小鼠抗人C5aR短肽(9～30)单克隆抗体制备及鉴定
作者：吕凤林 郑萍 朱锡华t?&v+, 百拇医药
单位：吕凤林(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；郑萍(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；朱锡华(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)t?&v+, 百拇医药
关键词：单克隆抗体；C5a受体；表位多肽t?&v+, 百拇医药
免疫学杂志000416 [摘 要] 目的 获得有生物功能的小鼠抗人C5aR短肽单克隆抗体。方法 对C5a受体(CD88)二级结构和B细胞表位进行分析研究，采用Fmoc方案固相合成C5aR N-端第9～30位氨基酸残基的22-肽，以此为抗原免疫Balb/c小鼠。结果 建立了1株小鼠抗人C5aR短肽杂交瘤细胞系E3，其平均染色体数目为102条，所分泌抗体为IgG1，κ型，腹水抗体效价为1×10-4～1×10-6，可识别U937、人脐静脉内皮细胞(VEC)和PMN等表达C5aR细胞。E3单抗的亲和常数Ka＝2.5×105，其结合表位为C5aR第15～21位氨基酸基序D15DKDTL20D。结论 B细胞表位多肽具有免疫原性，可制作单克隆抗体，为C5a-C5aR相互作用的研究以及ALI、ARDS等C5a相关疾病的研究提供实验材料。t?&v+, 百拇医药
[中图分类号] R392-33 [文献标识码] At?&v+, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)04-0294-04t?&v+, 百拇医药
Production and characterization of the monoclonal antibody against C5a anaphylatoxins recepter(CD88)t?&v+, 百拇医药
LU Feng-lin， ZHENG Ping，ZHU Xi-huat?&v+, 百拇医药
(Institute of Immunology PLA，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)t?&v+, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate the production and characterization of the monoclonal antibody against C5a anaphylatoxin receptor(CD88).Methods Based on the relationship between the secondary structure and it’s functions of the C5a anaphylatoxin receptor(CD88)，the predominant B-cell epitope of the C5aR was designed on the computers.Position 9～30 of the C5aR，called as P22 was synthesized using fluorenyl-methoxy-carbon y1-protected，benzotriazol-l-Yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hezafluorophosphate-activated amino acids and an automatic peptide synthesizer.Peptide purity was confirmed by HPLC and identification by caplilliary electrophoresis.The purity of the P22 was 95.19%.McAb generated from hybridoma E3 with specificity for the C5aR(9～30) was obtained by the i.p.immunization of Balb/c mice with 100 μg of P22-conjugate in CFA.The culture supernatants of the hybridoma E3 were secreted by solid-phase ELISA techniques employing the C5aR(9～30)peptide，the peptide-specific McAb was purified by immunoaffinity chromatography on peptide resin columns.Results The titers of this McAb in culture supernatants and ascites fluid were 1∶32～1∶128，1∶10-4～1∶10-6，respectively.Results from western blotting using reducing agent suggest E3 reacts to a 45 kd bland.The affinity contents of the E3 was 2.5×105.Conclusion The peptide of the B-cell epifope of the C5aR has it’s immunoantigence. It could be used to produce mono-clonal antibodies.It is also important for studying the interactions between C5a and C5aR，and for ALI，ARDS.
