环孢素A受体在多发性硬化病人外周血单个核细胞中的表达
作者：林艾羽 慕容慎行 王柠 许国英 吴秀丽 方玲e@qg, 百拇医药
单位：林艾羽(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；慕容慎行(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；王柠(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；许国英(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；吴秀丽(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；方玲(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)e@qg, 百拇医药
关键词：多发性硬化；环孢素A受体；信使RNAe@qg, 百拇医药
免疫学杂志000514e@qg, 百拇医药
[摘 要] 目的 通过对多发性硬化患者外周血单个核细胞中环孢素A受体 mRNA表达的研究，为临床采用环孢素A辅助治疗该病提供一定的依据。方法 采用逆转录PCR方法，结果经凝胶图像分析。结果 患者组即多发性硬化患者外周血单个核细胞存在有CyP mRNA的表达，与对照组相比较降低，尚无明显统计学差异(P>0.01)。结论 多发性硬化患者外周血单个核细胞中存在有CyP，CsA与细胞内的CyP结合后是否产生生物活性还与其蛋白质的构象等有关。e@qg, 百拇医药
[中图分类号] R744.5 [文献标识码] Ae@qg, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)05-0365-02e@qg, 百拇医药
Cyclophilin mRNA expression in peripheral mononuclear cells in multiple sclerosise@qg, 百拇医药
LIN Ai-yu，MURONG Shen-xing，WANG Ning，XU Guo-ying，WU Xiu-li，FANG Linge@qg, 百拇医药
(Department of Neurology，Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fujian 350005，China)e@qg, 百拇医药
[Abstract] Objective To study cyclophilin(CyP) mRNA expression in peripheral mononuclear cells in multiple sclerosis，so as to obtain some evidences in response to cyclosporin A(CsA)used as supplementary treatment in multiple sclerosis.Methods Using reverse transcription polymerase chain reaction method，the products were analyzed through gel image analysis.Result CyP was expressed in both patient groups and normal control group.There in no significant statistical difference between them.Conclusion CyP has been expressed in the peripheral mononeuclear cells，the activity of CsA was decided by the protein structure of CsA-CyP combinants.
[Key words] multiple sclerosis；Cyclophilin；mRNAn8;, 百拇医药
环孢素A(cyclosporin A)临床上常用于器官移植后抗排斥反应，近年来也用于治疗某些自身免疫性疾病。我科近年来对部分重症多发性硬化及激素反应较差的患者配合以环孢素A进行治疗，其临床效果不一。本文收集部分临床确诊的多发性硬化患者外周血单个核细胞。研究其中环孢素A受体(cyclophilin CyP)的mRNA表达，为采用该药辅助治疗提供一定的依据。n8;, 百拇医药
1 对象和方法n8;, 百拇医药
1.1 对象 实验组采用20例经临床确诊为多发性硬化的患者，诊断依据Poser制定的标准[1]；对照组采用15例健康成人。对实验组和对照组成员分别抽取2 ml外周抗凝血(EDTA)，利用淋巴细胞分离液分离其中单个核细胞。n8;, 百拇医药
1.2 RNA提取 通过异硫氰酸胍、酚-氯仿抽提总RNA，经逆转录反应使之成为cDNA，逆转录反应体系总体积20 μl。n8;, 百拇医药
