汉坦病毒基因变异研究进展
作者：曲虹 杨占秋
单位：湖北医科大学病毒学研究所，武汉 430071
关键词：
病毒学报000320 中图分类号：R373.3+2 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0289-03
自1976年韩国学者Lee从黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒(HV)以来，迄今已确立了16种血清型/基因型的HV，且不断发现新的毒株，如日本的Tobetsu病毒[1]，波利维亚的Rio Mamore病毒[2]和西伯利亚的Topografov病毒[3]。HV与其它由节肢动物传播的布尼亚病毒科病毒不同，它由特殊的啮齿类或食虫类动物作为其储存宿主，目前仅有5%的啮齿类动物检测到HV[4]，这提示未来可能会发现新的毒株类型。
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1 HV的基因特征
HV是单股负链RNA病毒，通过对原型株(76-118)的研究揭示病毒的基因组分为大(L)、中(M)、小(S)3个片段，其长度各为6.5～7.0kb、3.6～3.7kb和1.6～2.1kb，分别编码RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)，糖蛋白(glycoprotein，GP)G1和G2及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)[5]。3个片段的3′端核苷酸序列保守，均为“aucaucaucug”，并与5′端反向互补，形成环状或手柄样二级结构，这种互补序列被认为在病毒的复制和转录的调节中起作用。其手柄样连接至少包括17个bp，其中14个bp为属特异性的。根据目前HV序列资料，此结构并非完全互补，在位置9有一碱基错配[6]。在Hantaan(HTN)、Seoul(SEO)、Puumala(PUU)、Sin Nombre(SN)和Black Creek Canal(BCC)位置10有一非常规的U-G配对，而在Bayou(BAY)、Prospect Hill(PH)上则由A替换G恢复其常规配对。
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目前已获得HTN、SEO、PUU、SN和TUL 5个型的病毒代表株的全基因序列。其它毒株只有部分序列资料：BCC和PH毒株的S、M片段全序列和L片段部分序列；BAY、Dobrava(DOB)、Elmoro Canyon(ELMC)和New York(NY)株的M、S片段全序列。Sami[7]对Tula(TUL)、PUU、SN、HTN、SEO株3个基因片段及其编码产物的比较发现，除S片段外，L、M片段差别不大。L片段编码区较S、M更为保守。S片段的3′端非编码区(3′NCR)变异大。S片段的3′NCR是HV基因组中最敏感的部分。对于同一型的HV毒株，此区序列及长度高度保守，提示它可能承担某种功能角色。然而在不同型的HV中，其S片段3′NCR核苷酸序列除了手柄状部分外，差异较大，该区域对病毒进化的研究有一定的帮助[8]。在BAY、BCC、ELMC、Isla Vista(ILV)、Khabarousk(KBR)、NY、PH、PUU、Rio Segundo(RIOS)，SN和TUL的S片段上存在编码非结构蛋白NSS(7～10kD)的ORF，但此结构不存在于HTN、、SEO、DOB中[9]。其原因尚未得到解释。
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Alexander分别根据不同毒株L、M、S片段的核苷酸序列所建立的种系发生树，将HV分为三种类型：(1)HTN样病毒(HTN、SEO和DOB)；(2)PUU-PH样病毒(PUU、PH、TUL、KBR和ISL)；(3)SN样病毒(SN、NY、BAY、BCC、ELMC和RIOS)。这说明这些毒株3个基因片段存在三种相似的进化历程。
