IL-1受体相关激酶-1和-2协同调控IL-1诱导的AP-1活化
作者：郭甫坤 吴曙光j&vl, 百拇医药
单位：郭甫坤(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)；吴曙光(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)j&vl, 百拇医药
关键词：白介素-1；白介素-1受体相关激酶；反义寡核苷酸；AP-1j&vl, 百拇医药
免疫学杂志000403 [摘 要] 目的 研究白介素-1受体相关激酶-1(IRAK-1)和IRAK-2在白介素-1(IL-1)诱导AP-1活化中的作用。方法 Lipofectin介导反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸转染HepG2细胞。用逆转录PCR法检测IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达水平；Western blot分析IRAK-1和IRAK-2蛋白表达水平。以Sandwich ELISA法检测AP-1的活化。结果 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸通过抑制各自靶基因mRNA和蛋白表达抑制IL-1诱导的AP-1活化；反义IRAK-1寡核苷酸与反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞对AP-1的抑制作用较两者单独转染明显增强。结论 IRAK-1和IRAK-2在调控白介素-1诱导的AP-1活化时协同作用。j&vl, 百拇医药
[中图分类号] R392.11 [文献标识码] Aj&vl, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)04-0250-04j&vl, 百拇医药
IL-1 receptor associated kinase-1 and -2 synergistically activate AP-1j&vl, 百拇医药
GUO Fu-kun， WU Shu-guangj&vl, 百拇医药
(Institute of Pharmaceutic Sciences， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China)j&vl, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate whether interleukin-1 receptor associated kinase-1 (IRAK-1) and IRAK-2 are functionally combined or redundant but differentially expressed in interleukin-1(IL-1)-induced activator protein-1(AP-1) activation. Methods Phosphorothioate oligonucleotides(ODN) were designed antisense to sequences of IRAK-1 or IRAK-2. Antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells. IRAK-1 and IRAK-2 mRNA expression were assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR. IRAK-1 and IRAK-2 protein expression were detected by western blot. The levels of activator protein-1(AP-1) were measured by sandwich ELISA. Results Antisense IRAK-1 ODN and antisense IRAK-2 ODN blocked IRAK-1 and IRAK-2 expression， respectively. As a result， antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN inhibited IL-1-induced AP-1 activation. Cotransfection of antisense IRAK-1 ODN 4 μg with antisense IRAK-2 ODN 4 μg resulted in an additive inhibition of AP-1 activation. Conclusion IRAK-1 regulates IL-1-stimulated AP-1 activation in cooperation with IRAK-2.
[Key words] interleukin-1； interleukin-1 receptor associated kinase； antisense oligonucleotide； activator protein-1se}t, 百拇医药
白介素-1(IL-1)是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明：IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB(NF-κB)和AP-1调控[1，2]。因此，阐明IL-1活化NF-κB和AP-1的机制具有重要的理论和临床应用价值。IL-1刺激信号由其I型受体(IL-1RI)转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RI没有内在的蛋白激酶活性[3]，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-1(IRAK-1)和IRAK-2就属于这样的蛋白激酶[4，5]。IRAK-1和RAK-2都能通过下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)激活NF-κB和AP-1[5，6]。我们最近的研究表明：IRAK-1和IRAK-2在调控NF-κB活化时协同作用，但是，目前还不清楚它们是否协同调控AP-1活化，本文对此进行了探讨。se}t, 百拇医药
1 材料与方法se}t, 百拇医药
1.1 细胞系和试剂 人肝癌细胞系HepG2细胞从ATCC公司购买；DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊c-Fos p62特异性抗体(抗原表位相应于人源c-Fos p62 N端)、兔c-Fos p62 特异性抗体(抗原表位相应于人源c-Fos p62 C端)和山羊IRAK-1特异性抗体由美国Santa CruZ生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA分离试剂盒和逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒为Promega公司产品。兔IRAK-2特异性抗体由美国MMRTA MUZIO博士惠赠。se}t, 百拇医药
1.2 方法se}t, 百拇医药
1.2.1 细胞培养：HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于37 °C，5% CO2条件下培养至汇合成片。se}t, 百拇医药
