熊猫等动物犬瘟热病毒附着蛋白基因的遗传多样性
作者：范泉水 邱薇 何洪彬 李金中 夏咸柱 余春 黄耕 殷震
单位：范泉水 邱薇(成都军区联勤部军事医学研究所，云南 昆明 650032)；何洪彬(东北农业大学生命科学院，黑龙江 哈尔滨 150030)；李金中 夏咸柱 余春 黄耕 殷震(解放军农牧大学兽医研究所，吉林 长春 130062)
关键词：犬瘟热病毒；附着蛋白基因；遗传多样性
病毒学报000310摘要：为了研究犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)大熊猫株、小熊猫株和长春犬株附着蛋白(H)基因的遗传变异，对H基因进行了序列测定。上述3个CDV毒株的H基因全长均为1?946bp，开放阅读框架(ORF)始于21～23位的ATG，终止于1?842～1?844位的TGA，编码607个氨基酸。与GenBank中15个CDV株推导的H蛋白氨基酸序列比较发现，16个野毒株潜在的N-联糖基化位点为8或9个，而疫苗株Onderstepoort和Convac分别为4个和7个，其中309～311位氨基酸所形成的潜在的糖基化位点是疫苗株没有而野毒株共有的，N-联糖基化位点的不同可能影响H蛋白的抗原性。用DNASIS软件分析H基因的系统发生，其中野毒株组成一组，该组又分成5个谱系，分别为GP、LP、MINK，2544、404、4513、DANDOG，A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG，HAMA、UENO，GREEN、LIU谱系；而疫苗株与野毒株H基因之间存在明显的差异，组成了另一组，上述结果表明CDV H蛋白基因存在基因型的差别，具有广泛的遗传多样性。
, 百拇医药
中图分类号：S852.65+9.5; Q522+.6 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0238-04
Phylogenetic Analysis of the Haemagglutinin Protein Gene of Canine Distemper Virus from Giant Panda and Other Animals in China
HE Hong-bin
(The Veterinary Institute, University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun 130062, China)
, 百拇医药 XIA Xian-zhu，LI Jin-zhong，YU Chun，HUANG Geng，YIN Zhen
(Department of Biological Science, Northeastern Agricultural University, Harbin 150030, China)
FAN Quan-shui，QIU Wei
(Institute of Military Medical Sciences, Chengdu Military Command, Kunming 650032, China)
Abstract: To characterize the genetic variation of haemagglutinin (H) protein gene of strains of canine distemper virus (CDV) -GP, LP and LIU strains-from giant panda, lesser panda and dog in China, we conducted nucleotide sequence analysis of the H gene. The 1946 nt of the complete H gene sequences of the three strains showed that the largest open reading frame (ORF) encoding a protein of 607 amino acid residues started at the ATG at position 21～23 and extended to a termination codon TGA at position 1?842～1?844. The deduced amino acid sequences of the H protein of the Chinese strains were compared with those of other CDV strains extracted from the GenBank or EMBL database. It showed that there are eight or nine potential sites for asparagine -linked glycosylation in the H proteins of 16 field isolates, in contrast to four or seven in those of the vaccine strains-onderstepoort and convac strains. The potential N-linked glycosylation site at position 309-311 amino acids is unique to all field isolates, thus, the extra glycosylation sites may influence antigenicity of the viruses. Phylogenetic analysis of the eighteen CDV sequences based on complete sequence of the H gene showed that there are different genotypes of CDV, all the sixteen field isolates group together, within this group, GP, LP, Mink; 2?544, 404, 4?513, Dandog; A92-6, Leop, Jave, Racc, Amedog; Hama, Ueno and Green, LIU form five lineages respectively. The two vaccine strains are distinct from all of field isolates and form another group.
