庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达
作者：朱分禄 任浩 朱诗应 宋燕斌 戚中田
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海 200433
关键词：GBV-C/HGV NS3蛋白；Sf9昆虫细胞；表达
病毒学报000318 中图分类号：R373.2+1；Q786 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0273-03
High-level Expression of GBV-C/HGV NS3 Protein in Sf9 Insect Cells Using Bac-to-Bac Vectors
ZHU Fen-lu，REN Hao，ZHU Shi-ying，SONG Yan-bin，QI Zhong-tian
, http://www.100md.com
(Department of Microbiology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract: The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein was expressed in Sf9 insect cells and analyzed by SDS-PAGE. A protein band about Mr 43810 was demonstrated on polyacrylamide gel electrophoresis and this protein amounted to more than 30% of the total cell proteins. Recombinant NS3 protein was purified by Ni-NTA column. Western blot showed that this recombinant protein could react with GBV-C/HGV RNA positive mixed sera. The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein could be used to detect GBV-C/HGV infection and will supply material for study of structure and function of this protein.
, 百拇医药
Key words: GBV-C/HGV NS3 protein; Sf9 insect cell; expression
庚型肝炎病毒(HGV)/GB病毒C(GBV-C)疑似引起人类庚型肝炎[1～3]。HGV和GBV-C为同一病毒的两个不同分离株，本文将其称为GBV-C/HGV。GBV-C/HGV属黄病毒科，为单股正链RNA病毒，全长约9.4kb。基因组中仅含有一个单一开放阅读框，编码E1、E2结构蛋白和NS2、NS3、NS4及NS5非结构蛋白。GBV-C/HGV的NS3蛋白具备丝氨酸蛋白酶活性和解旋酶活性[3]，在NS3蛋白中还存在线性抗原表位[4]，因此，NS3蛋白是GBV-C/HGV的重要功能蛋白。
杆状病毒系统具有强大的多角体启动子，可以大量地表达目的蛋白，而且表达的重组蛋白在结构和功能上接近于天然蛋白。Bac-to-BacHT系统[5]是一种新型的可快速、有效地制备重组杆状病毒的表达载体，通过位点特异重组将表达盒中的外源基因转座至杆状病毒的穿梭载体杆粒(bacmid)中，产生重组杆粒，然后转染昆虫细胞，使外源基因得以表达。本研究将GBV-C/HGV NS3蛋白在昆虫细胞中进行了高效表达，现将结果报告如下。
, http://www.100md.com
鉴定用血清采自血液透析病人，PCR检测GBV-C/HGV RNA阳性。含有约1.14kb GBV-C/HGV NS3基因的重组质粒pHTNS3由本室构建[6]。pFastBacTMHTa质粒、Sf9(spodoptera frugiperda)细胞、DH10Bac大肠杆菌由武汉大学病毒学研究所齐义鹏教授惠赠。限制性内切酶、连接酶购自Biolab或华美生物工程公司。Grace’s培养基、胎牛血清、Lipofectin购自GIBCO BRL公司。各种抗生素、IPTG、 X-gal和羊抗人IgG-HRP购自华美生物工程公司。纯化重组蛋白的Ni-NTA spin kit购自QIAGEN公司。
重组质粒pHTNS3和转座载体pFastBacTMHTa经BamHI和EcoRI双酶切后，回收约1.14kb的DNA和载体片段，T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞，挑取转化子进行鉴定以构建重组转座质粒pFHTNS3。将pFHTNS3转化感受态细胞DH10Bac，该细胞中含有带mini-att Tn7靶位点的杆粒和帮助质粒。将转化混合物37℃振荡培养4h使发生转座，然后用新鲜LB以10-1、10-2和10-3不同的稀释度稀释，各取100μl涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的三抗平皿，该平皿提前30min涂布25mg/ml X-gal 40μl和200μg/ml IPTG20μl，将平皿置37℃培养24～48h，携带重组杆粒的大肠杆菌在X-gal、IPTG选择培养基上呈现白色菌落。