结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽的筛选
作者：张晓光 韩炯 韩景田 刘新平 药立波 聂晓燕 苏成芝8wl, http://www.100md.com
单位：张晓光(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；韩炯(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；韩景田(武警医学院微生物学教研室，天津 300162)；刘新平(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；药立波(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；聂晓燕(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；苏成芝(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)8wl, http://www.100md.com
关键词： EphB2；表达；金属螯合层析；噬菌体表面呈现；随机短肽库8wl, http://www.100md.com
免疫学杂志0005078wl, http://www.100md.com
[摘 要] 目的 筛选能结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽。方法 PCR扩增EphB2的配体结合区，定向克隆到融合表达质粒载体pRSET A中，阳性克隆经IPTG诱导表达融合蛋白，并利用Ni-NTA金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化，以此纯化蛋白为靶，将其包被于ELISA板上，进行3轮亲和筛选。结果 电泳分析表明：表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在，纯化蛋白质的纯度大于95%。从噬菌体随机12肽库中筛选到13个噬菌体阳性克隆。结论 获得了具有结合EphB2活性的阳性噬菌体克隆且有共同的基序。8wl, http://www.100md.com
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A8wl, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)05-0342-048wl, http://www.100md.com
Screening of the bioactive peptides that bind to tyrosine kinase receptor EphB28wl, http://www.100md.com
ZHANG Xiao-guang HAN Jiong LIU Xin-ping YAO Li-bo NIE Xiao-yan SU Cheng-zhi8wl, http://www.100md.com
(Department of Biochemistry and Molecular Biology，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)
HAN Jing-tianji3+j, 百拇医药
HAN Jing-tian(Department of Micorobiology，Medical College of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China)ji3+j, 百拇医药
[Abstract] Objective To screen and identify the bioactive peptides that bind to tyrosine kinase receptor EphB2.Methods The gene encoding the ligand binding domain of EphB2 was cloned into the expressing vector pRSET A，under induction with IPTG，the fusion protein was expressed and purified under denaturing condition using metal chelate chromatography.The purified protein coated on ELISA plate was used as target to carry out three rounds of affinity selection.Results SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein mainly existed in inclusion bodies.The purity was up to 95%，13 positive phages were isolated from a random phage-displayed twelve-peptide library.Conclusion Peptides that could interact specifically with EphB2 were obtained and there were common motifs among the sequences of them.ji3+j, 百拇医药