尽管核苷酸序列显示较大差异,但HV在氨基酸水平却高度保守，说明有强大的进化压力以维持蛋白功能的完整性。HV的L蛋白至少可被作为复制酶、转录酶和内切酶。L蛋白N端1/3有两处拥有与其它分节段负链RNA病毒多聚酶相似的元件(motif)；其中间1/3为所有依赖RNA的RNA多聚酶共有的元件；且L蛋白有一个富含酸性氨基酸的C末端。对M片段cDNA潜在读码框架的分析表明：此cDNA为单一的开放读码框架(ORF)，编码包括G1和G2两个糖蛋白的前体大蛋白。其mRNA的蛋白编码顺序为5′-G1-G2-3′。HV M基因片段中部有一个由5个氨基酸残基(WAASA)组成的共翻译切割点，在细胞内质网内将前体大蛋白切割加工成G1和G2两个蛋白。在所有的HV中，G1含有三个糖基化位点，G2含有一个，许多毒株尚有增加的糖基化位点。G1被认为含有进入高尔基复合体的元件[10]。当G1、G2共同表达时，G1将G2带入高尔基体中。G1、G2富含半胱氨酸。其分子形成的二硫键对G1和G2的空间构象起很大作用。HV的核衣壳蛋白由包括4个保守半胱氨酸的428～433个氨基酸组成，并在感染细胞中高度表达，形成大颗粒状或丝状的包含体。其N末端的氨基酸主要是亲水性的，且具有高度的抗原保守性——许多PUU和TUL单克隆抗体及部分HTN单克隆抗体与此区相联系，而且几乎所有人类HV血清抗体都能识别此区；该蛋白的中间部分主要是亲水性区域，在不同的HV中变异较大[11-12]；其C端保守，是连接RNA的部位。在氨基酸水平上，L蛋白和G2糖蛋白最保守，而G1糖蛋白的差异最大。
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2 血清型与基因变异
HV的血清型别因其分离宿主的不同而不同。大多数学者认为，动物宿主对HV的进化和变异具有决定 性的作用。该病毒宿主范围广，但以鼠为主。鼠的种类基本上决定了其所携带病毒的型别。对于同一血清型，基因变异显示出地域聚集性，这与小啮齿类动物常年生活在一定范围内的生活习性有关。HV分离的时间对基因变异影响较小，其进化形式类似于水泡性口炎病毒，与地理分布有关而与时间间隔无关。
Dragana根据宿主的不同将HV分为两种进化途径：(1)以Apodemus和Rattus传播的病毒，如HTN和SEO病毒；(2)以Clethrinomys和Microtus传播的病毒，如PH和PUU病毒。对目前所知唯一由食虫类所携带的TPM毒株的序列研究显示，该病毒与其它啮齿类传播的HV相比，具有不同的祖先。假设HV并不存在啮齿类——食虫类之间的交互传播，那么该病毒就可能已经存在了许多年。
为比较各型病毒之间的同源性，利用分子生物学微机软件，可将它们之间的亲缘关系用图形加以表达，即HV的种系发生树(phylogenetic tree)。通过序列种系发生比较：HTN和SEO同源性较高，PUU和PH同源性较高，而这两类之间则存在较大的差异。
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目前在中国只发现HTN和SEO两种病毒。虽然存在Clethronomys，但未见PUU相关病毒的报道。无论其分离宿主或地理区域的不同，HTN和SEO同型之间同源性大于92%。Liang通过对中国宿主鼠和病人血清中分离的15株HV M片段比较发现，在中国HTN存在三种基因亚型，一种SEO基因亚型。姚智慧新近报道，通过对分离自我国褐家鼠的Gou3株M片段全基因序列分析证实，Gou3株是一不同于现已报告的SEO型毒株的新亚型。
同一宿主分离毒株的种系发生相似性，进一步支持了HV与其自然宿主共进化的假说[13]。迄今研究表明，HV不同血清型甚至同一血清型不同毒株之间存在核苷酸序列的差异。自然宿主的无症状持续性感染提供了病毒基因漂移(碱基替换、缺失或插入)和基因转换(基因组片段重组)的机会，此为RNA病毒进化的两个主要因素[14]。基因漂移是一种变异幅度小的量变过程，其变异原因是基因组发生点突变，经过人群免疫压力的选择而产生。基因转换则是一种变异幅度大，形成新亚型即新毒株的质变过程，是由于两株不同亚型的病毒感染同一宿主细胞时，它们分节段的基因之间发生基因重分配，从而导致新亚型的产生。基因漂移可能是HV基因变异的主要因素。
