应用噬菌体随机9肽库筛选庚型肝炎病毒抗原表位
作者：曹洁 赵平 戚中田
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海，200433
关键词：噬菌体肽库；随机9肽；庚型肝炎病毒；抗原表位
病毒学报000317 中图分类号：R373.2+1; Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0270-03
Screening of Antigenic Epitope for Hepatitis G Virus
from Phage-displayed Random Nonapeptide Library
CAO Jie，ZHAO Ping，QI Zhong-tian
, 百拇医药
(Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract: The purpose of the study was to screen the antigenic epitope with monoclonal antibody against hepatitis G virus envelope protein 2 (HGV E2) from phage-displayed constrained nonapeptide library (PVⅢ9aa-cys). E. coli XLl-blue infected with PVⅢ9aa-cys was spread on 2×YT plates containing ampicillin and tetracycline. Transducting unit(TU) of PVⅢ9aa-cys was about 1.6×1012/ml by calculating the number of clones. The DNA sequence of PVⅢ9aa-cys, determined with cycle sequencing, was found randomly arranged in NNN order. Both ends of the nonapeptide(NNN)9 linked with a cysteine respectively. Through four rounds biopanning of PVⅢ9aa-cys with MAb M-13-IgG, 6 of 14 positive clones were proved sharing the consensus aa sequence VXXSPL while 4 clones shared sequence VXSPL. Sequence VX(X) SPL was of homology with VRSPL of HGV E2 between aa 218-222. Average 0.D. value(A450) of 10 phage clones with the consensus aa sequence were higher than those of the other 4 clones and PVⅢ9aa-cys(P<0.05). These results demonstrate the possibility that sequence VRSPL is an antigenic epitope of HGV E2. This work provides new information for the diagnosis of HGV infection as well as vaccine development of HGV.
, 百拇医药
Key words: phage-displayed peptide library; random nonapeptide; hepatitis G virus; antigenic epitope
自1985年美国Missouri大学Smith博士首先建立噬菌体表面展示技术(phage display techniques，PDT)以来，这一技术在研究分子间相互识别,如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已充分显示其独特的优势[1]。该技术是以经过改建的噬菌粒为载体，将外源基因插入噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因中，从而使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体表面，并保持一定的空间构象。噬菌体表面随机表达多肽文库技术的建立，使表面展示由单一表达转入随机表达，应用特定的靶分子(如抗体、受体或其它分子等)可从中筛选出相应的配体，通过测定插入基因的序列即可明确其表达产物的氨基酸序列[2，3]。因此，噬菌体随机肽库已成为研究分子间相互作用的有力工具。本文用抗庚型肝炎病毒(hepatitis G virus，HGV)包膜蛋白2(envelope protein 2，E2)单克隆抗体M-13-IgG为靶分子，从构象限制性噬菌体随机9肽库(PVⅢ9aa-cys)中筛选HGV特异性的抗原表位。