1.2.2 寡核苷酸的序列及合成：反义IRAK-1寡核苷酸序列：5’-CCCCCCGGCCATGGCTGC-3’；正义IRAK-1寡核苷酸序列：5’-GCAGCCATGGCCGGGGGG-3’。反义IRAK-2寡核苷酸序列：5’-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3’；正义IRAK-2寡核苷酸序列：5’-ATGGCCTGCTACATCTAC-3’。寡核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成。寡核苷酸的5’端和3’端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义寡核苷酸序列与靶序列一致。反义寡核苷酸序列与靶序列互补。
1.2.3 Lipofectin包裹寡核苷酸的制备：参照lipofectin说明书操作。4p8e, 百拇医药
1.2.4 RT-PCR法测定IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达：汇合成片的HepG2细胞用IL-1 β 100 U/ml刺激30 min，洗去IL-1 β， IRAK-1实验组分别加入正义IRAK-1寡核苷酸4 μg和反义IRAK-1寡核苷酸4 μg；IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2寡核苷酸4 μg和反义IRAK-2寡核苷酸4 μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8 h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件(VILBER LOURMAT公司)定量。IRAK-1 5’端引物为：5’-ACTTCTTGTACGAGGTGCCGCC-3’；3’端引物为：5’-GGGCAGGCCTGGGTCTGGCAGT-3’。IRAK-2 5’端引物为：5’-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3’端引物为：5’-CCAGCACAGGTAAGACATTGG-3’。内参照β-actin 5’端引物为5’-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；3’端引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(由上海生工生物工程有限公司合成)。重复实验3次。4p8e, 百拇医药
1.2.5 Western杂交分析IRAK-1和IRAK-2蛋白表达水平：细胞用IL-1β和寡核苷酸处理的条件同1.2.4。细胞与寡核苷酸孵育8 h后，洗去寡核苷酸，进行Western杂交[7]并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件(VILBER LOURMAT公司)定量。重复实验3次。4p8e, 百拇医药
1.2.6 Sandwich ELISA法测定AP-1：按ROVIN等人的方法提取细胞核蛋白[8]，用Sandwich ELISA法测定AP-1[9]。重复实验3次。4p8e, 百拇医药
1.2.7 数据分析：实验数据以
±s表示，采用t检验进行统计学分析。4p8e, 百拇医药
2 结果4p8e, 百拇医药
2.1 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达的影响 以IRAK-1和IRAK-2 PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin PCR产物吸收峰体积的比值反映反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸对各自靶基因表达的影响。结果表明：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达(与对照组相比，P<0.01)，而正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸都不能抑制靶基因表达(见图1)。
图1A：反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1 mRNA表达的影响(与对照组比较， P<0.01)； B：反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2 mRNA表达的影响(与对照组比较， P<0.01)k%@3, 百拇医药
Fig 1A：effect of antisense IRAK-1 ODN on IRAK-1 mRNA expression(compared to control， P<0.01)， B：effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 mRNA expression (compared to control， P<0.01)k%@3, 百拇医药
S-1：sense IRAK-1 ODN，S-2：sense IRAK-2 ODN，AS-1：antisense IRAK-1 ODN，AS-2：antisense IRAK-2 ODN，bp：base pair，V：volume of peakk%@3, 百拇医药
2.2 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2蛋白表达的影响 Western杂交分析结果显示：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2蛋白表达，抑制率分别为71.8%±4.2%和45%±6.1%。正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸无抑制作用(见图2)。
k%@3, 百拇医药
图2A：反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1蛋白表达的影响； B：反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2蛋白表达的影响k%@3, 百拇医药
Fig 2A： effect of antisense IRAK-1 ODN on IRAK-1 protein expression， B： effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 protein expressionk%@3, 百拇医药
S-1：sense IRAK-1 ODN， S-2：sense IRAK-2 ODN， AS-1：antisense IRAK-1 ODN，AS-2：antisense IRAK-2 ODN，C：controlk%@3, 百拇医药