[Key words] EphB2；expression；metal chelate chromatography；phage display；random peptide libraryji3+j, 百拇医药
EphB2属于已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体Eph家族[1]，在胚胎发育及出生后的生命进程中的表达呈现差异性、重叠性及时空性[2]，在神经轴突导向、血管发生、肿瘤形成等方面具有重要功能[3]。90年代初兴起的肽库技术，为细胞信号传导研究、小分子药物设计、重组疫苗研制、抗病毒药物筛选带来一场革命[4]。其筛选的共同点是钓取与蛋白(如抗体，受体，酶)特异性结合的配基。这种筛选功能性短肽的研究策略对于EphB2及其配体的研究有很大的借鉴意义。我们构建his融合蛋白表达载体并表达纯化了EphB2的配体结合结构域，以该蛋白为靶子，从噬菌体多肽库中筛选能结合EphB2受体的模拟短肽。
1 材料与方法.f, 百拇医药
1.1 材料 螯合亲和层析介质(Ni-NTA)购自德国QIAGEN公司。PH.D.-12噬菌体表面呈现随机12肽库试剂盒，购自New England Biolabs公司。.f, 百拇医药
1.2 方法.f, 百拇医药
1.2.1 融合蛋白的表达及检测：将本室经PCR扩增，测序正确的EphB2的配体结合结构域编码基因用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ从保存载体pUC19中切下，klenow补平，亚克隆入pbluescript(-)的SmaⅠ位点，反向插入的克隆用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切下，连接到同样双酶切的pRSET A载体(invitrogene，USA)中，转化E.coli JM109(DE3)(华美公司)感受态细胞，含目的基因片段的阳性克隆接种到5 ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养3 h，当A600约为0.8～0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，诱导3 h，取1 ml菌液离心收菌，加入上样缓冲液，沸水浴加热5 min，12 000 r/min离心5 min后进行SDS-PAGE。.f, 百拇医药
1.2.2 重组蛋白的纯化：将5 ml LB培养基过夜培养的阳性表达菌接种到500 ml含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB中，按前述方法诱导融合蛋白的表达并收集菌体，加入超声缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4 pH7.8，300 mmol/L NaCl)重悬菌体(10 ml/g湿菌体)，并加入溶菌酶至终浓度为1 g/L，室温作用30 min后，超声裂菌(150 W×1 min×5次)后4 °C 12 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀即为包涵体，重新悬浮于20 ml缓冲液A(6 mol/L盐酸胍，0.1 mmol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH8.0)中，室温磁力搅拌2 h，使包涵体完全溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，将上清液上到用缓冲液A平衡过的Ni-NTA agarose柱上，然后分别用5倍柱体积的缓冲液B(8 mol/L尿素，0.1 mmol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH8.0)，10倍柱体积的缓冲液C(同缓冲液B，pH6.3)，2倍柱体积缓冲液D(同缓冲液B，pH5.9)，2倍柱体积缓冲液E(同缓冲液B，pH4.5)洗柱，最后用10 ml缓冲液F(缓冲液C中含250 mmol/L咪唑)对目的蛋白进行特异性洗脱，分步收集，每管约1 ml。取各管收集液10 μ1，加入等量2×上样缓冲液，37 °C温育10 min，经15%SDS-PAGE检测，将含有目的蛋白的各管合并。
1.2.3 变性表达蛋白的复性：采取逐步降低尿素浓度的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性。先用含6 mol/L尿素的PBS缓冲液4 °C透析过夜，然后分别用4 mol/L，3 mol/L，2 mol/L，1 mol/L，0.5 mol/L的梯度透析各4 h以上，最后用PBS缓冲液再透析4 h以上。透析结束后，将蛋白溶液在4 °C下12 000 r/min离心10 min，上清即为可溶的复性蛋白。将其分装后冻干备用。jh9u, 百拇医药