1.3 PCR扩增 利用合成的引物，扩增其目的基因片段，设β-actin为内参照。引物序列为β-actin(408 bp)：5’CTTCCTGGGCATGGAGTC3’ 5’GCCGATCCACACACGGAGTA3’；CyP(304 bp)：5’TCTTCTTGCTGGTCTTGCC3’5’TCTCCTT-TGAGCTGTTTGC3’，引物由上海生工公司合成。PCR反应条件为：94 °C 3 min，93 °C 45 s，58 °C 45 s，72 °C 45 s，28个循环，延伸5’。n8;, 百拇医药
1.4 电泳及摄像 将PCR产物于1.2%凝胶中进行检验并摄像(见图1)。n8;, 百拇医药
1.5 凝胶分析 各带的强弱经电脑凝胶图像分析，取CyP/β-actin密度比值进行最后分析(见表1)。n8;, 百拇医药
1.6 统计学分析 结果采用卡方检验。n8;, 百拇医药
2 结果n8;, 百拇医药
患者组即多发性硬化患者与对照组外周血单个核细胞均存在有CyP mRNA的表达，其CyP/β-actin的相对比值患者组较降低，尚无明显统计学差异(P>0.05)，如表1所示：
图1PCR产物的凝胶电泳l, 百拇医药
Fig 1Identification of PCR productsl, 百拇医药
表1 多发性硬化组与对照组CyP/β-actin比值l, 百拇医药
Tab 1 The value of CyP/β-actin of MS group compared with control groupl, 百拇医药
MS groupl, 百拇医药
control groupl, 百拇医药
CyP/β-actin OD ratiol, 百拇医药
0.4976±0.2390l, 百拇医药
0.5095±0.4400l, 百拇医药
**P<0.01，*P<0.05， compared with controll, 百拇医药
3 讨论l, 百拇医药
环孢素A受体于1984年从小牛胸腺中首次分离、纯化出来，被命名为cyclophilin，后称为CyP，CyP是CsA的细胞内蛋白受体，已发现有多种异构体存在，构成cyclophilin家族。CyP与某些免疫病有关。1992年，HARIGAI、KRATS等首先在系统性红斑狼疮(SLE)病人血清中发现IgG类和IgM类抗CyP自身抗体，且抗体水平与该病的发作与缓解相关。国内武建国等也发现约有53%的SLE病人血清中出现CyP自身抗体[2]，KRATS同时还在莱姆病人血清中检测到了CyP自身抗体[3]。l, 百拇医药
多发性硬化是神经科较为常见的一种自身免疫性疾病，由于易复发且每况愈下的特点最终可能致残，严重威胁着患者的生活质量。国内目前通常采用激素、神经营养药及对症等治疗；有部分患者对激素反应不敏感，而其它免疫抑制剂如：硫唑嘌呤、环磷酰胺等，它们具有较大的副作用。环孢素A与之相比具有安全、副作用小的特点，但由于临床试用结果不一，本研究试图通过了解多发性硬化患者环孢素A受体(cyclophilin CyP)的mRNA表达，可为临床采用该药用于辅助治疗多发性硬化提供一定的理论依据。
CyP具有介导CsA的免疫抑制作用，目前认为CsA的免疫抑制作用与依赖Ca/钙调素的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(calcineurin，CaN，又称神经钙蛋白)有关。CsA进入体内，先与CyP结合，形成CyP-CsA复合物，再与calcineurin B结合，抑制calcineurin活性，使该底物激活的T细胞核因子不能去磷酸化，从而在转录水平阻断淋巴细胞活性。体内也可能存在结构类似CsA的CyP的天然配体，它们与各类CyP结合，形成一种新的免疫调节网络，调节机体的免疫功能(负免疫调节作用)。8, 百拇医药
多发性硬化是主要由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，据对其动物模型EAE的研究认为：其中枢神经系统内部反应性T淋巴细胞是以凋亡的方式消除，这同时也是EAE愈复与耐受形成的机制之一。T细胞的凋亡同炎症消退、临床症状趋于好转相一致[4]。MONTAGUE等人发现重组CyP有依赖Ca/Mg的核酸酶活性，可能在某些淋巴细胞凋亡中起作用。CyP引起细胞凋亡的机制不详，也许是CyP可以通过钙离子信号传递途径影响调控细胞凋亡的基因表达而间接地调控细胞凋亡[5]。8, 百拇医药
本研究从mRNA表达的水平提示了多发性硬化患者外周血单个核细胞中存在有CyP，且与健康对照组相比较无明显差别。当然，CsA与细胞内的CyP结合后是否产生生物活性还与其蛋白质的构象有关；另外，该蛋白表达后是否为体内某些抗体所抵抗尚未知。至于有些患者对环孢素A治疗的反应仍不够理想，是否同以上原因有关均有待于今后进一步的研究。8, 百拇医药
[基金项目] 福建省卫生厅青年基金资助(96A060)8, 百拇医药
[作者简介] 林艾羽(1970-)女，福建福州市人，主治医师，硕士，主要从事神经免疫学的研究。8, 百拇医药
[参考文献]8, 百拇医药
[1] POSER CM，PATTY DW，SCHEIBERG L，et al.New diagnostic criteria for multiple sclerosis：guidelines for research protocols[J].Ann Neurol，1983，13(3)：227-231.8, 百拇医药
[2] 武建国，李晓军，张文辉，等.测定Cyclophilin自身抗体的意义[J].中华微生物学与免疫学杂志，1996，16(1)：63-65.8, 百拇医药