, http://www.100md.com
Key words: canine distemper virus; H gene; genetic diversity
近年来，犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)自然感染的宿主已扩大到哺乳纲真兽下纲食肉目所有8个科、偶蹄目猪科和灵长类猕猴属等动物，小熊猫甚至对疫苗也非常敏感[1]，犬瘟热(CD)的危害日趋严重。尽管CDV减毒活疫苗的生产和广泛应用已大量地减少了犬、狐等动物CD的发生，但是犬瘟热的预防免疫还不太理想。Blixenkrone-Mψller等[2]和Iwatsuki.K等[3]相继报道了在欧洲、日本等地先后发生了免疫过的犬暴发犬瘟热感染。Harder等[4]报道CDV野生型分离物与疫苗株有明显差异。这使人们对目前使用的CD疫苗对流行毒株的有效保护以及CDV保护性抗原基因是否存在广泛的遗传多样性产生了疑问，为此我们对死于CD的大熊猫和长春犬的CDV病料及CDV小熊猫分离株的细胞培养毒的附着蛋白(H)基因进行了全基因序列测定，并且与GenBank中已有的15个CDV毒株进行了H基因的遗传多样性分析，现将结果报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
1 病毒 大熊猫CDV株(GP)是四川某动物园发生CD死亡的大熊猫的肝脏毒；小熊猫CDV株(LP)是我们用犬肾传代细胞(MDCK)从吉林某动物园死于CD的小熊猫肝脏中获得的细胞分离毒，在MDCK细胞上传了9代；犬的CDV野毒株是长春某犬场死于CD的犬的肝脏毒。
2 引物 我们分析了GenBank中已有的CDV融合蛋白(F)基因、H基因、大蛋白(L)基因的保守序列，选择合成了8条引物，见表1。
表1 引物序列及其在CDV mRNA上的位置
Table 1 The sequences of the primers and sites in CDV mRNA sense Primer
Site
, 百拇医药
Sequence(5′→3′)
P1
6?895-6?911
AAATCCTATGTGAGATC
P2
7?687-7?668
TAATGAGACTGATAGGGGGA
P3
7?488-7?507
GCATTAACCCGCCTAGTAAG
P4
, http://www.100md.com
8?065-8?046
AATGTGATCCATAGGTGTTG
P5
7?953-7?972
CCTTGTGTGTAGAAGAGAGC
P6
8?713-8?694
ATAAGAAATCGTCCGGATTG
P7
8?651-8?670
ATATCCCGGGGCGATCATGC
, 百拇医药
P8
9?076-9?058
ATCTAGATGGACCTCAGGG
3 RNA的制备 参照Chomcxyski P等[5]报道的“异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提分离RNA的一步法”进行。
4 RT-PCR RT反应：取2μg提取的总RNA，加入20μl的RT反应液(50mmol/L Tris-HCl(pH8.3，室温)，50mmol/L KCl；10mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.5mmol/L鱼精子，0.25U/μl AMV反转录酶，0.5mmol/L dATP、dGTP、dCTP和dTTP，1U/μl RNA酶抑制剂，1μmol/L引物P1或P5，于42℃反应1～1.5h。PCR反应：取2μl RT产物，加入48μl扩增反应液(0.2mmol/l dATP、dGTP、dCTP和dTTP，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris-HCl(pH8.3室温)，0.01%明胶，上游引物1μmol/L，下游引物1μmol/L，0.03U/μl Taq酶)。PCR反应条件为：94℃变性30s，52℃退火50s，72℃延伸60s，共35个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR使用的引物配对是P1、P2、P3-P4、P5-P6、P7-P8，依次对应的反转录时所使用引物分别是P1、P1、P5和P5。
, 百拇医药
5 PCR产物测序 PCR产物的纯化按购自日本宝生物工程(大连)公司的PCR Fragment Recovery Kit试剂盒使用说明书操作。纯化的PCR产物的序列测定 由日本宝生物工程(大连)公司完成的。
6 CDV?H基因的序列分析 应用DNASIS和PROSIS等分子生物学软件对大熊猫、小熊猫及长春犬CDV H蛋白完整基因的测序结果进行了分析。
结 果
1 大、小熊猫和长春犬三个CDV株H基因的序列测定结果