1.2.4 结合EphB2受体的功能短肽的筛选：以0.1 mol/L的NaHCO3(pH8.6)调整可溶的复性蛋白为100 μg/ml，加入1.5 ml该蛋白至聚苯乙烯培养皿中，4 °C包被过夜。加5 mg/ml BSA-0.1 mol/L NaHCO3(pH8.6)，4 °C封闭1 h， TBS-0.1%Tween 20洗板6次，加入1 ml TBST稀释的2×1011(10 μ1原库)噬菌体上清，25 °C孵育1 h，TBS-0.1%Tween洗10次，洗去非特异性结合的噬菌体，然后加入1 ml 0.2 mol/L Glycine*HCL(pH2.2)，温和振荡10 min，洗脱特异性结合的噬菌体，用150 μ1 1 mol/L Tris*Cl(pH9.1)中和，立即加入20 ml对数生长期ER2537，37 °C孵育4.5 h，扩增特异性吸附的重组噬菌体。以PEG/NaCl沉淀噬菌体上清，在LB/IPTG/X-gal平板上测定扩增噬菌体的滴度，由此完成一轮panning筛选。用2×1011 pfu的第1轮洗脱噬菌体加至同样包被的平板，进行第2轮panning筛选。重复进行第3轮panning后，不需扩增，在LB/IPTG/X-gal平板上挑取噬斑进行测序。jh9u, 百拇医药
1.2.5 ELISA法检测噬菌体表面呈现小肽的结合活性：第3轮筛选结束后，从LB/IPTG/X-gal平皿上随机挑选50个分隔良好的兰色噬斑，分别接种在对数生长期ER2537中，37 °C培养4.5 h，培养物离心后，取上清即为单个克隆的重组噬菌体。96孔酶联板上，实验孔均用100 ng靶蛋白/100 μ1/孔包被，阴性对照孔用200 μ1 0.5%BSA包被，4 °C包被过夜，2%BSA-TBS，4 °C封闭1～2 h后，实验孔加入200 μ1待测阳性克隆的噬菌体上清为待检小肽，25 °C反应2 h，PBST-0.05% Tween20洗板6次，每孔加入稀释至工作浓度的HRP/鼠抗M13噬菌体抗体。室温反应1 h，PBST-0.05%Tween20洗板6次，加入ABTS显色溶液，室温显色，测410 nm处每孔的OD值。
1.2.6 与EphB2受体结合的噬菌体小肽的序列测定： 从4 °C贮存的阳性克隆菌种，接种于ER2537培养液中，37 °C振荡培养4.5 h，按M13 DNA提取试剂盒说明书提取M13噬菌体单链DNA，紫外定量，取100 ng作模板，-96gⅢ测序引物，PE公司自动ABI PRISMTM310测序仪测序。+?/, http://www.100md.com
2 结果+?/, http://www.100md.com
2.1 融合蛋白的表达 从图1可见重组菌有一明显的20 kD左右新生蛋白带，薄层扫描分析显示：蛋白的表达量约占菌体蛋白的27%。对表达蛋白的可溶性分析表明：融合表达产物主要以不溶的包涵体的形式存在。
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图1蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳分析+?/, http://www.100md.com
Fig 1SDS-PAGE analysis for the expression form+?/, http://www.100md.com
D：deposition； S：supernatant； T：total lysate of the recombinant E.coli； E：lysate of host E.coli with empty vector；+?/, http://www.100md.com
M：markers：97.4 ku；66.2 ku；43.0 ku；31.0 ku；14.4 ku(from top to bottom)+?/, http://www.100md.com
2.2 重组蛋白的纯化 从重组菌中制备的包涵体经洗涤后，用盐酸胍变性，上到Ni-NTA金属螯合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。由15%的SDS-PAGE(见图2)，利用这种方法可有效地纯化目的蛋白，经薄层扫描分析纯度可达90%以上(图略)。经ELISA证实该复性蛋白可与其天然配体结合。
+?/, http://www.100md.com
图2SDS-PAGE分析EphB2配体结合区的纯化+?/, http://www.100md.com
Fig 2SDS-PAGE analysis for the purification of the ligand binding domain of EphB2
1：the total protein of recombinant stain；2：marker：66 ku；55 ku；45 ku；40 ku；36 ku；29 ku；24 ku；18 ku；14 ku(form top to bottom)；3：lysate of E.coli JM109(DE3)containing empty vector pRSET A；4：denatured protein eluted from Ni-NTA agarose|/0, http://www.100md.com
将分步收集液中含目的蛋白的各管合并，缓慢、逐步降低透析液中尿素浓度，使变性的蛋白在此过程中自然复性。复性后的目的蛋白经冻干保存。|/0, http://www.100md.com
2.3 ELISA检测噬菌体表面呈现小肽结合活性 第3轮筛选结束后，随机挑取LB/IPTG/X-gal平皿上50个蓝色噬斑分别经ER2537扩增后，收集重组噬菌体的上清，进行ELISA检测，实验中设置了阴性抗原(BSA)对照组。结果显示：阴性对照孔读数0.034，其余各阴性孔读数0.034～0.056，可以与EphB2特异性结合，而与包被的BSA无结合反应的13个阳性克隆孔读数均大于0.1(见表1)。|/0, http://www.100md.com