[3] KRATS A，HARDING MW，CRAFT J，et al.Autoantibodies against cyclophilin in systemic lupus erythematosus and Lyme disease[J].Clin Exp Immunol，1992，90(3)：420-427.8, 百拇医药
[4] DAVID O WILLENBORG.Experimental allergic encephalomyelitis in the lewis rat：studies on the mechanism of recovery from disease and acpuired resistance to reinduction[J].J Immunol，1979，123(3)：1 145-1 150.8, 百拇医药
[5] MONTAGUE JW，GAIDO ML，FRYE C，et al.A calcium-dependent nuclease from apoptotic rat thymocytes is homologous with cyclophilin.Recombinant cyclophilins A，B and C have nuclease activity[J].J Biol Chem，1994，269(29)：18 877-18 880.8, 百拇医药
[收稿日期] 2000-01-27； [修回日期] 2000-05-17(林艾羽 慕容慎行 王柠 许国英 吴秀丽 方玲)
单位：林艾羽(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；慕容慎行(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；王柠(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；许国英(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；吴秀丽(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)；方玲(福建医科大学附属第一医院神经科，福建 福州 350005)e@qg, 百拇医药
关键词：多发性硬化；环孢素A受体；信使RNAe@qg, 百拇医药
免疫学杂志000514e@qg, 百拇医药
[摘 要] 目的 通过对多发性硬化患者外周血单个核细胞中环孢素A受体 mRNA表达的研究，为临床采用环孢素A辅助治疗该病提供一定的依据。方法 采用逆转录PCR方法，结果经凝胶图像分析。结果 患者组即多发性硬化患者外周血单个核细胞存在有CyP mRNA的表达，与对照组相比较降低，尚无明显统计学差异(P>0.01)。结论 多发性硬化患者外周血单个核细胞中存在有CyP，CsA与细胞内的CyP结合后是否产生生物活性还与其蛋白质的构象等有关。e@qg, 百拇医药
[中图分类号] R744.5 [文献标识码] Ae@qg, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)05-0365-02e@qg, 百拇医药
Cyclophilin mRNA expression in peripheral mononuclear cells in multiple sclerosise@qg, 百拇医药
LIN Ai-yu，MURONG Shen-xing，WANG Ning，XU Guo-ying，WU Xiu-li，FANG Linge@qg, 百拇医药
(Department of Neurology，Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fujian 350005，China)e@qg, 百拇医药
[Abstract] Objective To study cyclophilin(CyP) mRNA expression in peripheral mononuclear cells in multiple sclerosis，so as to obtain some evidences in response to cyclosporin A(CsA)used as supplementary treatment in multiple sclerosis.Methods Using reverse transcription polymerase chain reaction method，the products were analyzed through gel image analysis.Result CyP was expressed in both patient groups and normal control group.There in no significant statistical difference between them.Conclusion CyP has been expressed in the peripheral mononeuclear cells，the activity of CsA was decided by the protein structure of CsA-CyP combinants.