将每个毒株CDV基因的各4个PCR片段所测序列拼接后，得到一个由2180个核苷酸组成的基因序列，去掉F基因3′端和L基因5′端序列，得到了H蛋白的全基因序列。测序结果已入GenBank，按GP、LP和LIU株顺序，号码依次为AF178038、AF178039和AF172411。3个CDV毒株的H基因全长均为1?946bp，开放阅读框架始于21～23位的ATG，终止于1?842～1?844位的TGA，编码607个氨基酸。根据我们所测定的GP、LP和LIU?3个毒株的H基因推导的H蛋白氨基酸序列及潜在的N-联糖基化位点，与GenBank或EMBL中的CDV株的比较结果见图1。核苷酸序列受文章篇幅的限制将另文发表，这里略。
, http://www.100md.com
2 CDV不同动物株H基因的系统发生分析
利用DNASIS分子生物学软件，对大、小熊猫和长春犬CDV株以及GenBank中已知H蛋白全基因序列的CDV株的H基因的系统发生进行分析(图2)。参照Bolt G等[7]以及Iwatsuki K等[3]对CDV的基因分型方法，将CDV株分成二组，其中疫苗株Convac和Onderstepoort组成了一组，野生型为一组。野生型又分5个谱系，分别为GP、LP、MINK，2544、404、4513、DANDOG，A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG，HAMA、UENO，GREEN、LIU谱系。
图1 根据H基因测序结果推导的部分CDV毒株H蛋白氨基酸序列的比较
, http://www.100md.com
Figure 1 Alignment of deduced amino acid sequences of the H proteins of CDV strains
Notes: Sequences of the H genes of the GP, LP and LIU strains were generated in this study (Accession number is AF178038, AF178039 and AF172411, respectively) . Other sequences were extracted from the GenBank or EMBL [HAMA (hamatsu strain, D85754); ONDER (onderstepoort strain, D00758) ; CONVAC (convac strain, Z35493) ; GREEN (Greenlandic dog isolate, Z47760) ] The N-linked potential glycosylation sites are shaded. One potential glycosylation site at amino acid 309 is unique to all field isolates.
, http://www.100md.com
图2 CDV H基因的系统发生分析
Figure 2 Phylogenetic analysis of the CDV H genes
Sequences of the H genes of the GP, LP and LIU strains were generated in this study (Accession number is AF178038, AF178039 and AF172411, respectively) . Other sequences were extracted from the GenBank or EMBL [HAMA (hamatsu strain, D85754) ; UENO (ueno strain, D85753) ; A92-6 (black leopard isolate, Z54166) ; ONDER (onderstepoort strain, D00758) ; CONVAC (convac strain, Z35493) ; JAVE (javelina isolate, Z47764) ; 4513 (4513 isolate, Z77673) ; LEOP (black leopard isolate, Z47763) ; AMEDOG (American dog isolate, Z47762) ; MINK (Danish mink isolate, Z47759) ; Dandog (Danish dog isolate, Z47761) ; RACC (raccoon isolate, Z47765) ; 2544 (2544 isolate, Z77672) ; GREEN (Greenlandic dog isolate, Z47760) ; 404 (404 isolate, Z77671) ] .