, 百拇医药
PVⅢ9aa-cys由意大利IRBM研究所Paolo Monici博士惠赠，它是将合成的编码随机9个三联密码子(NNN)9的双链寡核苷酸片段插入噬菌粒载体pC89的PVⅢ基因，再以之转化F性菌毛阳性的XLl-blue宿主菌而获得，外源基因的两端各有1个半胱氨酸，且具有氨苄青霉素(Amp)抗性[4]。宿主菌XLl-blue购自Stratagene公司，具有四环素(Tet)抗性。辅助噬菌体M13KO7购自Pharmacia公司，具有卡那霉素(Kan)抗性。抗HGV E2单克隆抗体(MAb)M-13-IgG，由德国Roche诊断试剂公司Engel博士馈赠。NAP缓冲液含80mmol/L NaCl，50mmol/L NH4H2PO4 pH7.0；PEG/NaCl含20%(W/V)聚乙二醇8000，2.5mol/L NaCl；TBS含50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150mmol/L NaCl。HRP/Anti-M13 MAb-M13MAb购自Pharmacia公司。四甲基联苯胺(TMB)显色系统购自华美生物工程公司。DNA测序试剂盒为Promega公司产品。测序引物为5′-CCCACGCATAACCGATA-3′，由上海Sangon公司合成。核酸电泳系统为Bio Rad公司产品。
, http://www.100md.com
由于我们得到的肽库仅能供一次筛选使用，为了能用这个肽库进行后续的工作，我们首先对PVⅢ9aa-cys肽库进行了扩增，并鉴定了扩增肽库的库容量和随机性。噬菌体肽库的库容量用TU(transducting unit，TU)值来衡量，即每毫升肽库感染F性菌毛阳性大肠杆菌所形成的菌落数。将1μlPVⅢ9aa-cys稀释至1/10 000，取10μl感染XLⅠ-blue感受态菌后，加至10ml 2×YT(含Tet20μg/ml)中，37℃摇荡25min后，各取1μl、10μl、100μl接种Amp及Tet双抗性平板，37℃培养过夜，计数生长菌落，最少生长菌落数乘以稀释倍数即为TU值。结果表明扩增得到的噬菌体9肽库的TU值为1.6×1012TU/ml。TU值越大即库容量越大，可结合靶分子的数目就越多。迄今为止，文献报道的噬菌体随机肽库TU值多在1010/ml～1012/ml之间，且已证实能够有效进行筛选[5～7]。本结果表明我们扩增得到的噬菌体9肽库有足够的库容量，能保证对靶分子筛选的需要。以碱裂解法提取噬菌粒，用循环测序法测定PVⅢ9aa-cys DNA序列以判断扩增肽库的随机性，表明编码9肽的27个碱基为A、C、G、T的概率相同。因此，该肽库是任意9个三联密码子的组合，具有良好的随机性。测序结果还证实在9肽库DNA两侧各连接1个半胱氨酸(Cys)密码子TGC，由于两个Cys分子能形成二硫键，可使该噬菌体随机9肽库呈环状，形成一定的空间构象，更有利于筛选靶分子。
, 百拇医药
本试验以抗HGV E2 MAb M-13-IgG为靶分子，对扩增得到的噬菌体随机环形9肽库进行筛选。先用0.5μgM-13-IgG包被聚苯乙烯96孔培养板，加180μl封闭液(含5mg/ml BSA，0.1mol/L NaHCO3), 室温放置2h，用洗液I(含0.5mol/L Tris-base，1.5mol/L NaCl，0.25% Tween20，pH7.5)洗3次，加入PVⅢ9aa-cys(1.6×1012TU/ml)30μl，置37℃1h，用洗液Ⅱ(含0.5mol/L Tris-base，1.5mol/L NaCl，0.5%Tween20，pH7.5)洗30次，加洗脱液(含0.1mol/L HCl，1mg/ml BSA，用甘氨酸调pH至2.2)放置8min，吸出至Ep管中，加15μlmol/L Tris-HCl(pH9.0)。洗脱的噬菌体于37℃感染XL1-blue感受态菌后，加至10ml含Tet的2×YT培养液，37℃摇荡30min后，慢摇10min，再加入辅助噬菌体M13KO7(1.25×1012TU/ml)40μl及适量Amp，于37℃摇荡45min后，10 000r/min离心5min，弃上清，沉淀用2×YT重悬后再离心1次，最后沉淀物用2×YT重悬后加至30ml 2×YT(含Tet 20μg/ml，100μg/ml，Kan 50μg/ml)中，37℃摇菌过夜。次日提取扩增的噬菌体[8]，再用于第2轮筛选，同上共进行4轮筛选。将第4轮洗脱的噬菌体感染XL1-blue感受态菌，接种于含Amp固体培养基，培养过夜。
, 百拇医药
挑取第4轮筛选后的14个单克隆菌落，分别接种至2ml含Tet及Amp的2×YT培养液中，37℃摇菌过液，次日按常规方法小量抽提质粒DNA。用循环测序法测定质粒DNA序列。由14个核苷酸序列推导出氨基酸序列，结果发现有6个噬菌体克隆具有氨基酸共同序列VXXSPL，4个克隆具有氨基酸共同序列VXSPL，其余4个克隆无共同氨基酸序列(表1)。与HGV E2蛋白进行同源性分析表明，氨基酸共同序列VXXSPL(VXSPL)与HGV E2第218～222位氨基酸VRSPL有较高的同源性。