挑取白色菌落在选择培养基上进一步传单培养，然后挑取单菌落培养，按Bac-to-Bac系统说明中的方法提取大分子重组杆粒溶于TE待转染。Sf9细胞用前一天传代，待细胞融合达60%～70%时转染。取一Eppendorf管，加重组杆粒DNA 4μg，无血清Grace’s培养基200μl；另取一Eppendofr管，加Lipofectin 8μl，无血清Grace′s培养基200μl。将两管混合均匀，37℃放置45min。Sf9细胞用PBS洗1次，加入转染混合物，27℃孵育12h，然后换含10%胎牛血清的Grace′s培养基27℃继续培养。每天观察细胞形态，待培养至5～6天细胞有明显形态改变时分别收获培养上清和细胞。取转染上清10μl，加含10%胎牛血清的Grace′s培养基3ml，再次感染Sf9细胞。观察细胞形态，约5～6天时分别收获培养上清和细胞。Sf9细胞用PBS洗2次，视细胞量加入SDS上样缓冲液，沸水浴5min，同样处理正常细胞后进行SDS-PAGE，染色后薄层扫描分析重组蛋白的表达量。同种样品在SDS-PAGE后电转移至硝酸纤维素膜，用GBV-C/HGV RNA阳性病人混合血清(1：40稀释)对重组蛋白进行特异性鉴定。感染的Sf9细胞收获后溶于含8mol/L尿素的0.1mol/L NaH2PO4/0.01mol/L Tris-HCl pH8.0的溶液中，超声使细胞染色体DNA粉碎以降低溶液粘性，用Ni-NTA离心柱纯化重组蛋白。
, 百拇医药
将pFHTNS3用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，切出的基因片段与预期一致(图1)，证实重组转座质粒pFHTNS3构建成功。Sf9细胞转染或感染后形态逐渐发生改变，至第5～6天时细胞形态明显变大、变圆，胞浆内出现许多折光性很强的颗粒，易于从培养瓶壁上脱落。正常细胞则无此变化(图2)。将转染或感染的Sf9细胞的全细胞裂解液在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，考马斯亮蓝R-250染色，在约Mr43810处出现一条很浓的重组蛋白条带(图3A)，薄层扫描显示该蛋白占细胞总蛋白量的30%以上。经Ni-NTA离心柱纯化，获得了纯化的GBV-C/HGV重组蛋白(图3A)。取转染或感染的Sf9细胞全细胞裂解液20μl在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，用GBV-C/HGV RNA阳性病人混合血清进行鉴定，发现重组蛋白与阳性病人血清发生特异性反应(图3B)。
NS3非结构蛋白是GBV-C/HGV的一个重要功能蛋白质，该蛋白同时具备丝氨酸蛋白酶和解旋酶活性；在NS3蛋白中，还存在线性抗原表位。Pilot-Matias[4]等发现，在GBV-C/HGVNS3区1 074～1 191位氨基酸之间存在抗原决定簇表位。汪兴太[7]等利用合成肽技术也发现在NS3区存在几段线性表位，认为可以用来研制抗体诊断试剂。本研究将GBV-C/HGV NS3蛋白在昆虫细胞中进行了高效表达并获得了纯化抗原，该抗原可以与GBV-C/HGV RNA阳性病人血清发生特异的抗原抗体反应，提示该重组蛋白可用来检测GBV-C/HGV感染。GBV-C/HGV NS3重组蛋白的获得也为研究NS3蛋白的功能提供了物质材料。
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图1 重组转座质粒pFHTNS3的酶切鉴定
Figure 1 Endonuclease digestion analysis of recombinant
transposing plasmid pFHTNS3
1. λDNA/EcoRI+Hind Ⅲ; 2. pHTNS3/BamHI+EcoRI;
3. pFHTNS3/BamHI+EcoRI; 4. pFast Bac HTa/BamHI+EcoR I.
图2 正常和转染、感染Sf9昆虫细胞的形态观察
Figure 2 Morphology of normal, transfected
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and infected Sf9 insect cells
A.100×, Normal insect cells;
B.100×, Transfected and infected insect cells.
图3 重组GBV-C/HGV NS3蛋白的
SDS-PAGE及Western blot鉴定
Figure 3 SDS-PAGE and Western blot identification
of recombinant GBV-C/HGV NS3 protein
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A: SDS-PAGE. 1. Normal insect cells; 2. Infected insect cells; 3. Purified NS3 protein; 4. Low protein molecular weight marker. B: Western blot. 1. Normal insect cells; 2. Infected insect cells; 3. Low protein molecular weight marker. Arrow indicates the position of the recombinant protein.