, 百拇医药
讨 论
本文对GP、LP和LIU3个毒株H蛋白的完整基因进行了序列测定，大、小熊猫CDV的序列是首次测定，GenBank的收录号码分别为AF178038和AF178039，并与GenBank或EMBL中的CDV H基因序列进行了比较。由于所用的分析软件以及病毒的不同，病毒的基因分型没有统一的标准，本文参照Bolt G等[7]以及Iwatsuki K等[3]对CDV的基因分型方法，对18个CDV株进行了分析。从CDV H蛋白基因的系统发生图中可以看出，CDV H基因具有广泛的遗传多样性，存在不同的基因型，这与我们以前按H基因5′端1?641个核苷酸进行分型的研究结果基本一致[6]。疫苗株Convac和Onderstepoort组成了一组，野生型为一组。野生型又分5个谱系，分别为GP、LP、MINK，2544、404、4513、DANDOG，A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG，HAMA、UENO，GREEN、LIU谱系。我们的结果与Bolt G等[7]的报道基本相符，但较Iwatsuki K等[3]的结果多2个谱系。Bolt G等和Iwatsuki K等人的分析分别基于13(与本文相同的毒株为ONDER、CONVAC、JAVE、LEOP、AMDOG、MINK、DANDOG、RACC、GREEN)和10个(与本文相同的毒株为ONDER、CONVAC、HAMA、UENO、A92-6)CDV株，而我们是在测定了大熊猫(GP)、小熊猫(LP)和长春犬(LIU)3个动物CDV株的序列后，与GenBank中的15个CDV株进行了比较，对18个CDV株进行了H基因的系统发生分析，尽管所分析的CDV株不同，且各谱系的CDV株的组成也有所变化，但在疫苗株与野生型之间存在明显差异这一点上是完全一致的。基因型的不同对CDV的致病力和免疫原性的影响尚需进一步研究。
, 百拇医药
Harder等[4]和Iwatsuki K等[3]认为，CDV基因型与地理位置有关。然而本文进一步的研究表明，基因型的不同并不绝对与地理位置有关，如中国的LIU与丹麦的GREEN毒株虽然在地理位置上相差很远，但在基因型上是同一谱系的。我们认为，CDV基因型的不同可能是大量的种间传染和CDV对动物流行病因素的适应所致。
Iwatsuki K等[3]报道，H蛋白抗原性的变化可能是近来日本免疫过的犬爆发CD的重要原因，而N-联糖基化位点的不同可能影响H蛋白抗原性的不同。本文对18个CDV株H蛋白基因潜在的糖基化位点进行了分析，其中Onderstepoort和Convac分别为4和7个，而中国的GP和日本的HAMA和UENO毒株为9个，其余均为8个。值得注意的是，309～311位氨基酸所形成的潜在的糖基化位点是疫苗株没有而野毒株共有的。GP毒株H蛋白实际利用的N-联糖基化位点及其对H蛋白抗原性的影响试验正在进行中。
, 百拇医药
基金项目：军队“八五”医药卫生基金重点课题(91-0205)
作者简介：何洪彬(1967-)，男，黑龙江省讷河市，讲师，博士，主要从事分子病毒学研究。
参考文献：
[1] Bush M, Montali R J, Brownstein D, et al. Vaccine induced canine distemper in a lesser panda [J] . J Am Vet Med Assoc, 1976, 169: 959-960.
[2] Blixenkrone-Mφller M, Svansson V, Have P, et al. Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population [J] . Vet Microbiol, 1993, 37: 163-173.
, 百拇医药
[3] Iwatsuki K, Miyashita N, Yoshida E, et al. Molecular and phylogenetic analyses of the haemagglutinin (H) proteins of field isolates of canine distemper virus from naturally infected dog [J] . J Gen Virol, 1997, 78: 373-380.
[4] Harder T C, Kenter M, Vos H, et al. Canine distemper virus from diseased large felids. Biological properties and phylogenetic relationship [J] . J Gen Virol, 1996, 77: 397-405.
[5] Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction [J] . Analytical Biochemistry, 1987, 162: 156-159.
, 百拇医药
[6] 李金中，何洪彬，胡桂学，等.熊猫犬瘟热病毒的进化地位研究[C].中国科协第三届青年学术年会论文集，生命科学与生物技术，1998，129-131.
[7] Bolt G, Jensen T D, Gottschalck E, et al. Genetic diversity of the attachment (H) protein gene of current field isolates of canine distemper virus [J]. J Gen Virol, 1997, 78: 367-372.