将抗HGV E2 MAb M-13-IgG包被酶联板，用1%BSA封闭1h，再加入TBS稀释的单克隆噬菌体以及扩增的PVⅢ9aa-cys100μl(均约1010TU/ml)，37℃孵育1h，用洗液I洗板5次，加入1：5 000稀释的HRP/Anti-M13 MAb，37℃反应40min后，用TMB显色5min，测定吸光度A450值。有共同氨基酸序列的10个噬菌体克隆的A450值明显高于另4个噬菌体克隆及扩增肽库的A450值(P<0.05)，表明其与MAb M-13-IgG有高结合反应(图1)。该结果进一步证实了VRSPL可能是抗HGV E2 MAb M-13-IgG识别的抗原表位，为HGV感染疾病的诊断、治疗药物的设计及疫苗研究提供了重要依据。
, 百拇医药
表1 筛选噬菌体克隆的外源氨基酸序列
Table 1 Exogenous amino acid sequences of
the selected phage clones Phage
Amino acid sequence
1
CRVCLSPLPNC
2
CARPVEVSPLC
3
CRVNASPLKSC
, http://www.100md.com
4
CCSGVYDSPLC
5
CHSVMRSPLKC
6
CHLVYDSPLIC
7
CLQRVASPLNC
8
CPIRHVPSPLC
9
CVVLSPLDKMC
, 百拇医药 10
CIHSIVPSPLC
11
CRAIQLVYPDC
12
CWYFHPLGSEC
13
CHAMHALRLKC
14
CDASIPHYSNC
图1 噬菌体克隆与抗HGV E2
, 百拇医药
MAb的ELISA反应
Figure 1 Bingding assay of phage clones with
MAb against HGV E2 by ELISA(A450)
(致谢：本实验得到意大利IRBM研究所Paolo Monici博士、德国Roche Diagnostics的Engel博士以及第二军医大学微生物学教研室潘卫副教授和朱分禄博士的大力支持，特此致谢。)
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39830330)和杰出青年科学基金资助项目(39825116)
作者简介：曹洁(1965-)，女，天津人，博士后，讲师，研究方向为分子病毒学。联系电话：(021)25070267；E-mail：qizt@smmu.edu.cn.
, 百拇医药
参考文献：
[1] Smith G P， Petrenko V A. Phage display[J]. Chem Rev,1997, 97:391-410.
[2] Devlin J J, Panganiban L C, Devlin P E. Random peptide libraries: A source of specific protein binding molecules[J]. Science, 1990, 249: 404-406.
[3] He X, Liu S, Perry K L. Identification of epitopes in cucumber mosaic virus using a phage-displayed random peptide library[J]. J Gen Virol, 1998, 79(12):3145-3153.
, 百拇医药
[4] Felici F, Castagnoli L, Musacchio A, et al. Selection of antibody ligands from a large library of oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector[J]. J Mol Biol, 1991, 222:301-310.
[5] Craig L, Sanschagrin P C, Rozek A, et al. The role of structure in antibody cross-reactivity between peptides and folded proteins[J]. J Mol Biol,1998, 281(1):183-201.
[6] Zonneveld A J, Berg B M M， Meijer M, et al. Identification of functional interaction sites on proteins using bacteriophage-displayed random epitope libraries[J]. Gene, 1995, 167:49-52.
, 百拇医药
[7] Chiriinos-Rojas C L, Steward M W, Partidos C D. A phage-displayed mimotope inhibits tumour necrosis factor-alpha-induced cytotoxicity more effectively than the free mimotope[J]. Immunology, 1999, 96(1): 109-113.
