电泳3 h。等电聚焦完成后立即行免疫固定，将浸有α1-ACT抗血清的醋酸纤维膜铺盖于凝胶表面，室温湿盒放置30 min，将膜置pH7.2 PBS中漂洗1 h，用0.1%考马斯亮蓝R250染色，脱色液为冰乙酸-无水乙醇-蒸馏水(1∶3∶6)，将染色的电泳带脱色至背景清晰为止。
2 结果@:, http://www.100md.com
唾液酸苷酶处理后的血清、经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分离，用特异性抗α1-ACT抗血清免疫固定后呈现多条蛋白带(见图1)。根据个体α1-ACT蛋白带的位置差异，可观察到3种表型，我们暂时命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。200名研究对象中，α1-ACT表型为Ⅰ型的占197/200，α1-ACT表型为Ⅱ型的占1/200，α1-ACT表型为Ⅲ型的占2/200。
@:, http://www.100md.com图1α1-ACT等电聚焦和免疫固定分型(下为阴极)@:, http://www.100md.com
Fig 1α1-ACT phenotypes as revealed by IEF of desialyzed samples and Subsequent immunofixation(cathode at the bottom)@:, http://www.100md.com
1：α1-ACTⅠtype；2：α1-ACTⅡtype；3，4：α1-ACTⅢtype@:, http://www.100md.com
3 讨论@:, http://www.100md.com
α1-ACT和α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)同属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，它们的基因紧密相邻并定位于14q31～32.3[2]，它们不仅在氨基酸顺序和在基因排列上具有高度的同源性，而且具有相似的蛋白酶抑制活性，特异性地抑制丝氨酸蛋白水解酶。即往的研究表明，α1-AT在蛋白水平存在多种表型，而α1-ACT蛋白表型如何无人评估。为探讨α1-ACT遗传缺陷与慢性阻塞性疾病的关系，WEIDINGER等曾采用等电聚焦及免疫固定技术，在蛋白水平发现了Bochum-1变异体。本研究为了使电泳带更清晰，在文献[3]的基础上将等电聚焦技术进一步改良，建立了测定α1-抗糜蛋白酶表型的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦免疫固定技术，并初次对α1-ACT蛋白表型进行探讨。结果表明：中国汉族人群α1-抗糜蛋白酶表型存在多态性，且以Ⅰ型表型频率为高。我们的工作是初步的，仅仅为遗传学、人类学、法医学和进一步研究提供一条线索，为寻找新的遗传标记及进一步开展α1-抗糜蛋白酶遗传多态性与疾病相互关系的研究打下基础。至于引起α1-ACT表型多态性的基因结构改变如何则需要依靠家系调查、更先进的技术来做进一步的研究。@:, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39570749)@:, http://www.100md.com
[作者简介] 尹晓娟(1966-)，女，湖南邵阳市人，主治医师，硕士，主要从事α1-抗糜蛋白酶遗传缺陷在中国人发病中的作用研究。@:, http://www.100md.com
[参考文献]@:, http://www.100md.com
[1] 尹晓娟，李为明.α1-抗糜蛋白酶的研究进展[J].四川医学，1999，20(3)：281-283.@:, http://www.100md.com
[2] ELZOUKI AN，VERBAAN H，LINDGREN S，et al.Serine protease inhitors in patients with chronic viral hepatitis[J].Hepatol，1997，27(1)：42-48.@:, http://www.100md.com
[3] WEIDINGER S，POLLER W，FABER JP，et al.Improved phenotyping of alphal-antichymotrypsin(ACT) by isoelectric focusing and immunoprinting：first demonstration of a deficient protein variant in the ACT system[J].Electrophoresis，1992，13(9)：778-780.@:, http://www.100md.com
[收稿日期] 1999-11-11; [修回日期] 1999-12-27(尹晓娟 李为明 魏红光 奚敏 邱荆安)