收稿日期：1999-06-09；修回日期：1999-10-08, http://www.100md.com
单位：范泉水 邱薇(成都军区联勤部军事医学研究所，云南 昆明 650032)；何洪彬(东北农业大学生命科学院，黑龙江 哈尔滨 150030)；李金中 夏咸柱 余春 黄耕 殷震(解放军农牧大学兽医研究所，吉林 长春 130062)
关键词：犬瘟热病毒；附着蛋白基因；遗传多样性
病毒学报000310摘要：为了研究犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)大熊猫株、小熊猫株和长春犬株附着蛋白(H)基因的遗传变异，对H基因进行了序列测定。上述3个CDV毒株的H基因全长均为1?946bp，开放阅读框架(ORF)始于21～23位的ATG，终止于1?842～1?844位的TGA，编码607个氨基酸。与GenBank中15个CDV株推导的H蛋白氨基酸序列比较发现，16个野毒株潜在的N-联糖基化位点为8或9个，而疫苗株Onderstepoort和Convac分别为4个和7个，其中309～311位氨基酸所形成的潜在的糖基化位点是疫苗株没有而野毒株共有的，N-联糖基化位点的不同可能影响H蛋白的抗原性。用DNASIS软件分析H基因的系统发生，其中野毒株组成一组，该组又分成5个谱系，分别为GP、LP、MINK，2544、404、4513、DANDOG，A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG，HAMA、UENO，GREEN、LIU谱系；而疫苗株与野毒株H基因之间存在明显的差异，组成了另一组，上述结果表明CDV H蛋白基因存在基因型的差别，具有广泛的遗传多样性。
, 百拇医药
中图分类号：S852.65+9.5; Q522+.6 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0238-04
Phylogenetic Analysis of the Haemagglutinin Protein Gene of Canine Distemper Virus from Giant Panda and Other Animals in China
HE Hong-bin
(The Veterinary Institute, University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun 130062, China)
, 百拇医药 XIA Xian-zhu，LI Jin-zhong，YU Chun，HUANG Geng，YIN Zhen
(Department of Biological Science, Northeastern Agricultural University, Harbin 150030, China)
FAN Quan-shui，QIU Wei
(Institute of Military Medical Sciences, Chengdu Military Command, Kunming 650032, China)
Abstract: To characterize the genetic variation of haemagglutinin (H) protein gene of strains of canine distemper virus (CDV) -GP, LP and LIU strains-from giant panda, lesser panda and dog in China, we conducted nucleotide sequence analysis of the H gene. The 1946 nt of the complete H gene sequences of the three strains showed that the largest open reading frame (ORF) encoding a protein of 607 amino acid residues started at the ATG at position 21～23 and extended to a termination codon TGA at position 1?842～1?844. The deduced amino acid sequences of the H protein of the Chinese strains were compared with those of other CDV strains extracted from the GenBank or EMBL database. It showed that there are eight or nine potential sites for asparagine -linked glycosylation in the H proteins of 16 field isolates, in contrast to four or seven in those of the vaccine strains-onderstepoort and convac strains. The potential N-linked glycosylation site at position 309-311 amino acids is unique to all field isolates, thus, the extra glycosylation sites may influence antigenicity of the viruses. Phylogenetic analysis of the eighteen CDV sequences based on complete sequence of the H gene showed that there are different genotypes of CDV, all the sixteen field isolates group together, within this group, GP, LP, Mink; 2?544, 404, 4?513, Dandog; A92-6, Leop, Jave, Racc, Amedog; Hama, Ueno and Green, LIU form five lineages respectively. The two vaccine strains are distinct from all of field isolates and form another group.