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HV为分节段RNA病毒。由于RNA病毒缺少校正酶，故较DNA病毒更易发生变异。且分节段的RNA病毒在双重感染宿主细胞时有重排基因片段的能力。有证据表明，布尼亚病毒科节肢动物传播的病毒中，基因重排参与了进化。大量研究表明，在这些病毒中存在高频基因重排。在同一血清型双重感染的节肢动物体内或体外组织培养中发现重组现象。关于HV基因重组的能力所知甚少，Li和Henderson通过对分离自患者和不同地区啮齿动物SNV RNA序列的比较表明，SNV自然变异株中存在基因重组[15，16]，重组率为48.6%，其中M片段重组率高(14～17)，S和L片段重组率分别为2/35和1/35。Rodriguez[17]第一次获得直接证据显示了HV的基因重组现象，他将SNV株的NMR11和CC107双重感染Vero-E6细胞，获得了6株重组株，且所有的重组株均包括NMR11的L片段，这说明基因重排并不是随机的。其中包括单个片段来源于不同亲代的子代重组株，这可能是基因重排的中间状态。此双倍体基因亚型在子代中比例高达30%。作者同时比较了SNV的MR11和来自不同宿主(棉鼠)的BCCV，其重组率明显低于SNV同型病毒间的比较。这种低重组率可能是由于SNV-NMR11和BCCV核苷酸序列有30%不一致,因而超过了同源基因的重排能力。不同宿主来源的毒株能够发生重组，表明自然界可能会出现新的毒株类型。
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3 毒力变异的研究
HV致病特征有两种表现：肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征。其中HTN、SEO、DOB、PUU引起HFRS，表现为发热、肾损害及出血症状；SN及相关病毒引起HPS，表现为急性呼吸功能衰竭；PH、TUL、Khabarousk等与人类致病无关。由于缺乏理想的致病模型和弱毒株的获取较少，目前仅限于通过空斑特性、温度敏感性、细胞融合活性、对靶细胞的敏感性等方法筛选强、弱毒克隆来进行HV毒力的研究。
HV M基因片段G1编码区决定病毒毒力及感染性。Arikawa等研究表明，HTNV与靶细胞融合蛋白位点均存在于病毒糖蛋白上。同其它包膜RNA病毒一样，表面糖蛋白位点的变化可使病毒类型发生重大改变。Pilaski指出，在G2糖蛋白上失去一个位点的变异株具有较高的毒力。Schmaljohn等[18-20]指出，重组株、蛋白糖基化和酰基化改变的变异株具有较高的毒力。
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Tamura等发现，HTNV在E6细胞上连续传代后，其生物学特性逐渐改变，仅20代就表现为乳鼠体内毒力减弱。AKE LUNOKVIST[21]发现，Kazan(属PUU型)野生株能有效感染动物，在其肺组织中查见N抗原；而Vero-E6细胞传代的病毒株则失去了感染能力。Kirill[22]在对DOB研究中发现，某些地区的DOB较另一些地区的有更高的毒力。这种差异可能是因为宿主的不同所致，即A.flavicallis致巴尔干流行的毒株较A.agrarius致俄罗斯流行的毒株有更高的毒力。
邱建明等对从A9株中克隆纯化出来的强毒株A9v和弱毒株A39s的氨基酸序列分析提示，A39s病毒G1糖蛋白C末端亲水肽第614位氨基酸突变，影响了亲水肽介导的病毒与细胞株的融合活性，致使病毒毒力减弱。Isegawa等测定HTNV76-118株弱毒克隆HVCL-2及强毒克隆HVCL-1的L、M、S片段的核苷酸序列，发现L、S片段序列无差异，唯一差别是M片段编码的1 124位氨基酸位点上，在HVCL-1为丝氨酸，在HVCL-2被甘氨酸取代。
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总的看来，HV的基因相当稳定和保守，其变异速率较慢，但有时即使微小的变异(几个乃至一个氨基酸的变化)，都可能引起病毒毒力即致病性的显著变化。
4 PCR技术研究基因变异
PCR近年来用于HV变异性及相关性方面的研究。目前PCR对HV变异的研究有两种思路：(1)应用互补于病毒M基因非保守区的分型引物进行靶基因的扩增，然后应用酶切、核酸杂交或内引物扩增对产物作进一步鉴定；(2)用互补于M基因保守区的共同引物对不同背景的病毒mRNA进行扩增，继之对产物进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)分型。