表1 阳性噬菌体克隆ELISA显色的光吸收值|/0, http://www.100md.com
Tab 1 Result of the positive phage clones by ELISA phage clone|/0, http://www.100md.com
OD410|/0, http://www.100md.com
St2|/0, http://www.100md.com
0.197|/0, http://www.100md.com
St3|/0, http://www.100md.com
0.103|/0, http://www.100md.com
St6|/0, http://www.100md.com
0.123|/0, http://www.100md.com
St8|/0, http://www.100md.com
0.432|/0, http://www.100md.com
St9|/0, http://www.100md.com
0.307
St13[k*5[, 百拇医药
0.247[k*5[, 百拇医药
St15[k*5[, 百拇医药
0.804[k*5[, 百拇医药
St27[k*5[, 百拇医药
0.173[k*5[, 百拇医药
St28[k*5[, 百拇医药
0.334[k*5[, 百拇医药
St44[k*5[, 百拇医药
0.223[k*5[, 百拇医药
St45[k*5[, 百拇医药
0.356[k*5[, 百拇医药
St46[k*5[, 百拇医药
0.368[k*5[, 百拇医药
St47[k*5[, 百拇医药
0.344[k*5[, 百拇医药
BSA[k*5[, 百拇医药
0.034[k*5[, 百拇医药
2.4 与EphB2受体结合的噬菌体小肽的序列测定 从4 °C贮存的阳性克隆菌种，扩增后按M13DNA提取试剂盒说明书提取M13噬菌体单链DNA，紫外定量，-96gⅢ测序引物，PE公司自动测序仪进行序列分析，并推导出外源短肽的氨基酸序列，结果分析如下(手工排序)：
[k*5[, 百拇医药
13个阳性克隆的氨基酸序列，其中有共同的较保守LXHSKQ，(L)SRT/S，及RR A/X P/X R/X序列，ST45与ST28号克隆，ST46与ST47号克隆序列完全相同。[k*5[, 百拇医药
3 讨论[k*5[, 百拇医药
pRSET是一高效原核表达载体，其多克隆酶切位点上游有编码6个连续组氨酸残基的序列(6×His tag)，在重组质粒进行诱导表达时，6×His tag与外源插入片段共同表达，表达后的融合蛋白带有6×His tag，融合的蛋白较小，只有20个氨基酸左右，即使不进行切割，也不影响蛋白的活性，且可使表达的蛋白与金属镍发生螯合，从而可进行Ni2+螯合亲和层析，使得蛋白变性液中的目的蛋白在流经柱床时被特异性吸附，再利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白[6]。本研究结果显示该方法切实可行。
肽文库是一定长度肽段的混合物，里面包含所有可能的氨基酸排列信息，KIMURA[7]用人血小板生成素(TPO)受体c-mpl的胞外区从噬菌体表面呈现肽文库筛选得到与c-mpl结合的肽激动剂PKlM，能刺激TPO依赖的细胞增殖，并能诱导JAK2的酪氨酸磷酸化和STAT5的活化。有望设计为TPO的小分子模拟。这种筛选功能性短肽的研究策略对于EphB2及其配体的研究有很大的借鉴意义，Eph受体的信号转导是通过与其跨膜或聚集型配体(ephrin)的结合而启动，需要细胞间接触而被活化，进而发生受体自身磷酸化和与细胞中其下游信号蛋白分子结合，最终导致一定生理效应。EphB2的跨膜配体ephrin-B1(formerly Elk-L/Lerk2)体外对毛细管的诱导与angiopoietin-1(Ang1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的功效类似，且内皮细胞与周围间充质细胞的相互作用需ephrinB2配体和EphB2受体间的信号传导[8]。我们从噬菌体表面呈现多肽库中经3轮吸附-洗涤-洗脱的筛选富集过程，得到多个能与目标蛋白专一结合的噬菌体阳性克隆，即可结合EphB2的短肽，有较保守而集中的基序，有可能是其天然配体的拮抗剂，而阻断或激活EphB2活性。下一步将人工合成短肽及改造并进行模拟短肽的功能特性研究。yw#l, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39800027)yw#l, http://www.100md.com
[作者简介] 张晓光(1968-)，女，辽宁盖州市人，讲师，博士，主要从事分子免疫学研究。yw#l, http://www.100md.com
[参考文献]yw#l, http://www.100md.com
[1] HIRAI H，MARU Y，HAGIWARA K，et al.A novel putative tyrosine kinase receptor encoded by the eph gene[J].Science，1987，238(4834)：1 717-1 720.yw#l, http://www.100md.com
[2] WANG HU，CHEN ZF，ANDERSON DJ.Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4[J].Cell，1998，93(5)：741-753.