, http://www.100md.com
Key words: canine distemper virus; H gene; genetic diversity
近年来，犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)自然感染的宿主已扩大到哺乳纲真兽下纲食肉目所有8个科、偶蹄目猪科和灵长类猕猴属等动物，小熊猫甚至对疫苗也非常敏感[1]，犬瘟热(CD)的危害日趋严重。尽管CDV减毒活疫苗的生产和广泛应用已大量地减少了犬、狐等动物CD的发生，但是犬瘟热的预防免疫还不太理想。Blixenkrone-Mψller等[2]和Iwatsuki.K等[3]相继报道了在欧洲、日本等地先后发生了免疫过的犬暴发犬瘟热感染。Harder等[4]报道CDV野生型分离物与疫苗株有明显差异。这使人们对目前使用的CD疫苗对流行毒株的有效保护以及CDV保护性抗原基因是否存在广泛的遗传多样性产生了疑问，为此我们对死于CD的大熊猫和长春犬的CDV病料及CDV小熊猫分离株的细胞培养毒的附着蛋白(H)基因进行了全基因序列测定，并且与GenBank中已有的15个CDV毒株进行了H基因的遗传多样性分析，现将结果报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
1 病毒 大熊猫CDV株(GP)是四川某动物园发生CD死亡的大熊猫的肝脏毒；小熊猫CDV株(LP)是我们用犬肾传代细胞(MDCK)从吉林某动物园死于CD的小熊猫肝脏中获得的细胞分离毒，在MDCK细胞上传了9代；犬的CDV野毒株是长春某犬场死于CD的犬的肝脏毒。
2 引物 我们分析了GenBank中已有的CDV融合蛋白(F)基因、H基因、大蛋白(L)基因的保守序列，选择合成了8条引物，见表1。
表1 引物序列及其在CDV mRNA上的位置
Table 1 The sequences of the primers and sites in CDV mRNA sense Primer
Site
, 百拇医药
Sequence(5′→3′)
P1
6?895-6?911
AAATCCTATGTGAGATC
P2
7?687-7?668
TAATGAGACTGATAGGGGGA
P3
7?488-7?507
GCATTAACCCGCCTAGTAAG
P4
, http://www.100md.com
8?065-8?046
AATGTGATCCATAGGTGTTG
P5
7?953-7?972
CCTTGTGTGTAGAAGAGAGC
P6
8?713-8?694
ATAAGAAATCGTCCGGATTG
P7
8?651-8?670
ATATCCCGGGGCGATCATGC
, 百拇医药
P8
9?076-9?058
ATCTAGATGGACCTCAGGG
3 RNA的制备 参照Chomcxyski P等[5]报道的“异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提分离RNA的一步法”进行。
4 RT-PCR RT反应：取2μg提取的总RNA，加入20μl的RT反应液(50mmol/L Tris-HCl(pH8.3，室温)，50mmol/L KCl；10mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.5mmol/L鱼精子，0.25U/μl AMV反转录酶，0.5mmol/L dATP、dGTP、dCTP和dTTP，1U/μl RNA酶抑制剂，1μmol/L引物P1或P5，于42℃反应1～1.5h。PCR反应：取2μl RT产物，加入48μl扩增反应液(0.2mmol/l dATP、dGTP、dCTP和dTTP，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris-HCl(pH8.3室温)，0.01%明胶，上游引物1μmol/L，下游引物1μmol/L，0.03U/μl Taq酶)。PCR反应条件为：94℃变性30s，52℃退火50s，72℃延伸60s，共35个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR使用的引物配对是P1、P2、P3-P4、P5-P6、P7-P8，依次对应的反转录时所使用引物分别是P1、P1、P5和P5。
, 百拇医药
5 PCR产物测序 PCR产物的纯化按购自日本宝生物工程(大连)公司的PCR Fragment Recovery Kit试剂盒使用说明书操作。纯化的PCR产物的序列测定 由日本宝生物工程(大连)公司完成的。
6 CDV?H基因的序列分析 应用DNASIS和PROSIS等分子生物学软件对大熊猫、小熊猫及长春犬CDV H蛋白完整基因的测序结果进行了分析。
结 果
1 大、小熊猫和长春犬三个CDV株H基因的序列测定结果