[8] Smith G P, Scott J K. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage[J]. Methods in Enzymology, 1993, 217: 228-257.
收稿日期：1999-10-08；修回日期：2000-03-30, 百拇医药
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海，200433
关键词：噬菌体肽库；随机9肽；庚型肝炎病毒；抗原表位
病毒学报000317 中图分类号：R373.2+1; Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0270-03
Screening of Antigenic Epitope for Hepatitis G Virus
from Phage-displayed Random Nonapeptide Library
CAO Jie，ZHAO Ping，QI Zhong-tian
, 百拇医药
(Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract: The purpose of the study was to screen the antigenic epitope with monoclonal antibody against hepatitis G virus envelope protein 2 (HGV E2) from phage-displayed constrained nonapeptide library (PVⅢ9aa-cys). E. coli XLl-blue infected with PVⅢ9aa-cys was spread on 2×YT plates containing ampicillin and tetracycline. Transducting unit(TU) of PVⅢ9aa-cys was about 1.6×1012/ml by calculating the number of clones. The DNA sequence of PVⅢ9aa-cys, determined with cycle sequencing, was found randomly arranged in NNN order. Both ends of the nonapeptide(NNN)9 linked with a cysteine respectively. Through four rounds biopanning of PVⅢ9aa-cys with MAb M-13-IgG, 6 of 14 positive clones were proved sharing the consensus aa sequence VXXSPL while 4 clones shared sequence VXSPL. Sequence VX(X) SPL was of homology with VRSPL of HGV E2 between aa 218-222. Average 0.D. value(A450) of 10 phage clones with the consensus aa sequence were higher than those of the other 4 clones and PVⅢ9aa-cys(P<0.05). These results demonstrate the possibility that sequence VRSPL is an antigenic epitope of HGV E2. This work provides new information for the diagnosis of HGV infection as well as vaccine development of HGV.
, 百拇医药
Key words: phage-displayed peptide library; random nonapeptide; hepatitis G virus; antigenic epitope
自1985年美国Missouri大学Smith博士首先建立噬菌体表面展示技术(phage display techniques，PDT)以来，这一技术在研究分子间相互识别,如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已充分显示其独特的优势[1]。该技术是以经过改建的噬菌粒为载体，将外源基因插入噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因中，从而使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体表面，并保持一定的空间构象。噬菌体表面随机表达多肽文库技术的建立，使表面展示由单一表达转入随机表达，应用特定的靶分子(如抗体、受体或其它分子等)可从中筛选出相应的配体，通过测定插入基因的序列即可明确其表达产物的氨基酸序列[2，3]。因此，噬菌体随机肽库已成为研究分子间相互作用的有力工具。本文用抗庚型肝炎病毒(hepatitis G virus，HGV)包膜蛋白2(envelope protein 2，E2)单克隆抗体M-13-IgG为靶分子，从构象限制性噬菌体随机9肽库(PVⅢ9aa-cys)中筛选HGV特异性的抗原表位。