Tang等成功地以HTN和SEO M基因片段型特异性引物扩增出Hantaan-和Seoul-相关毒株，并提示PCR方法可以区别更多来自不同宿主的HV。Xiao等利用M片段属特异性引物扩增41株分离株，并用一系列的限制酶切割扩增产物，其中有一株不能扩增出来，且PCR产物酶切片段甚至在同一血清型中存在差异。这一结果强有力地证明了HV存在基因变异。Pilaipan用S片段属特异性引物和M片段型特异性引物将27株中的26株分为4个不同的类型,即HTN、SEO、PUU和PH。其中Leakey病毒能同时被SEO和PUU引物扩增，且酶切片段与两型标准株相同，可能的解释是实验中交互污染,或分离于感染两型病毒的宿主,或是两型毒株的重组株。
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近年来PCR也用于鉴定新型HV。一般而言，如果一株分离株在GPC ORF上核苷酸较标准株有大于25%的差异，则被认为是新型HV；差异在15%～25%的需根据种系发生来判定；在氨基酸水平，核衣壳蛋白有5%～6%的差异则为新型HV[23]。Xiao指出，HV属中相关M片段大约221bp区非常相似，可作为快速鉴定新毒株的手段。通过RT-PCR将分离的DOB病毒M片段与已知HV比较，同源性为41.7%。美国疾病预防控制中心的科学家根据HV核酸保守序列设计引物，1993年将从疫区鹿鼠及病人血清中扩增的片段序列与其它HV相应序列比较，其差异至少为30%，鉴定其为HV一个新的亚型，并同时证明这种新的HV就是新的致病原。
HV所致人类疾病危害较大，目前对HV基因变异的研究方兴未艾。许多国内外学者利用各种技术手段仅认识到病毒变异这一现象，而对病毒变异规律尚未见报道。对不同宿主、不同地域、不同时间HV分离株基因变异的流行病学研究将为新毒株的预测和防治措施的建立提供理论依据。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870659)
作者简介：曲虹(1974-)，女，硕士，研究医学病毒学。
联系作者：杨占秋
参考文献：
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收稿日期：1999-10-21；修回日期：2000-03-27, http://www.100md.com
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病毒学报000320 中图分类号：R373.3+2 文献标识码：A
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自1976年韩国学者Lee从黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒(HV)以来，迄今已确立了16种血清型/基因型的HV，且不断发现新的毒株，如日本的Tobetsu病毒[1]，波利维亚的Rio Mamore病毒[2]和西伯利亚的Topografov病毒[3]。HV与其它由节肢动物传播的布尼亚病毒科病毒不同，它由特殊的啮齿类或食虫类动物作为其储存宿主，目前仅有5%的啮齿类动物检测到HV[4]，这提示未来可能会发现新的毒株类型。
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1 HV的基因特征
HV是单股负链RNA病毒，通过对原型株(76-118)的研究揭示病毒的基因组分为大(L)、中(M)、小(S)3个片段，其长度各为6.5～7.0kb、3.6～3.7kb和1.6～2.1kb，分别编码RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)，糖蛋白(glycoprotein，GP)G1和G2及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)[5]。3个片段的3′端核苷酸序列保守，均为“aucaucaucug”，并与5′端反向互补，形成环状或手柄样二级结构，这种互补序列被认为在病毒的复制和转录的调节中起作用。其手柄样连接至少包括17个bp，其中14个bp为属特异性的。根据目前HV序列资料，此结构并非完全互补，在位置9有一碱基错配[6]。在Hantaan(HTN)、Seoul(SEO)、Puumala(PUU)、Sin Nombre(SN)和Black Creek Canal(BCC)位置10有一非常规的U-G配对，而在Bayou(BAY)、Prospect Hill(PH)上则由A替换G恢复其常规配对。