[Key words] multiple sclerosis；Cyclophilin；mRNAn8;, 百拇医药
环孢素A(cyclosporin A)临床上常用于器官移植后抗排斥反应，近年来也用于治疗某些自身免疫性疾病。我科近年来对部分重症多发性硬化及激素反应较差的患者配合以环孢素A进行治疗，其临床效果不一。本文收集部分临床确诊的多发性硬化患者外周血单个核细胞。研究其中环孢素A受体(cyclophilin CyP)的mRNA表达，为采用该药辅助治疗提供一定的依据。n8;, 百拇医药
1 对象和方法n8;, 百拇医药
1.1 对象 实验组采用20例经临床确诊为多发性硬化的患者，诊断依据Poser制定的标准[1]；对照组采用15例健康成人。对实验组和对照组成员分别抽取2 ml外周抗凝血(EDTA)，利用淋巴细胞分离液分离其中单个核细胞。n8;, 百拇医药
1.2 RNA提取 通过异硫氰酸胍、酚-氯仿抽提总RNA，经逆转录反应使之成为cDNA，逆转录反应体系总体积20 μl。n8;, 百拇医药
1.3 PCR扩增 利用合成的引物，扩增其目的基因片段，设β-actin为内参照。引物序列为β-actin(408 bp)：5’CTTCCTGGGCATGGAGTC3’ 5’GCCGATCCACACACGGAGTA3’；CyP(304 bp)：5’TCTTCTTGCTGGTCTTGCC3’5’TCTCCTT-TGAGCTGTTTGC3’，引物由上海生工公司合成。PCR反应条件为：94 °C 3 min，93 °C 45 s，58 °C 45 s，72 °C 45 s，28个循环，延伸5’。n8;, 百拇医药
1.4 电泳及摄像 将PCR产物于1.2%凝胶中进行检验并摄像(见图1)。n8;, 百拇医药
1.5 凝胶分析 各带的强弱经电脑凝胶图像分析，取CyP/β-actin密度比值进行最后分析(见表1)。n8;, 百拇医药
1.6 统计学分析 结果采用卡方检验。n8;, 百拇医药
2 结果n8;, 百拇医药
患者组即多发性硬化患者与对照组外周血单个核细胞均存在有CyP mRNA的表达，其CyP/β-actin的相对比值患者组较降低，尚无明显统计学差异(P>0.05)，如表1所示：
图1PCR产物的凝胶电泳l, 百拇医药
Fig 1Identification of PCR productsl, 百拇医药
表1 多发性硬化组与对照组CyP/β-actin比值l, 百拇医药
Tab 1 The value of CyP/β-actin of MS group compared with control groupl, 百拇医药
MS groupl, 百拇医药
control groupl, 百拇医药
CyP/β-actin OD ratiol, 百拇医药
0.4976±0.2390l, 百拇医药
0.5095±0.4400l, 百拇医药
**P<0.01，*P<0.05， compared with controll, 百拇医药
3 讨论l, 百拇医药
环孢素A受体于1984年从小牛胸腺中首次分离、纯化出来，被命名为cyclophilin，后称为CyP，CyP是CsA的细胞内蛋白受体，已发现有多种异构体存在，构成cyclophilin家族。CyP与某些免疫病有关。1992年，HARIGAI、KRATS等首先在系统性红斑狼疮(SLE)病人血清中发现IgG类和IgM类抗CyP自身抗体，且抗体水平与该病的发作与缓解相关。国内武建国等也发现约有53%的SLE病人血清中出现CyP自身抗体[2]，KRATS同时还在莱姆病人血清中检测到了CyP自身抗体[3]。l, 百拇医药
多发性硬化是神经科较为常见的一种自身免疫性疾病，由于易复发且每况愈下的特点最终可能致残，严重威胁着患者的生活质量。国内目前通常采用激素、神经营养药及对症等治疗；有部分患者对激素反应不敏感，而其它免疫抑制剂如：硫唑嘌呤、环磷酰胺等，它们具有较大的副作用。环孢素A与之相比具有安全、副作用小的特点，但由于临床试用结果不一，本研究试图通过了解多发性硬化患者环孢素A受体(cyclophilin CyP)的mRNA表达，可为临床采用该药用于辅助治疗多发性硬化提供一定的理论依据。