, 百拇医药
PVⅢ9aa-cys由意大利IRBM研究所Paolo Monici博士惠赠，它是将合成的编码随机9个三联密码子(NNN)9的双链寡核苷酸片段插入噬菌粒载体pC89的PVⅢ基因，再以之转化F性菌毛阳性的XLl-blue宿主菌而获得，外源基因的两端各有1个半胱氨酸，且具有氨苄青霉素(Amp)抗性[4]。宿主菌XLl-blue购自Stratagene公司，具有四环素(Tet)抗性。辅助噬菌体M13KO7购自Pharmacia公司，具有卡那霉素(Kan)抗性。抗HGV E2单克隆抗体(MAb)M-13-IgG，由德国Roche诊断试剂公司Engel博士馈赠。NAP缓冲液含80mmol/L NaCl，50mmol/L NH4H2PO4 pH7.0；PEG/NaCl含20%(W/V)聚乙二醇8000，2.5mol/L NaCl；TBS含50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150mmol/L NaCl。HRP/Anti-M13 MAb-M13MAb购自Pharmacia公司。四甲基联苯胺(TMB)显色系统购自华美生物工程公司。DNA测序试剂盒为Promega公司产品。测序引物为5′-CCCACGCATAACCGATA-3′，由上海Sangon公司合成。核酸电泳系统为Bio Rad公司产品。
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由于我们得到的肽库仅能供一次筛选使用，为了能用这个肽库进行后续的工作，我们首先对PVⅢ9aa-cys肽库进行了扩增，并鉴定了扩增肽库的库容量和随机性。噬菌体肽库的库容量用TU(transducting unit，TU)值来衡量，即每毫升肽库感染F性菌毛阳性大肠杆菌所形成的菌落数。将1μlPVⅢ9aa-cys稀释至1/10 000，取10μl感染XLⅠ-blue感受态菌后，加至10ml 2×YT(含Tet20μg/ml)中，37℃摇荡25min后，各取1μl、10μl、100μl接种Amp及Tet双抗性平板，37℃培养过夜，计数生长菌落，最少生长菌落数乘以稀释倍数即为TU值。结果表明扩增得到的噬菌体9肽库的TU值为1.6×1012TU/ml。TU值越大即库容量越大，可结合靶分子的数目就越多。迄今为止，文献报道的噬菌体随机肽库TU值多在1010/ml～1012/ml之间，且已证实能够有效进行筛选[5～7]。本结果表明我们扩增得到的噬菌体9肽库有足够的库容量，能保证对靶分子筛选的需要。以碱裂解法提取噬菌粒，用循环测序法测定PVⅢ9aa-cys DNA序列以判断扩增肽库的随机性，表明编码9肽的27个碱基为A、C、G、T的概率相同。因此，该肽库是任意9个三联密码子的组合，具有良好的随机性。测序结果还证实在9肽库DNA两侧各连接1个半胱氨酸(Cys)密码子TGC，由于两个Cys分子能形成二硫键，可使该噬菌体随机9肽库呈环状，形成一定的空间构象，更有利于筛选靶分子。
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本试验以抗HGV E2 MAb M-13-IgG为靶分子，对扩增得到的噬菌体随机环形9肽库进行筛选。先用0.5μgM-13-IgG包被聚苯乙烯96孔培养板，加180μl封闭液(含5mg/ml BSA，0.1mol/L NaHCO3), 室温放置2h，用洗液I(含0.5mol/L Tris-base，1.5mol/L NaCl，0.25% Tween20，pH7.5)洗3次，加入PVⅢ9aa-cys(1.6×1012TU/ml)30μl，置37℃1h，用洗液Ⅱ(含0.5mol/L Tris-base，1.5mol/L NaCl，0.5%Tween20，pH7.5)洗30次，加洗脱液(含0.1mol/L HCl，1mg/ml BSA，用甘氨酸调pH至2.2)放置8min，吸出至Ep管中，加15μlmol/L Tris-HCl(pH9.0)。洗脱的噬菌体于37℃感染XL1-blue感受态菌后，加至10ml含Tet的2×YT培养液，37℃摇荡30min后，慢摇10min，再加入辅助噬菌体M13KO7(1.25×1012TU/ml)40μl及适量Amp，于37℃摇荡45min后，10 000r/min离心5min，弃上清，沉淀用2×YT重悬后再离心1次，最后沉淀物用2×YT重悬后加至30ml 2×YT(含Tet 20μg/ml，100μg/ml，Kan 50μg/ml)中，37℃摇菌过夜。次日提取扩增的噬菌体[8]，再用于第2轮筛选，同上共进行4轮筛选。将第4轮洗脱的噬菌体感染XL1-blue感受态菌，接种于含Amp固体培养基，培养过夜。
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挑取第4轮筛选后的14个单克隆菌落，分别接种至2ml含Tet及Amp的2×YT培养液中，37℃摇菌过液，次日按常规方法小量抽提质粒DNA。用循环测序法测定质粒DNA序列。由14个核苷酸序列推导出氨基酸序列，结果发现有6个噬菌体克隆具有氨基酸共同序列VXXSPL，4个克隆具有氨基酸共同序列VXSPL，其余4个克隆无共同氨基酸序列(表1)。与HGV E2蛋白进行同源性分析表明，氨基酸共同序列VXXSPL(VXSPL)与HGV E2第218～222位氨基酸VRSPL有较高的同源性。