[Key words] monoclonal antibody；C5a receptor(CD88)；epitope peptideso8%5k, 百拇医药
C5a受体(CD88)广泛分布于多种类型细胞，C5a与C5aR特异结合后介导多种生理、病理反应，如C5a可不依赖组胺致平滑肌细胞痉挛[1]；调节肝细胞急性期蛋白的合成；促进星形胶质细胞合成分泌补体成分等。深入研究C5a-C5aR相互作用机制需特定的实验材料，基于这一目的，在C5aR之B细胞表位预测的基础上[2]，人工合成C5aR(9～30)表位多肽P22，以此为免疫原制备了1株小鼠抗人C5aR短肽单克隆抗体。o8%5k, 百拇医药
1 材料o8%5k, 百拇医药
1.1 试剂 RPMI 1640、NC膜(gibco)、次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)、氨基喋呤(A)、PEG(MW3400)DMSO均购自Sigma公司，anti-hC5aR McAb(S5/1)购自SEROTIC公司，HRP-山羊抗小鼠IgG，购自华美公司。小鼠Ig类与亚类检测试剂盒IsostripTMkit购自BM公司。C20为合成的随机对照20-肽，酶联检测(ELISA)试剂均为国产分析纯。o8%5k, 百拇医药
1.2 动物及细胞株 Balb/c纯系小鼠，6～8周龄，雌性，购自军事医学科学院实验动物中心。SP2/0小鼠骨髓瘤细胞株为本室保存。o8%5k, 百拇医药
1.3 仪器设备 细胞培养常规仪器设备为Bio-Rad3550型酶标自动检测仪。o8%5k, 百拇医药
2 方法o8%5k, 百拇医药
2.1 小鼠抗人C5aR短肽(9～30)McAb的产生o8%5k, 百拇医药
2.1.1 免疫原：将受Fmoc树脂保护的合成多肽与等体积的福氏完全佐剂充分乳化。抗原用量100 μg/只。第15、29 d再次免疫。融合前3 d用纯化多肽按150 μg/只作腹腔注射。o8%5k, 百拇医药
2.1.2 细胞融合：常规收集免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞按10∶1的比例以50% PEG进行融合。HAT培养液选择培养，融合后10～15 d取上清行ELISA筛选。o8%5k, 百拇医药
2.1.3 阳性克隆的ELISA筛选：P22按20 ng/ml的工作浓度包被酶联板，免疫小鼠血清1∶10作阳性对照，SP2/0培养上清和正常小鼠血清作阴性对照，加1∶1 000 HRP-山羊抗小鼠IgG，100 μl/孔，最后测定OD490值。凡OD490值大于阴性对照(SP2/0细胞培养上清)2倍以上者，初步判定为阳性克隆。
2.1.4 克隆化及亚克隆化：将初步筛选的阳性克隆E3杂交瘤作有限稀释，进行4次亚克隆。jo?%@, 百拇医药
2.1.5 制备小鼠腹水和纯化抗体常规方法：jo?%@, 百拇医药
2.2 小鼠抗人C5aR(9～30)短肽McAb的鉴定jo?%@, 百拇医药
2.2.1 ELISA方法：同2.1.3。jo?%@, 百拇医药
2.2.2 核型分析：参照文献[3]。jo?%@, 百拇医药
2.2.3 Ig类与亚类鉴定：按BM公司生产的IsostripTM试剂盒说明进行。jo?%@, 百拇医药
2.2.4 抗人C5aR(9～30)短肽McAb亲和常数测定：参考HEYINGEN等[4]的方法，即间接ELISA法测定P22-McAb反应曲线，在曲线上找出最大结合50%的McAb浓度(mol/L)，亲和常数(Ka)则为McAb浓度的倒数。jo?%@, 百拇医药
2.2.5 抗人C5aR(9～30)短肽McAb结合表位分析：用非标记ELISA相加试验，参照文献[5，6]。jo?%@, 百拇医药
2.2.6 小鼠抗人C5aR(9～30)短肽McAb中和抑制试验：20 ng/ml P22包被酶联板，分别用含20 ng/ml P22和20 ng/ml C20的稀释液将E3腹水作1∶100、E3培养上清作1∶5稀释，对照组仅用PBS-T稀释，在37 °C下作用2 h，加入100 ul/孔 4 °C过夜，ELISA法检测被中和的E3抗体。jo?%@, 百拇医药
3 结果jo?%@, 百拇医药
3.1 杂交瘤细胞系的建立 以人工合成短肽C5aR(9～30)P22为免疫原，先后免疫Balb/c小鼠25只，共融合7次，成功4次，从384孔中得到346孔阳性克隆，融合率达90.10%，经四次亚克隆和ELISA筛选，得到1株杂交瘤E3，第16代E3的上清和腹水经间接ELISA法测定上清效价为1∶32～1∶128，腹水效价为1×10-4～1×10-6。E3分泌的抗体类型为IgG1，κ型。jo?%@, 百拇医药
3.2 E3染色体组型分析 见图1：杂交瘤细胞E3的染色体数目平均为102，既有端部着丝点染色体，又有中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体。说明E3为小鼠脾细胞与SP2/0细胞的融合体。
图1杂交瘤细胞E3的染色体组型e$7f9o, 百拇医药
Fig 1The chromosomal morphology of the hybridoma E3e$7f9o, 百拇医药