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目前已获得HTN、SEO、PUU、SN和TUL 5个型的病毒代表株的全基因序列。其它毒株只有部分序列资料：BCC和PH毒株的S、M片段全序列和L片段部分序列；BAY、Dobrava(DOB)、Elmoro Canyon(ELMC)和New York(NY)株的M、S片段全序列。Sami[7]对Tula(TUL)、PUU、SN、HTN、SEO株3个基因片段及其编码产物的比较发现，除S片段外，L、M片段差别不大。L片段编码区较S、M更为保守。S片段的3′端非编码区(3′NCR)变异大。S片段的3′NCR是HV基因组中最敏感的部分。对于同一型的HV毒株，此区序列及长度高度保守，提示它可能承担某种功能角色。然而在不同型的HV中，其S片段3′NCR核苷酸序列除了手柄状部分外，差异较大，该区域对病毒进化的研究有一定的帮助[8]。在BAY、BCC、ELMC、Isla Vista(ILV)、Khabarousk(KBR)、NY、PH、PUU、Rio Segundo(RIOS)，SN和TUL的S片段上存在编码非结构蛋白NSS(7～10kD)的ORF，但此结构不存在于HTN、、SEO、DOB中[9]。其原因尚未得到解释。
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Alexander分别根据不同毒株L、M、S片段的核苷酸序列所建立的种系发生树，将HV分为三种类型：(1)HTN样病毒(HTN、SEO和DOB)；(2)PUU-PH样病毒(PUU、PH、TUL、KBR和ISL)；(3)SN样病毒(SN、NY、BAY、BCC、ELMC和RIOS)。这说明这些毒株3个基因片段存在三种相似的进化历程。
尽管核苷酸序列显示较大差异,但HV在氨基酸水平却高度保守，说明有强大的进化压力以维持蛋白功能的完整性。HV的L蛋白至少可被作为复制酶、转录酶和内切酶。L蛋白N端1/3有两处拥有与其它分节段负链RNA病毒多聚酶相似的元件(motif)；其中间1/3为所有依赖RNA的RNA多聚酶共有的元件；且L蛋白有一个富含酸性氨基酸的C末端。对M片段cDNA潜在读码框架的分析表明：此cDNA为单一的开放读码框架(ORF)，编码包括G1和G2两个糖蛋白的前体大蛋白。其mRNA的蛋白编码顺序为5′-G1-G2-3′。HV M基因片段中部有一个由5个氨基酸残基(WAASA)组成的共翻译切割点，在细胞内质网内将前体大蛋白切割加工成G1和G2两个蛋白。在所有的HV中，G1含有三个糖基化位点，G2含有一个，许多毒株尚有增加的糖基化位点。G1被认为含有进入高尔基复合体的元件[10]。当G1、G2共同表达时，G1将G2带入高尔基体中。G1、G2富含半胱氨酸。其分子形成的二硫键对G1和G2的空间构象起很大作用。HV的核衣壳蛋白由包括4个保守半胱氨酸的428～433个氨基酸组成，并在感染细胞中高度表达，形成大颗粒状或丝状的包含体。其N末端的氨基酸主要是亲水性的，且具有高度的抗原保守性——许多PUU和TUL单克隆抗体及部分HTN单克隆抗体与此区相联系，而且几乎所有人类HV血清抗体都能识别此区；该蛋白的中间部分主要是亲水性区域，在不同的HV中变异较大[11-12]；其C端保守，是连接RNA的部位。在氨基酸水平上，L蛋白和G2糖蛋白最保守，而G1糖蛋白的差异最大。
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2 血清型与基因变异
HV的血清型别因其分离宿主的不同而不同。大多数学者认为，动物宿主对HV的进化和变异具有决定 性的作用。该病毒宿主范围广，但以鼠为主。鼠的种类基本上决定了其所携带病毒的型别。对于同一血清型，基因变异显示出地域聚集性，这与小啮齿类动物常年生活在一定范围内的生活习性有关。HV分离的时间对基因变异影响较小，其进化形式类似于水泡性口炎病毒，与地理分布有关而与时间间隔无关。
Dragana根据宿主的不同将HV分为两种进化途径：(1)以Apodemus和Rattus传播的病毒，如HTN和SEO病毒；(2)以Clethrinomys和Microtus传播的病毒，如PH和PUU病毒。对目前所知唯一由食虫类所携带的TPM毒株的序列研究显示，该病毒与其它啮齿类传播的HV相比，具有不同的祖先。假设HV并不存在啮齿类——食虫类之间的交互传播，那么该病毒就可能已经存在了许多年。