2.3 反义IRAK-1寡核苷酸对AP-1活化的影响 汇合成片的细胞用IL-1 β 100 U/ml刺激30 min，洗去IL-1 β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-1寡核苷酸孵育8 h，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1 h。同时设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-1寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-1寡核苷酸)。提取各组细胞核蛋白，检测AP-1水平。结果表明：反义IRAK-1寡核苷酸呈剂量依赖性地抑制AP-1活化。4 μg反义IRAK-1寡核苷酸的抑制作用最强，AP-1的吸光度值从对照组的2.154±0.013降至0.983±0.011，抑制率为54.4%±0.5%(见图3)。但是此时的AP-1活性仍远高于基础AP-1水平(AP-1基础水平值为0.163±0.011)(见图3)，说明反义IRAK-1寡核苷酸不能完全抑制AP-1活化。
图3反义IRAK-1寡核苷酸对AP-1活化的影响], http://www.100md.com
Fig 3Effect of antisense IRAK-1 ODN on AP-1 activation], http://www.100md.com
AS-1：antisense IRAK-1 ODN], http://www.100md.com
2.4 反义IRAK-2寡核苷酸对AP-1活化的影响 汇合成片的细胞用IL-1β 100 U/ml刺激30 min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸孵育8 h，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1 h。同时设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-2寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-2寡核苷酸)。提取各组细胞核蛋白，检测AP-1水平。结果表明：反义IRAK-2寡核苷酸呈剂量依赖性地抑制AP-1活化。当4 μg反义IRAK-2寡核苷酸与HepG2细胞共孵育8 h时，AP-1的吸光度值降幅最大，抑制率达59.7%±0.4%。然而，与反义IRAK-1寡核苷酸类似，反义IRAK-2寡核苷酸对AP-1的抑制不完全(见图4)。
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图4反义IRAK-2寡核苷酸对AP-1活化的影响], http://www.100md.com
Fig 4Effect of antisense IRAK-2 ODN on AP-1 activation], http://www.100md.com
AS-2：antisense IRAK-2 ODN], http://www.100md.com
2.5 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染对AP-1活化的影响 将4 μg反义IRAK-1寡核苷酸和4 μg反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞，检测AP-1水平。结果达69.5%±0.9%的AP-1活性被抑制(见图5)。
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图5反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染对AP-1活化的影响], http://www.100md.com
Fig 5Effect of cotransfection of antisense IRAK-1 ODN with antisense IRAK-2 ODN on NF-κB activation
AS-1：antisense IRAK-1 ODN；AS-2：antisense IRAK-2 ODN[]am, http://www.100md.com
3 讨论[]am, http://www.100md.com
本研究发现，反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸单独转染HepG2细胞部分抑制AP-1活化，而反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染产生累积抑制效应。结果表明：IRAK-1和IRAK-2各自都能调控IL-1诱导的AP-1活化，但都不足以激活AP-1，IRAK-1和IRAK-2在调控AP-1活化时协同作用。[]am, http://www.100md.com
反义寡核苷酸特异性抑制靶基因的转录和/或翻译，因而不但有潜在的临床应用价值，而且在理论研究上有重要意义。反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达，而对看家基因β-actin mRNA表达无抑制作用(见图1)，证明反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸作用特异。进一步研究发现：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸亦能分别抑制IRAK-1和IRAK-2蛋白表达(P<0.01)(见图2)。因此，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸可分别作为IRAK-1和IRAK-2表达的特异性抑制剂。[]am, http://www.100md.com
反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1表达的抑制导致IL-1诱导的AP-1活化被抑制,但抑制不完全(见图3)，说明IRAK-1是AP-1活化必要但不充分的条件。由于IRAK家族另一成员IRAK-2具有与IRAK-1相似的作用(见图4)，故IRAK-1和IRAK-2很可能协同激活AP-1。此推测为共转染实验所证实：与反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，两者共转染细胞对AP-1的抑制作用明显增强(见图5)。但是，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染后AP-1活性仍未降至基础水平(P<0.01)(见图5)，提示还可能存在别的蛋白激酶与IRAK-1和IRAK-2一起调控AP-1活化。[]am, http://www.100md.com
IRAK-1和IRAK-2之间关系的澄清可为抑制IL-1的炎症反应提供理论指导。但是，IRAK-1和IRAK-2协同作用的分子机制有待阐明。另外，由于IL-1信号转导极其复杂，IRAK-1和IRAK-2在激活AP-1时的协同作用是否存在于其它细胞和体内也需证实。[]am, http://www.100md.com
[作者简介] 郭甫坤(1971-)，男，重庆开县人，博士研究生，主要从事免疫药理学的研究。
[参考文献]u, 百拇医药
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[6] O’NEILL LAJ，GREENE C. Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor family：ancient signaling machinery in mammals， insects， and plants[J]. J Leukoc Biol， 1998，63(6)：650-657.u, 百拇医药