将每个毒株CDV基因的各4个PCR片段所测序列拼接后，得到一个由2180个核苷酸组成的基因序列，去掉F基因3′端和L基因5′端序列，得到了H蛋白的全基因序列。测序结果已入GenBank，按GP、LP和LIU株顺序，号码依次为AF178038、AF178039和AF172411。3个CDV毒株的H基因全长均为1?946bp，开放阅读框架始于21～23位的ATG，终止于1?842～1?844位的TGA，编码607个氨基酸。根据我们所测定的GP、LP和LIU?3个毒株的H基因推导的H蛋白氨基酸序列及潜在的N-联糖基化位点，与GenBank或EMBL中的CDV株的比较结果见图1。核苷酸序列受文章篇幅的限制将另文发表，这里略。
, http://www.100md.com
2 CDV不同动物株H基因的系统发生分析
利用DNASIS分子生物学软件，对大、小熊猫和长春犬CDV株以及GenBank中已知H蛋白全基因序列的CDV株的H基因的系统发生进行分析(图2)。参照Bolt G等[7]以及Iwatsuki K等[3]对CDV的基因分型方法，将CDV株分成二组，其中疫苗株Convac和Onderstepoort组成了一组，野生型为一组。野生型又分5个谱系，分别为GP、LP、MINK，2544、404、4513、DANDOG，A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG，HAMA、UENO，GREEN、LIU谱系。
图1 根据H基因测序结果推导的部分CDV毒株H蛋白氨基酸序列的比较
, http://www.100md.com
Figure 1 Alignment of deduced amino acid sequences of the H proteins of CDV strains
Notes: Sequences of the H genes of the GP, LP and LIU strains were generated in this study (Accession number is AF178038, AF178039 and AF172411, respectively) . Other sequences were extracted from the GenBank or EMBL [HAMA (hamatsu strain, D85754); ONDER (onderstepoort strain, D00758) ; CONVAC (convac strain, Z35493) ; GREEN (Greenlandic dog isolate, Z47760) ] The N-linked potential glycosylation sites are shaded. One potential glycosylation site at amino acid 309 is unique to all field isolates.
, http://www.100md.com
图2 CDV H基因的系统发生分析
Figure 2 Phylogenetic analysis of the CDV H genes
Sequences of the H genes of the GP, LP and LIU strains were generated in this study (Accession number is AF178038, AF178039 and AF172411, respectively) . Other sequences were extracted from the GenBank or EMBL [HAMA (hamatsu strain, D85754) ; UENO (ueno strain, D85753) ; A92-6 (black leopard isolate, Z54166) ; ONDER (onderstepoort strain, D00758) ; CONVAC (convac strain, Z35493) ; JAVE (javelina isolate, Z47764) ; 4513 (4513 isolate, Z77673) ; LEOP (black leopard isolate, Z47763) ; AMEDOG (American dog isolate, Z47762) ; MINK (Danish mink isolate, Z47759) ; Dandog (Danish dog isolate, Z47761) ; RACC (raccoon isolate, Z47765) ; 2544 (2544 isolate, Z77672) ; GREEN (Greenlandic dog isolate, Z47760) ; 404 (404 isolate, Z77671) ] .