为比较各型病毒之间的同源性，利用分子生物学微机软件，可将它们之间的亲缘关系用图形加以表达，即HV的种系发生树(phylogenetic tree)。通过序列种系发生比较：HTN和SEO同源性较高，PUU和PH同源性较高，而这两类之间则存在较大的差异。
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目前在中国只发现HTN和SEO两种病毒。虽然存在Clethronomys，但未见PUU相关病毒的报道。无论其分离宿主或地理区域的不同，HTN和SEO同型之间同源性大于92%。Liang通过对中国宿主鼠和病人血清中分离的15株HV M片段比较发现，在中国HTN存在三种基因亚型，一种SEO基因亚型。姚智慧新近报道，通过对分离自我国褐家鼠的Gou3株M片段全基因序列分析证实，Gou3株是一不同于现已报告的SEO型毒株的新亚型。
同一宿主分离毒株的种系发生相似性，进一步支持了HV与其自然宿主共进化的假说[13]。迄今研究表明，HV不同血清型甚至同一血清型不同毒株之间存在核苷酸序列的差异。自然宿主的无症状持续性感染提供了病毒基因漂移(碱基替换、缺失或插入)和基因转换(基因组片段重组)的机会，此为RNA病毒进化的两个主要因素[14]。基因漂移是一种变异幅度小的量变过程，其变异原因是基因组发生点突变，经过人群免疫压力的选择而产生。基因转换则是一种变异幅度大，形成新亚型即新毒株的质变过程，是由于两株不同亚型的病毒感染同一宿主细胞时，它们分节段的基因之间发生基因重分配，从而导致新亚型的产生。基因漂移可能是HV基因变异的主要因素。
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HV为分节段RNA病毒。由于RNA病毒缺少校正酶，故较DNA病毒更易发生变异。且分节段的RNA病毒在双重感染宿主细胞时有重排基因片段的能力。有证据表明，布尼亚病毒科节肢动物传播的病毒中，基因重排参与了进化。大量研究表明，在这些病毒中存在高频基因重排。在同一血清型双重感染的节肢动物体内或体外组织培养中发现重组现象。关于HV基因重组的能力所知甚少，Li和Henderson通过对分离自患者和不同地区啮齿动物SNV RNA序列的比较表明，SNV自然变异株中存在基因重组[15，16]，重组率为48.6%，其中M片段重组率高(14～17)，S和L片段重组率分别为2/35和1/35。Rodriguez[17]第一次获得直接证据显示了HV的基因重组现象，他将SNV株的NMR11和CC107双重感染Vero-E6细胞，获得了6株重组株，且所有的重组株均包括NMR11的L片段，这说明基因重排并不是随机的。其中包括单个片段来源于不同亲代的子代重组株，这可能是基因重排的中间状态。此双倍体基因亚型在子代中比例高达30%。作者同时比较了SNV的MR11和来自不同宿主(棉鼠)的BCCV，其重组率明显低于SNV同型病毒间的比较。这种低重组率可能是由于SNV-NMR11和BCCV核苷酸序列有30%不一致,因而超过了同源基因的重排能力。不同宿主来源的毒株能够发生重组，表明自然界可能会出现新的毒株类型。
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3 毒力变异的研究
HV致病特征有两种表现：肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征。其中HTN、SEO、DOB、PUU引起HFRS，表现为发热、肾损害及出血症状；SN及相关病毒引起HPS，表现为急性呼吸功能衰竭；PH、TUL、Khabarousk等与人类致病无关。由于缺乏理想的致病模型和弱毒株的获取较少，目前仅限于通过空斑特性、温度敏感性、细胞融合活性、对靶细胞的敏感性等方法筛选强、弱毒克隆来进行HV毒力的研究。
HV M基因片段G1编码区决定病毒毒力及感染性。Arikawa等研究表明，HTNV与靶细胞融合蛋白位点均存在于病毒糖蛋白上。同其它包膜RNA病毒一样，表面糖蛋白位点的变化可使病毒类型发生重大改变。Pilaski指出，在G2糖蛋白上失去一个位点的变异株具有较高的毒力。Schmaljohn等[18-20]指出，重组株、蛋白糖基化和酰基化改变的变异株具有较高的毒力。