CyP具有介导CsA的免疫抑制作用，目前认为CsA的免疫抑制作用与依赖Ca/钙调素的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(calcineurin，CaN，又称神经钙蛋白)有关。CsA进入体内，先与CyP结合，形成CyP-CsA复合物，再与calcineurin B结合，抑制calcineurin活性，使该底物激活的T细胞核因子不能去磷酸化，从而在转录水平阻断淋巴细胞活性。体内也可能存在结构类似CsA的CyP的天然配体，它们与各类CyP结合，形成一种新的免疫调节网络，调节机体的免疫功能(负免疫调节作用)。8, 百拇医药
多发性硬化是主要由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，据对其动物模型EAE的研究认为：其中枢神经系统内部反应性T淋巴细胞是以凋亡的方式消除，这同时也是EAE愈复与耐受形成的机制之一。T细胞的凋亡同炎症消退、临床症状趋于好转相一致[4]。MONTAGUE等人发现重组CyP有依赖Ca/Mg的核酸酶活性，可能在某些淋巴细胞凋亡中起作用。CyP引起细胞凋亡的机制不详，也许是CyP可以通过钙离子信号传递途径影响调控细胞凋亡的基因表达而间接地调控细胞凋亡[5]。8, 百拇医药
本研究从mRNA表达的水平提示了多发性硬化患者外周血单个核细胞中存在有CyP，且与健康对照组相比较无明显差别。当然，CsA与细胞内的CyP结合后是否产生生物活性还与其蛋白质的构象有关；另外，该蛋白表达后是否为体内某些抗体所抵抗尚未知。至于有些患者对环孢素A治疗的反应仍不够理想，是否同以上原因有关均有待于今后进一步的研究。8, 百拇医药
[基金项目] 福建省卫生厅青年基金资助(96A060)8, 百拇医药
[作者简介] 林艾羽(1970-)女，福建福州市人，主治医师，硕士，主要从事神经免疫学的研究。8, 百拇医药
[参考文献]8, 百拇医药
[1] POSER CM，PATTY DW，SCHEIBERG L，et al.New diagnostic criteria for multiple sclerosis：guidelines for research protocols[J].Ann Neurol，1983，13(3)：227-231.8, 百拇医药
[2] 武建国，李晓军，张文辉，等.测定Cyclophilin自身抗体的意义[J].中华微生物学与免疫学杂志，1996，16(1)：63-65.8, 百拇医药
[3] KRATS A，HARDING MW，CRAFT J，et al.Autoantibodies against cyclophilin in systemic lupus erythematosus and Lyme disease[J].Clin Exp Immunol，1992，90(3)：420-427.8, 百拇医药
[4] DAVID O WILLENBORG.Experimental allergic encephalomyelitis in the lewis rat：studies on the mechanism of recovery from disease and acpuired resistance to reinduction[J].J Immunol，1979，123(3)：1 145-1 150.8, 百拇医药
[5] MONTAGUE JW，GAIDO ML，FRYE C，et al.A calcium-dependent nuclease from apoptotic rat thymocytes is homologous with cyclophilin.Recombinant cyclophilins A，B and C have nuclease activity[J].J Biol Chem，1994，269(29)：18 877-18 880.8, 百拇医药
[收稿日期] 2000-01-27； [修回日期] 2000-05-17(林艾羽 慕容慎行 王柠 许国英 吴秀丽 方玲)