[3] JUHA-PEKKA HIMANEN，MARK HENKEMEY-ER，DIMITAR B NIKOIOV.Crystal structure of the ligand-binding domain of the receptor tyrosine kinase EphB2[J].Nature，1998，396(6 710)：486-491.a9sx!q', http://www.100md.com
[4] LAM KS，SALMON SE，MERSH EM，et al.A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity[J].Nature，1991，354(6 348)：82-84.a9sx!q', http://www.100md.com
[5] 张晓光，王 方，闫小君，等.胃癌高表达基因ErK的扩增、克隆和鉴定[J].第四军医大学学报，1997，18(6)：562-565.a9sx!q', http://www.100md.com
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[收稿日期] 2000-02-23； [修回日期] 2000-05-10(张晓光 韩炯 韩景田 刘新平 药立波 聂晓燕 苏成芝)
单位：张晓光(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；韩炯(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；韩景田(武警医学院微生物学教研室，天津 300162)；刘新平(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；药立波(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；聂晓燕(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)；苏成芝(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032)8wl, http://www.100md.com
关键词： EphB2；表达；金属螯合层析；噬菌体表面呈现；随机短肽库8wl, http://www.100md.com
免疫学杂志0005078wl, http://www.100md.com
[摘 要] 目的 筛选能结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽。方法 PCR扩增EphB2的配体结合区，定向克隆到融合表达质粒载体pRSET A中，阳性克隆经IPTG诱导表达融合蛋白，并利用Ni-NTA金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化，以此纯化蛋白为靶，将其包被于ELISA板上，进行3轮亲和筛选。结果 电泳分析表明：表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在，纯化蛋白质的纯度大于95%。从噬菌体随机12肽库中筛选到13个噬菌体阳性克隆。结论 获得了具有结合EphB2活性的阳性噬菌体克隆且有共同的基序。8wl, http://www.100md.com
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A8wl, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)05-0342-048wl, http://www.100md.com
Screening of the bioactive peptides that bind to tyrosine kinase receptor EphB28wl, http://www.100md.com
ZHANG Xiao-guang HAN Jiong LIU Xin-ping YAO Li-bo NIE Xiao-yan SU Cheng-zhi8wl, http://www.100md.com
(Department of Biochemistry and Molecular Biology，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)
HAN Jing-tianji3+j, 百拇医药
HAN Jing-tian(Department of Micorobiology，Medical College of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China)ji3+j, 百拇医药