[7] D’ACQUISTO F， IUVONE T， ROMBOLA L， et al. Involvement of NF-κB in the regulation of cyclooxygenase-2 protein expression in LPS-stimulated J774 macrophages[J]. FEBS Lett， 1997，418(1-2)：175-178.u, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-10-08； [修回日期] 2000-04-11(郭甫坤 吴曙光)
单位：郭甫坤(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)；吴曙光(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)j&vl, 百拇医药
关键词：白介素-1；白介素-1受体相关激酶；反义寡核苷酸；AP-1j&vl, 百拇医药
免疫学杂志000403 [摘 要] 目的 研究白介素-1受体相关激酶-1(IRAK-1)和IRAK-2在白介素-1(IL-1)诱导AP-1活化中的作用。方法 Lipofectin介导反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸转染HepG2细胞。用逆转录PCR法检测IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达水平；Western blot分析IRAK-1和IRAK-2蛋白表达水平。以Sandwich ELISA法检测AP-1的活化。结果 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸通过抑制各自靶基因mRNA和蛋白表达抑制IL-1诱导的AP-1活化；反义IRAK-1寡核苷酸与反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞对AP-1的抑制作用较两者单独转染明显增强。结论 IRAK-1和IRAK-2在调控白介素-1诱导的AP-1活化时协同作用。j&vl, 百拇医药
[中图分类号] R392.11 [文献标识码] Aj&vl, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)04-0250-04j&vl, 百拇医药
IL-1 receptor associated kinase-1 and -2 synergistically activate AP-1j&vl, 百拇医药
GUO Fu-kun， WU Shu-guangj&vl, 百拇医药
(Institute of Pharmaceutic Sciences， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China)j&vl, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate whether interleukin-1 receptor associated kinase-1 (IRAK-1) and IRAK-2 are functionally combined or redundant but differentially expressed in interleukin-1(IL-1)-induced activator protein-1(AP-1) activation. Methods Phosphorothioate oligonucleotides(ODN) were designed antisense to sequences of IRAK-1 or IRAK-2. Antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells. IRAK-1 and IRAK-2 mRNA expression were assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR. IRAK-1 and IRAK-2 protein expression were detected by western blot. The levels of activator protein-1(AP-1) were measured by sandwich ELISA. Results Antisense IRAK-1 ODN and antisense IRAK-2 ODN blocked IRAK-1 and IRAK-2 expression， respectively. As a result， antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN inhibited IL-1-induced AP-1 activation. Cotransfection of antisense IRAK-1 ODN 4 μg with antisense IRAK-2 ODN 4 μg resulted in an additive inhibition of AP-1 activation. Conclusion IRAK-1 regulates IL-1-stimulated AP-1 activation in cooperation with IRAK-2.
[Key words] interleukin-1； interleukin-1 receptor associated kinase； antisense oligonucleotide； activator protein-1se}t, 百拇医药
白介素-1(IL-1)是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明：IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB(NF-κB)和AP-1调控[1，2]。因此，阐明IL-1活化NF-κB和AP-1的机制具有重要的理论和临床应用价值。IL-1刺激信号由其I型受体(IL-1RI)转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RI没有内在的蛋白激酶活性[3]，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-1(IRAK-1)和IRAK-2就属于这样的蛋白激酶[4，5]。IRAK-1和RAK-2都能通过下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)激活NF-κB和AP-1[5，6]。我们最近的研究表明：IRAK-1和IRAK-2在调控NF-κB活化时协同作用，但是，目前还不清楚它们是否协同调控AP-1活化，本文对此进行了探讨。se}t, 百拇医药
1 材料与方法se}t, 百拇医药
1.1 细胞系和试剂 人肝癌细胞系HepG2细胞从ATCC公司购买；DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊c-Fos p62特异性抗体(抗原表位相应于人源c-Fos p62 N端)、兔c-Fos p62 特异性抗体(抗原表位相应于人源c-Fos p62 C端)和山羊IRAK-1特异性抗体由美国Santa CruZ生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA分离试剂盒和逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒为Promega公司产品。兔IRAK-2特异性抗体由美国MMRTA MUZIO博士惠赠。se}t, 百拇医药