3.3 E3可识别C5aR+细胞 将U937细胞、人脐静脉内皮细胞(VEC)和PMN细胞培养在酶联板中，调整细胞数105/孔，取E3腹水按1∶1 000的工作浓度ELISA测定，结果见表1。e$7f9o, 百拇医药
表1 杂交瘤细胞E3识别的细胞种类e$7f9o, 百拇医药
Tab 1 The cell types be recognized by E3 concentratione$7f9o, 百拇医药
of ascites(10-3)e$7f9o, 百拇医药
U937e$7f9o, 百拇医药
VECe$7f9o, 百拇医药
PMNe$7f9o, 百拇医药
E3e$7f9o, 百拇医药
2.031±0.16e$7f9o, 百拇医药
1.976±0.01e$7f9o, 百拇医药
2.135±0.012e$7f9o, 百拇医药
SP2/0e$7f9o, 百拇医药
0.063±0.001e$7f9o, 百拇医药
0.071±0.006e$7f9o, 百拇医药
0.073±0.009e$7f9o, 百拇医药
four separately experiment results(n＝4)e$7f9o, 百拇医药
3.4 抗C5aR(9～30)短肽McAb亲和常数 经ELISA测定，达到最大结合50%所需E3腹水McAb浓度为4×10-6mol/L，按HEYINGEN等的方法E3 McAb的亲和常数Ka＝2.5×105。
3.5 抗C5aR(9～30)短肽McAb结合表位分析 已知anti-C5aR McAb(克隆号S5/1)的表位是C5aR第15～21位氨基酸基序D15DKDT20L，在1∶8 000的工作浓度时便可达饱和，E3腹水在1∶1 000时可达到饱和，在此工作浓度下各取50%混匀后，结果见表2。表2 杂交瘤细胞E3与S5/1单抗的表位对比分析am, 百拇医药
Tab 2 Analysis of epitope specific S5/l and E3 hybridomaam, 百拇医药
A490am, 百拇医药
AIam, 百拇医药
S5/1am, 百拇医药
0.964am, 百拇医药
E3am, 百拇医药
1.300am, 百拇医药
S5/1+E3am, 百拇医药
1.253am, 百拇医药
10.69%am, 百拇医药
如果两种抗体结合同一表位，即它们具有相同的特异性，那么A1+2应为A1+A2之和的平均值，AI值则为0；相反，若两种抗体结合不同的表位，那么A1+2应为A1+A2之总和，AI值应为100%。所以AI值都在0～1之间变化。后来，FRIGUET等将AI<25%的列为两种抗体识别同一表位；AI>40%则列为识别不同的表位。本结果AI＝10.69%<25%，可将E3分泌的McAb判定为与S5/1识别C5aR分子同一表位，即C5aR第15～21位氨基酸序列D15DKDT20L。am, 百拇医药
3.6 抗C5aR(9～30)短肽McAb中和抑制试验 将P22和C20稀释成20 ng/ml，分别将之稀释E3腹水和培养上清，ELISA结果如表3。表3 E3抗体中和抑制试验am, 百拇医药
Tab 3 Results of neutralizating inhibition of the McAbderived from E3 hybridoma
E3j, 百拇医药
OD490j, 百拇医药
uninhibitedj, 百拇医药
inhibited by P22j, 百拇医药
inhibited by C20j, 百拇医药
Supernatantj, 百拇医药
1.357±0.050j, 百拇医药
0.563±0.023(58.51%)j, 百拇医药
1.268±0.075j, 百拇医药
Ascitesj, 百拇医药
2.088±0.106j, 百拇医药
0.741±0.031(64.51%)j, 百拇医药
1.980±0.093j, 百拇医药
4 讨论j, 百拇医药
人工合成多肽作为免疫物质具有诸多优点，首先是纯度高，其次就是容易获取。但是合成多肽必须要有意义，至少应为B细胞的一个表位或多个表位序列。合成多肽分子量小，抗原性弱，提高其免疫原性和抗原性是成功制备单克隆抗体的关键所在。国内、外同行在提高合成多肽抗原性方面作了许多有益的尝试[7～9]，OPPERMANN[10]等曾将C5aR第1～31位(Ex1)、第15～17位(Ex1L)、第15～21位(Ex1S)、第95～110位(Ex2)、第175～206位(Ex3)、第265～282位(Ex4)、第227～242位以及第303～350位(IN4)的氨基酸序列予以人工合成，并在Ex1、Ex4的C-端增加一个Cys，便于将载体蛋白KLH或BSA偶联上，增加多肽的抗原性，他们发现12/15 mol的多肽可偶联1.0 ml的BSA，分别以150 μg和100 μg的多肽-BSA免疫家兔和小鼠。结果发现在小鼠的69个多肽特异性单抗中有6个能特异性结合C5aR蛋白。Ex1～Ex4短肽单克隆抗体可直接结合在C5aR+细胞表面，而抗C5aR C-末端序列的单抗(anti-IN4)只有在去污剂将细胞膜破坏后才能结合C5aR分子，说明IN4是C5aR的胞内结构域。Ex1～Ex4对糜蛋白酶的敏感性试验也证实了以上结论。国内有人[7]将合成多肽与甲状腺球蛋白通过碳化二亚胺偶联制备多肽-甲状腺球蛋白偶联物以后免疫小鼠，但在筛选阳性克隆时本底较高，甚至所得到的杂交瘤细胞分泌单抗的效价不高。将多肽与沙门氏裸菌偶联作免疫原，可取得良好的免疫效果[8]，但细菌胞壁脂蛋白、类脂A、外膜蛋白均对B细胞有刺激效应，可能产生交叉应答，对阳性株的筛选带来一定困难。P22多肽的固相合成首先将Ser-COOH与HMP-树脂的苯甲醇羟基形成酯键，使之连接在固相载体上，肽链延伸时，氨基酸残基-NH2端受Fmoc保护以防止-NH2与-COOH形成酰胺键。与此同时，部分氨基酸残基的侧链也受到保护，最后生成的多肽由于N-端的Fmoc、C-端的HMP-树脂及部分氨基酸侧链的保护基团，使其在分子结构上更为复杂，可缓慢释放免疫原，在体内延长了抗原暴露的时间，可能是增强免疫效果的原因之一。