Bac-to-BacHT载体[5]相对于经同源重组在昆虫细胞产生重组病毒的杆状病毒表达系统而言，除保留原有的具有强大的多角体启动子外，还因为经筛选获得的重组杆粒不掺杂非重组杆粒，故重组病毒中没有非重组病毒的污染，从而省去了繁杂的噬斑纯化过程，因此Bac-to-Bac HT杆状病毒表达系统具有有效、快速的特点；该表达系统又具备翻译后修饰加工功能，使重组蛋白接近于天然蛋白质。另外，Bac-to-Bac HT杆状病毒系统表达的是一个融合蛋白，在蛋白的氨基端带有6个组氨酸，可以使重组蛋白得以快速纯化。本研究在昆虫细胞中表达了GBV-C/HGV NS3蛋白，表达水平达30%以上，比该蛋白在原核系统中的表达量高一倍以上[6]。利用Ni-NTA亲和层析柱方便地获得了纯化的重组NS3蛋白，证实了杆状病毒昆虫细胞表达系统的优良特性。
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基金项目：国家自然科学基金(39825116，39770393)及军队人才基金
作者简介：朱分禄(1963-)，男，医学博士，研究方向：分子病毒学。
参考文献：
[1] Simons J N, Leary T P， Dawson G J, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis[J]. Nature Med, 1995, 1(6): 564-569.
[2] Leary T P, Muerhoff S M, Simons J N, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: A novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis[J]. J Med Virol, 1996, 48(1):60-67.
, http://www.100md.com
[3] Linnen J, Wages J J, Zhang-Keck Z-Y, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent[J]. Science, 1996, 271(5248): 505-508.
[4] Pilot-Matias T J, Muerhoff A S, Simons J N, et al. Identification of antigenic regions in the GB hepatitis viruses GBV-A, GBV-B, and GBV-C[J]. J Med Virol, 1996, 48(4): 329-338.
[5] Luckow V A, Lee S C, Barry G F, et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli[J]. J Virol, 1993, 67(8): 4566-4577.
[6] 朱分禄，任浩，戚中田，等. 庚型肝炎病毒NS3蛋白在大肠杆菌中的表达[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，1999，19(6)：475-478.
[7] 汪兴太,庄辉, 李河民,等.庚型肝炎病毒C型(GBV-C)多肽的抗原性研究及应用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,1997, 17(3): 157-159.
收稿日期：1998-09-21；修回日期：1999-11-18, http://www.100md.com
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海 200433
关键词：GBV-C/HGV NS3蛋白；Sf9昆虫细胞；表达
病毒学报000318 中图分类号：R373.2+1；Q786 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0273-03
High-level Expression of GBV-C/HGV NS3 Protein in Sf9 Insect Cells Using Bac-to-Bac Vectors
ZHU Fen-lu，REN Hao，ZHU Shi-ying，SONG Yan-bin，QI Zhong-tian
, http://www.100md.com
(Department of Microbiology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract: The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein was expressed in Sf9 insect cells and analyzed by SDS-PAGE. A protein band about Mr 43810 was demonstrated on polyacrylamide gel electrophoresis and this protein amounted to more than 30% of the total cell proteins. Recombinant NS3 protein was purified by Ni-NTA column. Western blot showed that this recombinant protein could react with GBV-C/HGV RNA positive mixed sera. The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein could be used to detect GBV-C/HGV infection and will supply material for study of structure and function of this protein.