1.2 方法se}t, 百拇医药
1.2.1 细胞培养：HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于37 °C，5% CO2条件下培养至汇合成片。se}t, 百拇医药
1.2.2 寡核苷酸的序列及合成：反义IRAK-1寡核苷酸序列：5’-CCCCCCGGCCATGGCTGC-3’；正义IRAK-1寡核苷酸序列：5’-GCAGCCATGGCCGGGGGG-3’。反义IRAK-2寡核苷酸序列：5’-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3’；正义IRAK-2寡核苷酸序列：5’-ATGGCCTGCTACATCTAC-3’。寡核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成。寡核苷酸的5’端和3’端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义寡核苷酸序列与靶序列一致。反义寡核苷酸序列与靶序列互补。
1.2.3 Lipofectin包裹寡核苷酸的制备：参照lipofectin说明书操作。4p8e, 百拇医药
1.2.4 RT-PCR法测定IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达：汇合成片的HepG2细胞用IL-1 β 100 U/ml刺激30 min，洗去IL-1 β， IRAK-1实验组分别加入正义IRAK-1寡核苷酸4 μg和反义IRAK-1寡核苷酸4 μg；IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2寡核苷酸4 μg和反义IRAK-2寡核苷酸4 μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8 h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件(VILBER LOURMAT公司)定量。IRAK-1 5’端引物为：5’-ACTTCTTGTACGAGGTGCCGCC-3’；3’端引物为：5’-GGGCAGGCCTGGGTCTGGCAGT-3’。IRAK-2 5’端引物为：5’-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3’端引物为：5’-CCAGCACAGGTAAGACATTGG-3’。内参照β-actin 5’端引物为5’-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；3’端引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(由上海生工生物工程有限公司合成)。重复实验3次。4p8e, 百拇医药
1.2.5 Western杂交分析IRAK-1和IRAK-2蛋白表达水平：细胞用IL-1β和寡核苷酸处理的条件同1.2.4。细胞与寡核苷酸孵育8 h后，洗去寡核苷酸，进行Western杂交[7]并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件(VILBER LOURMAT公司)定量。重复实验3次。4p8e, 百拇医药
1.2.6 Sandwich ELISA法测定AP-1：按ROVIN等人的方法提取细胞核蛋白[8]，用Sandwich ELISA法测定AP-1[9]。重复实验3次。4p8e, 百拇医药
1.2.7 数据分析：实验数据以
±s表示，采用t检验进行统计学分析。4p8e, 百拇医药2 结果4p8e, 百拇医药
2.1 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达的影响 以IRAK-1和IRAK-2 PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin PCR产物吸收峰体积的比值反映反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸对各自靶基因表达的影响。结果表明：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达(与对照组相比，P<0.01)，而正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸都不能抑制靶基因表达(见图1)。
图1A：反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1 mRNA表达的影响(与对照组比较， P<0.01)； B：反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2 mRNA表达的影响(与对照组比较， P<0.01)k%@3, 百拇医药
Fig 1A：effect of antisense IRAK-1 ODN on IRAK-1 mRNA expression(compared to control， P<0.01)， B：effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 mRNA expression (compared to control， P<0.01)k%@3, 百拇医药
S-1：sense IRAK-1 ODN，S-2：sense IRAK-2 ODN，AS-1：antisense IRAK-1 ODN，AS-2：antisense IRAK-2 ODN，bp：base pair，V：volume of peakk%@3, 百拇医药
2.2 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2蛋白表达的影响 Western杂交分析结果显示：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2蛋白表达，抑制率分别为71.8%±4.2%和45%±6.1%。正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸无抑制作用(见图2)。
k%@3, 百拇医药图2A：反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1蛋白表达的影响； B：反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2蛋白表达的影响k%@3, 百拇医药
Fig 2A： effect of antisense IRAK-1 ODN on IRAK-1 protein expression， B： effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 protein expressionk%@3, 百拇医药
S-1：sense IRAK-1 ODN， S-2：sense IRAK-2 ODN， AS-1：antisense IRAK-1 ODN，AS-2：antisense IRAK-2 ODN，C：controlk%@3, 百拇医药