OPPERMANN等还通过C5aR合成多肽免疫Balb/c小鼠成功地制作了anti-C5aR McAb(S5/1)和W17/1，所针对的表位为C5aR第15～21位氨基酸残基[10]。MORGAN等也用C5aR(9～29)短肽的多克隆抗体进行体外研究，证实抗C5aR(9～29)抗体能有效和特异地阻断C5a对PMN的趋化及溶酶体的释放，并能阻断单核细胞表达IL-6、IL-8，此抗体通过干扰C5a与C5aR的结合而实现其封闭作用[11]。本次实验在对C5aR序列结构分析基础上预测的B细胞表位，并以此作为免疫原获得了针对该表位的单克隆抗体，这对有关C5a-C5aR相互作用的研究提供了理想的实验材料，对C5a相关疾病的诊断和体内外试验奠定了物质基础。k7(., 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39770315)k7(., 百拇医药
[作者简介] 吕凤林(1964-)，男，四川隆昌县人，讲师，博士，主要从事C5a-C5aR相互作用机理的研究。现在第三军医大学野战外科研究所(大坪医院)一室工作。k7(., 百拇医药
[参考文献]k7(., 百拇医药
[1] SCHIEFERDECKER HL，ROTHERMEL E，TIMMERMANN A，et al.Anaphylatoxin C5a receptor mRNA is strongly expressed in kupffer and stellate cells and weakly in sinusoidal endothelial cells but not in hepatocytes of normal rat liver[J].FEBS Lett，1997，14(3)：305-309.k7(., 百拇医药
[2] 吕凤林，朱锡华，人C5a(CD88)序列结构分析及其B细胞表位预测[J].免疫学杂志，1998，14(3)：153-156.k7(., 百拇医药
[3] 厉广坤，王应雄，丁显平，等.实用人类染色体技术与临床[M].重庆：西南师范大学出版社，1994.10-35.k7(., 百拇医药
[4] FRIGUET B，CHAFFOTTE AF，DJAVADI OHANIANCE L，et al.Measurements of the true constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Immunol Methods，1985，77(2)：305-310.
[5] FRIGUET B，DJAVADI-OHANIANCE L，PAGES J，et al.A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site.Application to hybridomas specific for the β2-subunit of Escherichia coli tryptophan synthase[J].J Immunol Methods，1983，60(2)：351-358.^x^hwv/, 百拇医药
[6] HEYINGEN VV，BROCK DJH，HEYNINGEN SU，et al.A simple methods for ranking the affinities of monoclonal antibody[J].J Immunol Methods，1983，62(1)：147-153.^x^hwv/, 百拇医药
[7] 刘顺爱，毕无邪，杨贵贞.一种新的免疫方法制备抗NPY单克隆抗体[J].中国免疫学杂志，1995，11(1)：92-95.^x^hwv/, 百拇医药
[8] BELLSTEDT DU，HUMAN PA，ROWTAND GF，et al.Acid-treated，naked bacteria as immune carriers for protein antigen[J].J Immunol Methods，1987，98(2)：249-253.^x^hwv/, 百拇医药
[9] 鲍永利，富 宁，于春雷，等.交叉反应性抗类脂A单克隆抗体的制备及初步鉴定[J].免疫学杂志，1998，14(1)：22-24.^x^hwv/, 百拇医药
[10] OPPERMANN M，GOTZE O.Plasma clearance of the human C5a anaphylatoxin by binding to leukocyte C5a receptors[J].Immunology，1994，82(4)：516-521.^x^hwv/, 百拇医药
[11] MORGAN EL，EMBER JA，SANDERSON SD，et al. Anti-C5a receptor antibodies：characterization of neutralizing antibodies specific for a peptide，C5aR(9～29)，derived from he predicted amino-terminal sequence of the human C5a receptor[J].J Immunol，1993，377(5)：1 515-1 522.^x^hwv/, 百拇医药