, 百拇医药
讨 论
本文对GP、LP和LIU3个毒株H蛋白的完整基因进行了序列测定，大、小熊猫CDV的序列是首次测定，GenBank的收录号码分别为AF178038和AF178039，并与GenBank或EMBL中的CDV H基因序列进行了比较。由于所用的分析软件以及病毒的不同，病毒的基因分型没有统一的标准，本文参照Bolt G等[7]以及Iwatsuki K等[3]对CDV的基因分型方法，对18个CDV株进行了分析。从CDV H蛋白基因的系统发生图中可以看出，CDV H基因具有广泛的遗传多样性，存在不同的基因型，这与我们以前按H基因5′端1?641个核苷酸进行分型的研究结果基本一致[6]。疫苗株Convac和Onderstepoort组成了一组，野生型为一组。野生型又分5个谱系，分别为GP、LP、MINK，2544、404、4513、DANDOG，A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG，HAMA、UENO，GREEN、LIU谱系。我们的结果与Bolt G等[7]的报道基本相符，但较Iwatsuki K等[3]的结果多2个谱系。Bolt G等和Iwatsuki K等人的分析分别基于13(与本文相同的毒株为ONDER、CONVAC、JAVE、LEOP、AMDOG、MINK、DANDOG、RACC、GREEN)和10个(与本文相同的毒株为ONDER、CONVAC、HAMA、UENO、A92-6)CDV株，而我们是在测定了大熊猫(GP)、小熊猫(LP)和长春犬(LIU)3个动物CDV株的序列后，与GenBank中的15个CDV株进行了比较，对18个CDV株进行了H基因的系统发生分析，尽管所分析的CDV株不同，且各谱系的CDV株的组成也有所变化，但在疫苗株与野生型之间存在明显差异这一点上是完全一致的。基因型的不同对CDV的致病力和免疫原性的影响尚需进一步研究。
, 百拇医药
Harder等[4]和Iwatsuki K等[3]认为，CDV基因型与地理位置有关。然而本文进一步的研究表明，基因型的不同并不绝对与地理位置有关，如中国的LIU与丹麦的GREEN毒株虽然在地理位置上相差很远，但在基因型上是同一谱系的。我们认为，CDV基因型的不同可能是大量的种间传染和CDV对动物流行病因素的适应所致。
Iwatsuki K等[3]报道，H蛋白抗原性的变化可能是近来日本免疫过的犬爆发CD的重要原因，而N-联糖基化位点的不同可能影响H蛋白抗原性的不同。本文对18个CDV株H蛋白基因潜在的糖基化位点进行了分析，其中Onderstepoort和Convac分别为4和7个，而中国的GP和日本的HAMA和UENO毒株为9个，其余均为8个。值得注意的是，309～311位氨基酸所形成的潜在的糖基化位点是疫苗株没有而野毒株共有的。GP毒株H蛋白实际利用的N-联糖基化位点及其对H蛋白抗原性的影响试验正在进行中。
, 百拇医药
基金项目：军队“八五”医药卫生基金重点课题(91-0205)
作者简介：何洪彬(1967-)，男，黑龙江省讷河市，讲师，博士，主要从事分子病毒学研究。
参考文献：
[1] Bush M, Montali R J, Brownstein D, et al. Vaccine induced canine distemper in a lesser panda [J] . J Am Vet Med Assoc, 1976, 169: 959-960.
[2] Blixenkrone-Mφller M, Svansson V, Have P, et al. Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population [J] . Vet Microbiol, 1993, 37: 163-173.
, 百拇医药
[3] Iwatsuki K, Miyashita N, Yoshida E, et al. Molecular and phylogenetic analyses of the haemagglutinin (H) proteins of field isolates of canine distemper virus from naturally infected dog [J] . J Gen Virol, 1997, 78: 373-380.
[4] Harder T C, Kenter M, Vos H, et al. Canine distemper virus from diseased large felids. Biological properties and phylogenetic relationship [J] . J Gen Virol, 1996, 77: 397-405.
[5] Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction [J] . Analytical Biochemistry, 1987, 162: 156-159.
, 百拇医药
[6] 李金中，何洪彬，胡桂学，等.熊猫犬瘟热病毒的进化地位研究[C].中国科协第三届青年学术年会论文集，生命科学与生物技术，1998，129-131.
[7] Bolt G, Jensen T D, Gottschalck E, et al. Genetic diversity of the attachment (H) protein gene of current field isolates of canine distemper virus [J]. J Gen Virol, 1997, 78: 367-372.
收稿日期：1999-06-09；修回日期：1999-10-08, http://www.100md.com