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Tamura等发现，HTNV在E6细胞上连续传代后，其生物学特性逐渐改变，仅20代就表现为乳鼠体内毒力减弱。AKE LUNOKVIST[21]发现，Kazan(属PUU型)野生株能有效感染动物，在其肺组织中查见N抗原；而Vero-E6细胞传代的病毒株则失去了感染能力。Kirill[22]在对DOB研究中发现，某些地区的DOB较另一些地区的有更高的毒力。这种差异可能是因为宿主的不同所致，即A.flavicallis致巴尔干流行的毒株较A.agrarius致俄罗斯流行的毒株有更高的毒力。
邱建明等对从A9株中克隆纯化出来的强毒株A9v和弱毒株A39s的氨基酸序列分析提示，A39s病毒G1糖蛋白C末端亲水肽第614位氨基酸突变，影响了亲水肽介导的病毒与细胞株的融合活性，致使病毒毒力减弱。Isegawa等测定HTNV76-118株弱毒克隆HVCL-2及强毒克隆HVCL-1的L、M、S片段的核苷酸序列，发现L、S片段序列无差异，唯一差别是M片段编码的1 124位氨基酸位点上，在HVCL-1为丝氨酸，在HVCL-2被甘氨酸取代。
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总的看来，HV的基因相当稳定和保守，其变异速率较慢，但有时即使微小的变异(几个乃至一个氨基酸的变化)，都可能引起病毒毒力即致病性的显著变化。
4 PCR技术研究基因变异
PCR近年来用于HV变异性及相关性方面的研究。目前PCR对HV变异的研究有两种思路：(1)应用互补于病毒M基因非保守区的分型引物进行靶基因的扩增，然后应用酶切、核酸杂交或内引物扩增对产物作进一步鉴定；(2)用互补于M基因保守区的共同引物对不同背景的病毒mRNA进行扩增，继之对产物进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)分型。
Tang等成功地以HTN和SEO M基因片段型特异性引物扩增出Hantaan-和Seoul-相关毒株，并提示PCR方法可以区别更多来自不同宿主的HV。Xiao等利用M片段属特异性引物扩增41株分离株，并用一系列的限制酶切割扩增产物，其中有一株不能扩增出来，且PCR产物酶切片段甚至在同一血清型中存在差异。这一结果强有力地证明了HV存在基因变异。Pilaipan用S片段属特异性引物和M片段型特异性引物将27株中的26株分为4个不同的类型,即HTN、SEO、PUU和PH。其中Leakey病毒能同时被SEO和PUU引物扩增，且酶切片段与两型标准株相同，可能的解释是实验中交互污染,或分离于感染两型病毒的宿主,或是两型毒株的重组株。
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近年来PCR也用于鉴定新型HV。一般而言，如果一株分离株在GPC ORF上核苷酸较标准株有大于25%的差异，则被认为是新型HV；差异在15%～25%的需根据种系发生来判定；在氨基酸水平，核衣壳蛋白有5%～6%的差异则为新型HV[23]。Xiao指出，HV属中相关M片段大约221bp区非常相似，可作为快速鉴定新毒株的手段。通过RT-PCR将分离的DOB病毒M片段与已知HV比较，同源性为41.7%。美国疾病预防控制中心的科学家根据HV核酸保守序列设计引物，1993年将从疫区鹿鼠及病人血清中扩增的片段序列与其它HV相应序列比较，其差异至少为30%，鉴定其为HV一个新的亚型，并同时证明这种新的HV就是新的致病原。
HV所致人类疾病危害较大，目前对HV基因变异的研究方兴未艾。许多国内外学者利用各种技术手段仅认识到病毒变异这一现象，而对病毒变异规律尚未见报道。对不同宿主、不同地域、不同时间HV分离株基因变异的流行病学研究将为新毒株的预测和防治措施的建立提供理论依据。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870659)
作者简介：曲虹(1974-)，女，硕士，研究医学病毒学。
联系作者：杨占秋
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收稿日期：1999-10-21；修回日期：2000-03-27, http://www.100md.com