[收稿日期] 1999-10-26； [修回日期] 2000-01-07(吕凤林 郑萍 朱锡华)
单位：吕凤林(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；郑萍(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；朱锡华(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)t?&v+, 百拇医药
关键词：单克隆抗体；C5a受体；表位多肽t?&v+, 百拇医药
免疫学杂志000416 [摘 要] 目的 获得有生物功能的小鼠抗人C5aR短肽单克隆抗体。方法 对C5a受体(CD88)二级结构和B细胞表位进行分析研究，采用Fmoc方案固相合成C5aR N-端第9～30位氨基酸残基的22-肽，以此为抗原免疫Balb/c小鼠。结果 建立了1株小鼠抗人C5aR短肽杂交瘤细胞系E3，其平均染色体数目为102条，所分泌抗体为IgG1，κ型，腹水抗体效价为1×10-4～1×10-6，可识别U937、人脐静脉内皮细胞(VEC)和PMN等表达C5aR细胞。E3单抗的亲和常数Ka＝2.5×105，其结合表位为C5aR第15～21位氨基酸基序D15DKDTL20D。结论 B细胞表位多肽具有免疫原性，可制作单克隆抗体，为C5a-C5aR相互作用的研究以及ALI、ARDS等C5a相关疾病的研究提供实验材料。t?&v+, 百拇医药
[中图分类号] R392-33 [文献标识码] At?&v+, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)04-0294-04t?&v+, 百拇医药
Production and characterization of the monoclonal antibody against C5a anaphylatoxins recepter(CD88)t?&v+, 百拇医药
LU Feng-lin， ZHENG Ping，ZHU Xi-huat?&v+, 百拇医药
(Institute of Immunology PLA，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)t?&v+, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate the production and characterization of the monoclonal antibody against C5a anaphylatoxin receptor(CD88).Methods Based on the relationship between the secondary structure and it’s functions of the C5a anaphylatoxin receptor(CD88)，the predominant B-cell epitope of the C5aR was designed on the computers.Position 9～30 of the C5aR，called as P22 was synthesized using fluorenyl-methoxy-carbon y1-protected，benzotriazol-l-Yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hezafluorophosphate-activated amino acids and an automatic peptide synthesizer.Peptide purity was confirmed by HPLC and identification by caplilliary electrophoresis.The purity of the P22 was 95.19%.McAb generated from hybridoma E3 with specificity for the C5aR(9～30) was obtained by the i.p.immunization of Balb/c mice with 100 μg of P22-conjugate in CFA.The culture supernatants of the hybridoma E3 were secreted by solid-phase ELISA techniques employing the C5aR(9～30)peptide，the peptide-specific McAb was purified by immunoaffinity chromatography on peptide resin columns.Results The titers of this McAb in culture supernatants and ascites fluid were 1∶32～1∶128，1∶10-4～1∶10-6，respectively.Results from western blotting using reducing agent suggest E3 reacts to a 45 kd bland.The affinity contents of the E3 was 2.5×105.Conclusion The peptide of the B-cell epifope of the C5aR has it’s immunoantigence. It could be used to produce mono-clonal antibodies.It is also important for studying the interactions between C5a and C5aR，and for ALI，ARDS.