[Abstract] Objective To screen and identify the bioactive peptides that bind to tyrosine kinase receptor EphB2.Methods The gene encoding the ligand binding domain of EphB2 was cloned into the expressing vector pRSET A，under induction with IPTG，the fusion protein was expressed and purified under denaturing condition using metal chelate chromatography.The purified protein coated on ELISA plate was used as target to carry out three rounds of affinity selection.Results SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein mainly existed in inclusion bodies.The purity was up to 95%，13 positive phages were isolated from a random phage-displayed twelve-peptide library.Conclusion Peptides that could interact specifically with EphB2 were obtained and there were common motifs among the sequences of them.ji3+j, 百拇医药
[Key words] EphB2；expression；metal chelate chromatography；phage display；random peptide libraryji3+j, 百拇医药
EphB2属于已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体Eph家族[1]，在胚胎发育及出生后的生命进程中的表达呈现差异性、重叠性及时空性[2]，在神经轴突导向、血管发生、肿瘤形成等方面具有重要功能[3]。90年代初兴起的肽库技术，为细胞信号传导研究、小分子药物设计、重组疫苗研制、抗病毒药物筛选带来一场革命[4]。其筛选的共同点是钓取与蛋白(如抗体，受体，酶)特异性结合的配基。这种筛选功能性短肽的研究策略对于EphB2及其配体的研究有很大的借鉴意义。我们构建his融合蛋白表达载体并表达纯化了EphB2的配体结合结构域，以该蛋白为靶子，从噬菌体多肽库中筛选能结合EphB2受体的模拟短肽。
1 材料与方法.f, 百拇医药
1.1 材料 螯合亲和层析介质(Ni-NTA)购自德国QIAGEN公司。PH.D.-12噬菌体表面呈现随机12肽库试剂盒，购自New England Biolabs公司。.f, 百拇医药
1.2 方法.f, 百拇医药
1.2.1 融合蛋白的表达及检测：将本室经PCR扩增，测序正确的EphB2的配体结合结构域编码基因用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ从保存载体pUC19中切下，klenow补平，亚克隆入pbluescript(-)的SmaⅠ位点，反向插入的克隆用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切下，连接到同样双酶切的pRSET A载体(invitrogene，USA)中，转化E.coli JM109(DE3)(华美公司)感受态细胞，含目的基因片段的阳性克隆接种到5 ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养3 h，当A600约为0.8～0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，诱导3 h，取1 ml菌液离心收菌，加入上样缓冲液，沸水浴加热5 min，12 000 r/min离心5 min后进行SDS-PAGE。.f, 百拇医药
1.2.2 重组蛋白的纯化：将5 ml LB培养基过夜培养的阳性表达菌接种到500 ml含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB中，按前述方法诱导融合蛋白的表达并收集菌体，加入超声缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4 pH7.8，300 mmol/L NaCl)重悬菌体(10 ml/g湿菌体)，并加入溶菌酶至终浓度为1 g/L，室温作用30 min后，超声裂菌(150 W×1 min×5次)后4 °C 12 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀即为包涵体，重新悬浮于20 ml缓冲液A(6 mol/L盐酸胍，0.1 mmol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH8.0)中，室温磁力搅拌2 h，使包涵体完全溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，将上清液上到用缓冲液A平衡过的Ni-NTA agarose柱上，然后分别用5倍柱体积的缓冲液B(8 mol/L尿素，0.1 mmol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH8.0)，10倍柱体积的缓冲液C(同缓冲液B，pH6.3)，2倍柱体积缓冲液D(同缓冲液B，pH5.9)，2倍柱体积缓冲液E(同缓冲液B，pH4.5)洗柱，最后用10 ml缓冲液F(缓冲液C中含250 mmol/L咪唑)对目的蛋白进行特异性洗脱，分步收集，每管约1 ml。取各管收集液10 μ1，加入等量2×上样缓冲液，37 °C温育10 min，经15%SDS-PAGE检测，将含有目的蛋白的各管合并。