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Key words: GBV-C/HGV NS3 protein; Sf9 insect cell; expression
庚型肝炎病毒(HGV)/GB病毒C(GBV-C)疑似引起人类庚型肝炎[1～3]。HGV和GBV-C为同一病毒的两个不同分离株，本文将其称为GBV-C/HGV。GBV-C/HGV属黄病毒科，为单股正链RNA病毒，全长约9.4kb。基因组中仅含有一个单一开放阅读框，编码E1、E2结构蛋白和NS2、NS3、NS4及NS5非结构蛋白。GBV-C/HGV的NS3蛋白具备丝氨酸蛋白酶活性和解旋酶活性[3]，在NS3蛋白中还存在线性抗原表位[4]，因此，NS3蛋白是GBV-C/HGV的重要功能蛋白。
杆状病毒系统具有强大的多角体启动子，可以大量地表达目的蛋白，而且表达的重组蛋白在结构和功能上接近于天然蛋白。Bac-to-BacHT系统[5]是一种新型的可快速、有效地制备重组杆状病毒的表达载体，通过位点特异重组将表达盒中的外源基因转座至杆状病毒的穿梭载体杆粒(bacmid)中，产生重组杆粒，然后转染昆虫细胞，使外源基因得以表达。本研究将GBV-C/HGV NS3蛋白在昆虫细胞中进行了高效表达，现将结果报告如下。
, http://www.100md.com
鉴定用血清采自血液透析病人，PCR检测GBV-C/HGV RNA阳性。含有约1.14kb GBV-C/HGV NS3基因的重组质粒pHTNS3由本室构建[6]。pFastBacTMHTa质粒、Sf9(spodoptera frugiperda)细胞、DH10Bac大肠杆菌由武汉大学病毒学研究所齐义鹏教授惠赠。限制性内切酶、连接酶购自Biolab或华美生物工程公司。Grace’s培养基、胎牛血清、Lipofectin购自GIBCO BRL公司。各种抗生素、IPTG、 X-gal和羊抗人IgG-HRP购自华美生物工程公司。纯化重组蛋白的Ni-NTA spin kit购自QIAGEN公司。
重组质粒pHTNS3和转座载体pFastBacTMHTa经BamHI和EcoRI双酶切后，回收约1.14kb的DNA和载体片段，T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞，挑取转化子进行鉴定以构建重组转座质粒pFHTNS3。将pFHTNS3转化感受态细胞DH10Bac，该细胞中含有带mini-att Tn7靶位点的杆粒和帮助质粒。将转化混合物37℃振荡培养4h使发生转座，然后用新鲜LB以10-1、10-2和10-3不同的稀释度稀释，各取100μl涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的三抗平皿，该平皿提前30min涂布25mg/ml X-gal 40μl和200μg/ml IPTG20μl，将平皿置37℃培养24～48h，携带重组杆粒的大肠杆菌在X-gal、IPTG选择培养基上呈现白色菌落。挑取白色菌落在选择培养基上进一步传单培养，然后挑取单菌落培养，按Bac-to-Bac系统说明中的方法提取大分子重组杆粒溶于TE待转染。Sf9细胞用前一天传代，待细胞融合达60%～70%时转染。取一Eppendorf管，加重组杆粒DNA 4μg，无血清Grace’s培养基200μl；另取一Eppendofr管，加Lipofectin 8μl，无血清Grace′s培养基200μl。将两管混合均匀，37℃放置45min。Sf9细胞用PBS洗1次，加入转染混合物，27℃孵育12h，然后换含10%胎牛血清的Grace′s培养基27℃继续培养。每天观察细胞形态，待培养至5～6天细胞有明显形态改变时分别收获培养上清和细胞。取转染上清10μl，加含10%胎牛血清的Grace′s培养基3ml，再次感染Sf9细胞。观察细胞形态，约5～6天时分别收获培养上清和细胞。Sf9细胞用PBS洗2次，视细胞量加入SDS上样缓冲液，沸水浴5min，同样处理正常细胞后进行SDS-PAGE，染色后薄层扫描分析重组蛋白的表达量。同种样品在SDS-PAGE后电转移至硝酸纤维素膜，用GBV-C/HGV RNA阳性病人混合血清(1：40稀释)对重组蛋白进行特异性鉴定。感染的Sf9细胞收获后溶于含8mol/L尿素的0.1mol/L NaH2PO4/0.01mol/L Tris-HCl pH8.0的溶液中，超声使细胞染色体DNA粉碎以降低溶液粘性，用Ni-NTA离心柱纯化重组蛋白。
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将pFHTNS3用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，切出的基因片段与预期一致(图1)，证实重组转座质粒pFHTNS3构建成功。Sf9细胞转染或感染后形态逐渐发生改变，至第5～6天时细胞形态明显变大、变圆，胞浆内出现许多折光性很强的颗粒，易于从培养瓶壁上脱落。正常细胞则无此变化(图2)。将转染或感染的Sf9细胞的全细胞裂解液在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，考马斯亮蓝R-250染色，在约Mr43810处出现一条很浓的重组蛋白条带(图3A)，薄层扫描显示该蛋白占细胞总蛋白量的30%以上。经Ni-NTA离心柱纯化，获得了纯化的GBV-C/HGV重组蛋白(图3A)。取转染或感染的Sf9细胞全细胞裂解液20μl在12.5%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，用GBV-C/HGV RNA阳性病人混合血清进行鉴定，发现重组蛋白与阳性病人血清发生特异性反应(图3B)。
NS3非结构蛋白是GBV-C/HGV的一个重要功能蛋白质，该蛋白同时具备丝氨酸蛋白酶和解旋酶活性；在NS3蛋白中，还存在线性抗原表位。Pilot-Matias[4]等发现，在GBV-C/HGVNS3区1 074～1 191位氨基酸之间存在抗原决定簇表位。汪兴太[7]等利用合成肽技术也发现在NS3区存在几段线性表位，认为可以用来研制抗体诊断试剂。本研究将GBV-C/HGV NS3蛋白在昆虫细胞中进行了高效表达并获得了纯化抗原，该抗原可以与GBV-C/HGV RNA阳性病人血清发生特异的抗原抗体反应，提示该重组蛋白可用来检测GBV-C/HGV感染。GBV-C/HGV NS3重组蛋白的获得也为研究NS3蛋白的功能提供了物质材料。
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图1 重组转座质粒pFHTNS3的酶切鉴定
Figure 1 Endonuclease digestion analysis of recombinant
transposing plasmid pFHTNS3
1. λDNA/EcoRI+Hind Ⅲ; 2. pHTNS3/BamHI+EcoRI;
3. pFHTNS3/BamHI+EcoRI; 4. pFast Bac HTa/BamHI+EcoR I.