[Key words] monoclonal antibody；C5a receptor(CD88)；epitope peptideso8%5k, 百拇医药
C5a受体(CD88)广泛分布于多种类型细胞，C5a与C5aR特异结合后介导多种生理、病理反应，如C5a可不依赖组胺致平滑肌细胞痉挛[1]；调节肝细胞急性期蛋白的合成；促进星形胶质细胞合成分泌补体成分等。深入研究C5a-C5aR相互作用机制需特定的实验材料，基于这一目的，在C5aR之B细胞表位预测的基础上[2]，人工合成C5aR(9～30)表位多肽P22，以此为免疫原制备了1株小鼠抗人C5aR短肽单克隆抗体。o8%5k, 百拇医药
1 材料o8%5k, 百拇医药
1.1 试剂 RPMI 1640、NC膜(gibco)、次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)、氨基喋呤(A)、PEG(MW3400)DMSO均购自Sigma公司，anti-hC5aR McAb(S5/1)购自SEROTIC公司，HRP-山羊抗小鼠IgG，购自华美公司。小鼠Ig类与亚类检测试剂盒IsostripTMkit购自BM公司。C20为合成的随机对照20-肽，酶联检测(ELISA)试剂均为国产分析纯。o8%5k, 百拇医药
1.2 动物及细胞株 Balb/c纯系小鼠，6～8周龄，雌性，购自军事医学科学院实验动物中心。SP2/0小鼠骨髓瘤细胞株为本室保存。o8%5k, 百拇医药
1.3 仪器设备 细胞培养常规仪器设备为Bio-Rad3550型酶标自动检测仪。o8%5k, 百拇医药
2 方法o8%5k, 百拇医药
2.1 小鼠抗人C5aR短肽(9～30)McAb的产生o8%5k, 百拇医药
2.1.1 免疫原：将受Fmoc树脂保护的合成多肽与等体积的福氏完全佐剂充分乳化。抗原用量100 μg/只。第15、29 d再次免疫。融合前3 d用纯化多肽按150 μg/只作腹腔注射。o8%5k, 百拇医药
2.1.2 细胞融合：常规收集免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞按10∶1的比例以50% PEG进行融合。HAT培养液选择培养，融合后10～15 d取上清行ELISA筛选。o8%5k, 百拇医药
2.1.3 阳性克隆的ELISA筛选：P22按20 ng/ml的工作浓度包被酶联板，免疫小鼠血清1∶10作阳性对照，SP2/0培养上清和正常小鼠血清作阴性对照，加1∶1 000 HRP-山羊抗小鼠IgG，100 μl/孔，最后测定OD490值。凡OD490值大于阴性对照(SP2/0细胞培养上清)2倍以上者，初步判定为阳性克隆。
2.1.4 克隆化及亚克隆化：将初步筛选的阳性克隆E3杂交瘤作有限稀释，进行4次亚克隆。jo?%@, 百拇医药
2.1.5 制备小鼠腹水和纯化抗体常规方法：jo?%@, 百拇医药
2.2 小鼠抗人C5aR(9～30)短肽McAb的鉴定jo?%@, 百拇医药
2.2.1 ELISA方法：同2.1.3。jo?%@, 百拇医药
2.2.2 核型分析：参照文献[3]。jo?%@, 百拇医药
2.2.3 Ig类与亚类鉴定：按BM公司生产的IsostripTM试剂盒说明进行。jo?%@, 百拇医药
2.2.4 抗人C5aR(9～30)短肽McAb亲和常数测定：参考HEYINGEN等[4]的方法，即间接ELISA法测定P22-McAb反应曲线，在曲线上找出最大结合50%的McAb浓度(mol/L)，亲和常数(Ka)则为McAb浓度的倒数。jo?%@, 百拇医药
2.2.5 抗人C5aR(9～30)短肽McAb结合表位分析：用非标记ELISA相加试验，参照文献[5，6]。jo?%@, 百拇医药
2.2.6 小鼠抗人C5aR(9～30)短肽McAb中和抑制试验：20 ng/ml P22包被酶联板，分别用含20 ng/ml P22和20 ng/ml C20的稀释液将E3腹水作1∶100、E3培养上清作1∶5稀释，对照组仅用PBS-T稀释，在37 °C下作用2 h，加入100 ul/孔 4 °C过夜，ELISA法检测被中和的E3抗体。jo?%@, 百拇医药
3 结果jo?%@, 百拇医药
3.1 杂交瘤细胞系的建立 以人工合成短肽C5aR(9～30)P22为免疫原，先后免疫Balb/c小鼠25只，共融合7次，成功4次，从384孔中得到346孔阳性克隆，融合率达90.10%，经四次亚克隆和ELISA筛选，得到1株杂交瘤E3，第16代E3的上清和腹水经间接ELISA法测定上清效价为1∶32～1∶128，腹水效价为1×10-4～1×10-6。E3分泌的抗体类型为IgG1，κ型。jo?%@, 百拇医药
3.2 E3染色体组型分析 见图1：杂交瘤细胞E3的染色体数目平均为102，既有端部着丝点染色体，又有中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体。说明E3为小鼠脾细胞与SP2/0细胞的融合体。
图1杂交瘤细胞E3的染色体组型e$7f9o, 百拇医药
Fig 1The chromosomal morphology of the hybridoma E3e$7f9o, 百拇医药
3.3 E3可识别C5aR+细胞 将U937细胞、人脐静脉内皮细胞(VEC)和PMN细胞培养在酶联板中，调整细胞数105/孔，取E3腹水按1∶1 000的工作浓度ELISA测定，结果见表1。e$7f9o, 百拇医药