1.2.3 变性表达蛋白的复性：采取逐步降低尿素浓度的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性。先用含6 mol/L尿素的PBS缓冲液4 °C透析过夜，然后分别用4 mol/L，3 mol/L，2 mol/L，1 mol/L，0.5 mol/L的梯度透析各4 h以上，最后用PBS缓冲液再透析4 h以上。透析结束后，将蛋白溶液在4 °C下12 000 r/min离心10 min，上清即为可溶的复性蛋白。将其分装后冻干备用。jh9u, 百拇医药
1.2.4 结合EphB2受体的功能短肽的筛选：以0.1 mol/L的NaHCO3(pH8.6)调整可溶的复性蛋白为100 μg/ml，加入1.5 ml该蛋白至聚苯乙烯培养皿中，4 °C包被过夜。加5 mg/ml BSA-0.1 mol/L NaHCO3(pH8.6)，4 °C封闭1 h， TBS-0.1%Tween 20洗板6次，加入1 ml TBST稀释的2×1011(10 μ1原库)噬菌体上清，25 °C孵育1 h，TBS-0.1%Tween洗10次，洗去非特异性结合的噬菌体，然后加入1 ml 0.2 mol/L Glycine*HCL(pH2.2)，温和振荡10 min，洗脱特异性结合的噬菌体，用150 μ1 1 mol/L Tris*Cl(pH9.1)中和，立即加入20 ml对数生长期ER2537，37 °C孵育4.5 h，扩增特异性吸附的重组噬菌体。以PEG/NaCl沉淀噬菌体上清，在LB/IPTG/X-gal平板上测定扩增噬菌体的滴度，由此完成一轮panning筛选。用2×1011 pfu的第1轮洗脱噬菌体加至同样包被的平板，进行第2轮panning筛选。重复进行第3轮panning后，不需扩增，在LB/IPTG/X-gal平板上挑取噬斑进行测序。jh9u, 百拇医药
1.2.5 ELISA法检测噬菌体表面呈现小肽的结合活性：第3轮筛选结束后，从LB/IPTG/X-gal平皿上随机挑选50个分隔良好的兰色噬斑，分别接种在对数生长期ER2537中，37 °C培养4.5 h，培养物离心后，取上清即为单个克隆的重组噬菌体。96孔酶联板上，实验孔均用100 ng靶蛋白/100 μ1/孔包被，阴性对照孔用200 μ1 0.5%BSA包被，4 °C包被过夜，2%BSA-TBS，4 °C封闭1～2 h后，实验孔加入200 μ1待测阳性克隆的噬菌体上清为待检小肽，25 °C反应2 h，PBST-0.05% Tween20洗板6次，每孔加入稀释至工作浓度的HRP/鼠抗M13噬菌体抗体。室温反应1 h，PBST-0.05%Tween20洗板6次，加入ABTS显色溶液，室温显色，测410 nm处每孔的OD值。
1.2.6 与EphB2受体结合的噬菌体小肽的序列测定： 从4 °C贮存的阳性克隆菌种，接种于ER2537培养液中，37 °C振荡培养4.5 h，按M13 DNA提取试剂盒说明书提取M13噬菌体单链DNA，紫外定量，取100 ng作模板，-96gⅢ测序引物，PE公司自动ABI PRISMTM310测序仪测序。+?/, http://www.100md.com
2 结果+?/, http://www.100md.com
2.1 融合蛋白的表达 从图1可见重组菌有一明显的20 kD左右新生蛋白带，薄层扫描分析显示：蛋白的表达量约占菌体蛋白的27%。对表达蛋白的可溶性分析表明：融合表达产物主要以不溶的包涵体的形式存在。
+?/, http://www.100md.com图1蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳分析+?/, http://www.100md.com
Fig 1SDS-PAGE analysis for the expression form+?/, http://www.100md.com
D：deposition； S：supernatant； T：total lysate of the recombinant E.coli； E：lysate of host E.coli with empty vector；+?/, http://www.100md.com
M：markers：97.4 ku；66.2 ku；43.0 ku；31.0 ku；14.4 ku(from top to bottom)+?/, http://www.100md.com
2.2 重组蛋白的纯化 从重组菌中制备的包涵体经洗涤后，用盐酸胍变性，上到Ni-NTA金属螯合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。由15%的SDS-PAGE(见图2)，利用这种方法可有效地纯化目的蛋白，经薄层扫描分析纯度可达90%以上(图略)。经ELISA证实该复性蛋白可与其天然配体结合。
+?/, http://www.100md.com图2SDS-PAGE分析EphB2配体结合区的纯化+?/, http://www.100md.com
Fig 2SDS-PAGE analysis for the purification of the ligand binding domain of EphB2
1：the total protein of recombinant stain；2：marker：66 ku；55 ku；45 ku；40 ku；36 ku；29 ku；24 ku；18 ku；14 ku(form top to bottom)；3：lysate of E.coli JM109(DE3)containing empty vector pRSET A；4：denatured protein eluted from Ni-NTA agarose|/0, http://www.100md.com