2.3 反义IRAK-1寡核苷酸对AP-1活化的影响 汇合成片的细胞用IL-1 β 100 U/ml刺激30 min，洗去IL-1 β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-1寡核苷酸孵育8 h，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1 h。同时设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-1寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-1寡核苷酸)。提取各组细胞核蛋白，检测AP-1水平。结果表明：反义IRAK-1寡核苷酸呈剂量依赖性地抑制AP-1活化。4 μg反义IRAK-1寡核苷酸的抑制作用最强，AP-1的吸光度值从对照组的2.154±0.013降至0.983±0.011，抑制率为54.4%±0.5%(见图3)。但是此时的AP-1活性仍远高于基础AP-1水平(AP-1基础水平值为0.163±0.011)(见图3)，说明反义IRAK-1寡核苷酸不能完全抑制AP-1活化。
图3反义IRAK-1寡核苷酸对AP-1活化的影响], http://www.100md.com
Fig 3Effect of antisense IRAK-1 ODN on AP-1 activation], http://www.100md.com
AS-1：antisense IRAK-1 ODN], http://www.100md.com
2.4 反义IRAK-2寡核苷酸对AP-1活化的影响 汇合成片的细胞用IL-1β 100 U/ml刺激30 min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸孵育8 h，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1 h。同时设立对照组(细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-2寡核苷酸)和基础组(细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-2寡核苷酸)。提取各组细胞核蛋白，检测AP-1水平。结果表明：反义IRAK-2寡核苷酸呈剂量依赖性地抑制AP-1活化。当4 μg反义IRAK-2寡核苷酸与HepG2细胞共孵育8 h时，AP-1的吸光度值降幅最大，抑制率达59.7%±0.4%。然而，与反义IRAK-1寡核苷酸类似，反义IRAK-2寡核苷酸对AP-1的抑制不完全(见图4)。
], http://www.100md.com图4反义IRAK-2寡核苷酸对AP-1活化的影响], http://www.100md.com
Fig 4Effect of antisense IRAK-2 ODN on AP-1 activation], http://www.100md.com
AS-2：antisense IRAK-2 ODN], http://www.100md.com
2.5 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染对AP-1活化的影响 将4 μg反义IRAK-1寡核苷酸和4 μg反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞，检测AP-1水平。结果达69.5%±0.9%的AP-1活性被抑制(见图5)。
], http://www.100md.com图5反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染对AP-1活化的影响], http://www.100md.com
Fig 5Effect of cotransfection of antisense IRAK-1 ODN with antisense IRAK-2 ODN on NF-κB activation
AS-1：antisense IRAK-1 ODN；AS-2：antisense IRAK-2 ODN[]am, http://www.100md.com
3 讨论[]am, http://www.100md.com
本研究发现，反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸单独转染HepG2细胞部分抑制AP-1活化，而反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染产生累积抑制效应。结果表明：IRAK-1和IRAK-2各自都能调控IL-1诱导的AP-1活化，但都不足以激活AP-1，IRAK-1和IRAK-2在调控AP-1活化时协同作用。[]am, http://www.100md.com
反义寡核苷酸特异性抑制靶基因的转录和/或翻译，因而不但有潜在的临床应用价值，而且在理论研究上有重要意义。反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达，而对看家基因β-actin mRNA表达无抑制作用(见图1)，证明反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸作用特异。进一步研究发现：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸亦能分别抑制IRAK-1和IRAK-2蛋白表达(P<0.01)(见图2)。因此，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸可分别作为IRAK-1和IRAK-2表达的特异性抑制剂。[]am, http://www.100md.com
反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1表达的抑制导致IL-1诱导的AP-1活化被抑制,但抑制不完全(见图3)，说明IRAK-1是AP-1活化必要但不充分的条件。由于IRAK家族另一成员IRAK-2具有与IRAK-1相似的作用(见图4)，故IRAK-1和IRAK-2很可能协同激活AP-1。此推测为共转染实验所证实：与反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，两者共转染细胞对AP-1的抑制作用明显增强(见图5)。但是，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染后AP-1活性仍未降至基础水平(P<0.01)(见图5)，提示还可能存在别的蛋白激酶与IRAK-1和IRAK-2一起调控AP-1活化。[]am, http://www.100md.com
IRAK-1和IRAK-2之间关系的澄清可为抑制IL-1的炎症反应提供理论指导。但是，IRAK-1和IRAK-2协同作用的分子机制有待阐明。另外，由于IL-1信号转导极其复杂，IRAK-1和IRAK-2在激活AP-1时的协同作用是否存在于其它细胞和体内也需证实。[]am, http://www.100md.com
[作者简介] 郭甫坤(1971-)，男，重庆开县人，博士研究生，主要从事免疫药理学的研究。
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[收稿日期] 1999-10-08； [修回日期] 2000-04-11(郭甫坤 吴曙光)