表1 杂交瘤细胞E3识别的细胞种类e$7f9o, 百拇医药
Tab 1 The cell types be recognized by E3 concentratione$7f9o, 百拇医药
of ascites(10-3)e$7f9o, 百拇医药
U937e$7f9o, 百拇医药
VECe$7f9o, 百拇医药
PMNe$7f9o, 百拇医药
E3e$7f9o, 百拇医药
2.031±0.16e$7f9o, 百拇医药
1.976±0.01e$7f9o, 百拇医药
2.135±0.012e$7f9o, 百拇医药
SP2/0e$7f9o, 百拇医药
0.063±0.001e$7f9o, 百拇医药
0.071±0.006e$7f9o, 百拇医药
0.073±0.009e$7f9o, 百拇医药
four separately experiment results(n＝4)e$7f9o, 百拇医药
3.4 抗C5aR(9～30)短肽McAb亲和常数 经ELISA测定，达到最大结合50%所需E3腹水McAb浓度为4×10-6mol/L，按HEYINGEN等的方法E3 McAb的亲和常数Ka＝2.5×105。
3.5 抗C5aR(9～30)短肽McAb结合表位分析 已知anti-C5aR McAb(克隆号S5/1)的表位是C5aR第15～21位氨基酸基序D15DKDT20L，在1∶8 000的工作浓度时便可达饱和，E3腹水在1∶1 000时可达到饱和，在此工作浓度下各取50%混匀后，结果见表2。表2 杂交瘤细胞E3与S5/1单抗的表位对比分析am, 百拇医药
Tab 2 Analysis of epitope specific S5/l and E3 hybridomaam, 百拇医药
A490am, 百拇医药
AIam, 百拇医药
S5/1am, 百拇医药
0.964am, 百拇医药
E3am, 百拇医药
1.300am, 百拇医药
S5/1+E3am, 百拇医药
1.253am, 百拇医药
10.69%am, 百拇医药
如果两种抗体结合同一表位，即它们具有相同的特异性，那么A1+2应为A1+A2之和的平均值，AI值则为0；相反，若两种抗体结合不同的表位，那么A1+2应为A1+A2之总和，AI值应为100%。所以AI值都在0～1之间变化。后来，FRIGUET等将AI<25%的列为两种抗体识别同一表位；AI>40%则列为识别不同的表位。本结果AI＝10.69%<25%，可将E3分泌的McAb判定为与S5/1识别C5aR分子同一表位，即C5aR第15～21位氨基酸序列D15DKDT20L。am, 百拇医药
3.6 抗C5aR(9～30)短肽McAb中和抑制试验 将P22和C20稀释成20 ng/ml，分别将之稀释E3腹水和培养上清，ELISA结果如表3。表3 E3抗体中和抑制试验am, 百拇医药
Tab 3 Results of neutralizating inhibition of the McAbderived from E3 hybridoma
E3j, 百拇医药
OD490j, 百拇医药
uninhibitedj, 百拇医药
inhibited by P22j, 百拇医药
inhibited by C20j, 百拇医药
Supernatantj, 百拇医药
1.357±0.050j, 百拇医药
0.563±0.023(58.51%)j, 百拇医药
1.268±0.075j, 百拇医药
Ascitesj, 百拇医药
2.088±0.106j, 百拇医药
0.741±0.031(64.51%)j, 百拇医药
1.980±0.093j, 百拇医药
4 讨论j, 百拇医药
人工合成多肽作为免疫物质具有诸多优点，首先是纯度高，其次就是容易获取。但是合成多肽必须要有意义，至少应为B细胞的一个表位或多个表位序列。合成多肽分子量小，抗原性弱，提高其免疫原性和抗原性是成功制备单克隆抗体的关键所在。国内、外同行在提高合成多肽抗原性方面作了许多有益的尝试[7～9]，OPPERMANN[10]等曾将C5aR第1～31位(Ex1)、第15～17位(Ex1L)、第15～21位(Ex1S)、第95～110位(Ex2)、第175～206位(Ex3)、第265～282位(Ex4)、第227～242位以及第303～350位(IN4)的氨基酸序列予以人工合成，并在Ex1、Ex4的C-端增加一个Cys，便于将载体蛋白KLH或BSA偶联上，增加多肽的抗原性，他们发现12/15 mol的多肽可偶联1.0 ml的BSA，分别以150 μg和100 μg的多肽-BSA免疫家兔和小鼠。结果发现在小鼠的69个多肽特异性单抗中有6个能特异性结合C5aR蛋白。Ex1～Ex4短肽单克隆抗体可直接结合在C5aR+细胞表面，而抗C5aR C-末端序列的单抗(anti-IN4)只有在去污剂将细胞膜破坏后才能结合C5aR分子，说明IN4是C5aR的胞内结构域。Ex1～Ex4对糜蛋白酶的敏感性试验也证实了以上结论。国内有人[7]将合成多肽与甲状腺球蛋白通过碳化二亚胺偶联制备多肽-甲状腺球蛋白偶联物以后免疫小鼠，但在筛选阳性克隆时本底较高，甚至所得到的杂交瘤细胞分泌单抗的效价不高。将多肽与沙门氏裸菌偶联作免疫原，可取得良好的免疫效果[8]，但细菌胞壁脂蛋白、类脂A、外膜蛋白均对B细胞有刺激效应，可能产生交叉应答，对阳性株的筛选带来一定困难。P22多肽的固相合成首先将Ser-COOH与HMP-树脂的苯甲醇羟基形成酯键，使之连接在固相载体上，肽链延伸时，氨基酸残基-NH2端受Fmoc保护以防止-NH2与-COOH形成酰胺键。与此同时，部分氨基酸残基的侧链也受到保护，最后生成的多肽由于N-端的Fmoc、C-端的HMP-树脂及部分氨基酸侧链的保护基团，使其在分子结构上更为复杂，可缓慢释放免疫原，在体内延长了抗原暴露的时间，可能是增强免疫效果的原因之一。