将分步收集液中含目的蛋白的各管合并，缓慢、逐步降低透析液中尿素浓度，使变性的蛋白在此过程中自然复性。复性后的目的蛋白经冻干保存。|/0, http://www.100md.com
2.3 ELISA检测噬菌体表面呈现小肽结合活性 第3轮筛选结束后，随机挑取LB/IPTG/X-gal平皿上50个蓝色噬斑分别经ER2537扩增后，收集重组噬菌体的上清，进行ELISA检测，实验中设置了阴性抗原(BSA)对照组。结果显示：阴性对照孔读数0.034，其余各阴性孔读数0.034～0.056，可以与EphB2特异性结合，而与包被的BSA无结合反应的13个阳性克隆孔读数均大于0.1(见表1)。|/0, http://www.100md.com
表1 阳性噬菌体克隆ELISA显色的光吸收值|/0, http://www.100md.com
Tab 1 Result of the positive phage clones by ELISA phage clone|/0, http://www.100md.com
OD410|/0, http://www.100md.com
St2|/0, http://www.100md.com
0.197|/0, http://www.100md.com
St3|/0, http://www.100md.com
0.103|/0, http://www.100md.com
St6|/0, http://www.100md.com
0.123|/0, http://www.100md.com
St8|/0, http://www.100md.com
0.432|/0, http://www.100md.com
St9|/0, http://www.100md.com
0.307
St13[k*5[, 百拇医药
0.247[k*5[, 百拇医药
St15[k*5[, 百拇医药
0.804[k*5[, 百拇医药
St27[k*5[, 百拇医药
0.173[k*5[, 百拇医药
St28[k*5[, 百拇医药
0.334[k*5[, 百拇医药
St44[k*5[, 百拇医药
0.223[k*5[, 百拇医药
St45[k*5[, 百拇医药
0.356[k*5[, 百拇医药
St46[k*5[, 百拇医药
0.368[k*5[, 百拇医药
St47[k*5[, 百拇医药
0.344[k*5[, 百拇医药
BSA[k*5[, 百拇医药
0.034[k*5[, 百拇医药
2.4 与EphB2受体结合的噬菌体小肽的序列测定 从4 °C贮存的阳性克隆菌种，扩增后按M13DNA提取试剂盒说明书提取M13噬菌体单链DNA，紫外定量，-96gⅢ测序引物，PE公司自动测序仪进行序列分析，并推导出外源短肽的氨基酸序列，结果分析如下(手工排序)：
[k*5[, 百拇医药13个阳性克隆的氨基酸序列，其中有共同的较保守LXHSKQ，(L)SRT/S，及RR A/X P/X R/X序列，ST45与ST28号克隆，ST46与ST47号克隆序列完全相同。[k*5[, 百拇医药
3 讨论[k*5[, 百拇医药
pRSET是一高效原核表达载体，其多克隆酶切位点上游有编码6个连续组氨酸残基的序列(6×His tag)，在重组质粒进行诱导表达时，6×His tag与外源插入片段共同表达，表达后的融合蛋白带有6×His tag，融合的蛋白较小，只有20个氨基酸左右，即使不进行切割，也不影响蛋白的活性，且可使表达的蛋白与金属镍发生螯合，从而可进行Ni2+螯合亲和层析，使得蛋白变性液中的目的蛋白在流经柱床时被特异性吸附，再利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白[6]。本研究结果显示该方法切实可行。
肽文库是一定长度肽段的混合物，里面包含所有可能的氨基酸排列信息，KIMURA[7]用人血小板生成素(TPO)受体c-mpl的胞外区从噬菌体表面呈现肽文库筛选得到与c-mpl结合的肽激动剂PKlM，能刺激TPO依赖的细胞增殖，并能诱导JAK2的酪氨酸磷酸化和STAT5的活化。有望设计为TPO的小分子模拟。这种筛选功能性短肽的研究策略对于EphB2及其配体的研究有很大的借鉴意义，Eph受体的信号转导是通过与其跨膜或聚集型配体(ephrin)的结合而启动，需要细胞间接触而被活化，进而发生受体自身磷酸化和与细胞中其下游信号蛋白分子结合，最终导致一定生理效应。EphB2的跨膜配体ephrin-B1(formerly Elk-L/Lerk2)体外对毛细管的诱导与angiopoietin-1(Ang1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的功效类似，且内皮细胞与周围间充质细胞的相互作用需ephrinB2配体和EphB2受体间的信号传导[8]。我们从噬菌体表面呈现多肽库中经3轮吸附-洗涤-洗脱的筛选富集过程，得到多个能与目标蛋白专一结合的噬菌体阳性克隆，即可结合EphB2的短肽，有较保守而集中的基序，有可能是其天然配体的拮抗剂，而阻断或激活EphB2活性。下一步将人工合成短肽及改造并进行模拟短肽的功能特性研究。yw#l, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39800027)yw#l, http://www.100md.com
[作者简介] 张晓光(1968-)，女，辽宁盖州市人，讲师，博士，主要从事分子免疫学研究。yw#l, http://www.100md.com
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[收稿日期] 2000-02-23； [修回日期] 2000-05-10(张晓光 韩炯 韩景田 刘新平 药立波 聂晓燕 苏成芝)