图2 正常和转染、感染Sf9昆虫细胞的形态观察
Figure 2 Morphology of normal, transfected
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and infected Sf9 insect cells
A.100×, Normal insect cells;
B.100×, Transfected and infected insect cells.
图3 重组GBV-C/HGV NS3蛋白的
SDS-PAGE及Western blot鉴定
Figure 3 SDS-PAGE and Western blot identification
of recombinant GBV-C/HGV NS3 protein
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A: SDS-PAGE. 1. Normal insect cells; 2. Infected insect cells; 3. Purified NS3 protein; 4. Low protein molecular weight marker. B: Western blot. 1. Normal insect cells; 2. Infected insect cells; 3. Low protein molecular weight marker. Arrow indicates the position of the recombinant protein.
Bac-to-BacHT载体[5]相对于经同源重组在昆虫细胞产生重组病毒的杆状病毒表达系统而言，除保留原有的具有强大的多角体启动子外，还因为经筛选获得的重组杆粒不掺杂非重组杆粒，故重组病毒中没有非重组病毒的污染，从而省去了繁杂的噬斑纯化过程，因此Bac-to-Bac HT杆状病毒表达系统具有有效、快速的特点；该表达系统又具备翻译后修饰加工功能，使重组蛋白接近于天然蛋白质。另外，Bac-to-Bac HT杆状病毒系统表达的是一个融合蛋白，在蛋白的氨基端带有6个组氨酸，可以使重组蛋白得以快速纯化。本研究在昆虫细胞中表达了GBV-C/HGV NS3蛋白，表达水平达30%以上，比该蛋白在原核系统中的表达量高一倍以上[6]。利用Ni-NTA亲和层析柱方便地获得了纯化的重组NS3蛋白，证实了杆状病毒昆虫细胞表达系统的优良特性。
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基金项目：国家自然科学基金(39825116，39770393)及军队人才基金
作者简介：朱分禄(1963-)，男，医学博士，研究方向：分子病毒学。
参考文献：
[1] Simons J N, Leary T P， Dawson G J, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis[J]. Nature Med, 1995, 1(6): 564-569.
[2] Leary T P, Muerhoff S M, Simons J N, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: A novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis[J]. J Med Virol, 1996, 48(1):60-67.
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[3] Linnen J, Wages J J, Zhang-Keck Z-Y, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent[J]. Science, 1996, 271(5248): 505-508.
[4] Pilot-Matias T J, Muerhoff A S, Simons J N, et al. Identification of antigenic regions in the GB hepatitis viruses GBV-A, GBV-B, and GBV-C[J]. J Med Virol, 1996, 48(4): 329-338.
[5] Luckow V A, Lee S C, Barry G F, et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli[J]. J Virol, 1993, 67(8): 4566-4577.
[6] 朱分禄，任浩，戚中田，等. 庚型肝炎病毒NS3蛋白在大肠杆菌中的表达[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，1999，19(6)：475-478.
[7] 汪兴太,庄辉, 李河民,等.庚型肝炎病毒C型(GBV-C)多肽的抗原性研究及应用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,1997, 17(3): 157-159.
收稿日期：1998-09-21；修回日期：1999-11-18, http://www.100md.com