OPPERMANN等还通过C5aR合成多肽免疫Balb/c小鼠成功地制作了anti-C5aR McAb(S5/1)和W17/1，所针对的表位为C5aR第15～21位氨基酸残基[10]。MORGAN等也用C5aR(9～29)短肽的多克隆抗体进行体外研究，证实抗C5aR(9～29)抗体能有效和特异地阻断C5a对PMN的趋化及溶酶体的释放，并能阻断单核细胞表达IL-6、IL-8，此抗体通过干扰C5a与C5aR的结合而实现其封闭作用[11]。本次实验在对C5aR序列结构分析基础上预测的B细胞表位，并以此作为免疫原获得了针对该表位的单克隆抗体，这对有关C5a-C5aR相互作用的研究提供了理想的实验材料，对C5a相关疾病的诊断和体内外试验奠定了物质基础。k7(., 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39770315)k7(., 百拇医药
[作者简介] 吕凤林(1964-)，男，四川隆昌县人，讲师，博士，主要从事C5a-C5aR相互作用机理的研究。现在第三军医大学野战外科研究所(大坪医院)一室工作。k7(., 百拇医药
[参考文献]k7(., 百拇医药
[1] SCHIEFERDECKER HL，ROTHERMEL E，TIMMERMANN A，et al.Anaphylatoxin C5a receptor mRNA is strongly expressed in kupffer and stellate cells and weakly in sinusoidal endothelial cells but not in hepatocytes of normal rat liver[J].FEBS Lett，1997，14(3)：305-309.k7(., 百拇医药
[2] 吕凤林，朱锡华，人C5a(CD88)序列结构分析及其B细胞表位预测[J].免疫学杂志，1998，14(3)：153-156.k7(., 百拇医药
[3] 厉广坤，王应雄，丁显平，等.实用人类染色体技术与临床[M].重庆：西南师范大学出版社，1994.10-35.k7(., 百拇医药
[4] FRIGUET B，CHAFFOTTE AF，DJAVADI OHANIANCE L，et al.Measurements of the true constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Immunol Methods，1985，77(2)：305-310.
[5] FRIGUET B，DJAVADI-OHANIANCE L，PAGES J，et al.A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site.Application to hybridomas specific for the β2-subunit of Escherichia coli tryptophan synthase[J].J Immunol Methods，1983，60(2)：351-358.^x^hwv/, 百拇医药
[6] HEYINGEN VV，BROCK DJH，HEYNINGEN SU，et al.A simple methods for ranking the affinities of monoclonal antibody[J].J Immunol Methods，1983，62(1)：147-153.^x^hwv/, 百拇医药
[7] 刘顺爱，毕无邪，杨贵贞.一种新的免疫方法制备抗NPY单克隆抗体[J].中国免疫学杂志，1995，11(1)：92-95.^x^hwv/, 百拇医药
[8] BELLSTEDT DU，HUMAN PA，ROWTAND GF，et al.Acid-treated，naked bacteria as immune carriers for protein antigen[J].J Immunol Methods，1987，98(2)：249-253.^x^hwv/, 百拇医药
[9] 鲍永利，富 宁，于春雷，等.交叉反应性抗类脂A单克隆抗体的制备及初步鉴定[J].免疫学杂志，1998，14(1)：22-24.^x^hwv/, 百拇医药
[10] OPPERMANN M，GOTZE O.Plasma clearance of the human C5a anaphylatoxin by binding to leukocyte C5a receptors[J].Immunology，1994，82(4)：516-521.^x^hwv/, 百拇医药
[11] MORGAN EL，EMBER JA，SANDERSON SD，et al. Anti-C5a receptor antibodies：characterization of neutralizing antibodies specific for a peptide，C5aR(9～29)，derived from he predicted amino-terminal sequence of the human C5a receptor[J].J Immunol，1993，377(5)：1 515-1 522.^x^hwv/, 百拇医药
[收稿日期] 1999-10-26； [修回日期] 2000-01-07(吕凤林 郑萍 朱锡华)