将抗HGV E2 MAb M-13-IgG包被酶联板，用1%BSA封闭1h，再加入TBS稀释的单克隆噬菌体以及扩增的PVⅢ9aa-cys100μl(均约1010TU/ml)，37℃孵育1h，用洗液I洗板5次，加入1：5 000稀释的HRP/Anti-M13 MAb，37℃反应40min后，用TMB显色5min，测定吸光度A450值。有共同氨基酸序列的10个噬菌体克隆的A450值明显高于另4个噬菌体克隆及扩增肽库的A450值(P<0.05)，表明其与MAb M-13-IgG有高结合反应(图1)。该结果进一步证实了VRSPL可能是抗HGV E2 MAb M-13-IgG识别的抗原表位，为HGV感染疾病的诊断、治疗药物的设计及疫苗研究提供了重要依据。
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表1 筛选噬菌体克隆的外源氨基酸序列
Table 1 Exogenous amino acid sequences of
the selected phage clones Phage
Amino acid sequence
1
CRVCLSPLPNC
2
CARPVEVSPLC
3
CRVNASPLKSC
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4
CCSGVYDSPLC
5
CHSVMRSPLKC
6
CHLVYDSPLIC
7
CLQRVASPLNC
8
CPIRHVPSPLC
9
CVVLSPLDKMC
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CIHSIVPSPLC
11
CRAIQLVYPDC
12
CWYFHPLGSEC
13
CHAMHALRLKC
14
CDASIPHYSNC
图1 噬菌体克隆与抗HGV E2
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MAb的ELISA反应
Figure 1 Bingding assay of phage clones with
MAb against HGV E2 by ELISA(A450)
(致谢：本实验得到意大利IRBM研究所Paolo Monici博士、德国Roche Diagnostics的Engel博士以及第二军医大学微生物学教研室潘卫副教授和朱分禄博士的大力支持，特此致谢。)
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39830330)和杰出青年科学基金资助项目(39825116)
作者简介：曹洁(1965-)，女，天津人，博士后，讲师，研究方向为分子病毒学。联系电话：(021)25070267；E-mail：qizt@smmu.edu.cn.
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参考文献：
[1] Smith G P， Petrenko V A. Phage display[J]. Chem Rev,1997, 97:391-410.
[2] Devlin J J, Panganiban L C, Devlin P E. Random peptide libraries: A source of specific protein binding molecules[J]. Science, 1990, 249: 404-406.
[3] He X, Liu S, Perry K L. Identification of epitopes in cucumber mosaic virus using a phage-displayed random peptide library[J]. J Gen Virol, 1998, 79(12):3145-3153.
, 百拇医药
[4] Felici F, Castagnoli L, Musacchio A, et al. Selection of antibody ligands from a large library of oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector[J]. J Mol Biol, 1991, 222:301-310.
[5] Craig L, Sanschagrin P C, Rozek A, et al. The role of structure in antibody cross-reactivity between peptides and folded proteins[J]. J Mol Biol,1998, 281(1):183-201.
[6] Zonneveld A J, Berg B M M， Meijer M, et al. Identification of functional interaction sites on proteins using bacteriophage-displayed random epitope libraries[J]. Gene, 1995, 167:49-52.
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[7] Chiriinos-Rojas C L, Steward M W, Partidos C D. A phage-displayed mimotope inhibits tumour necrosis factor-alpha-induced cytotoxicity more effectively than the free mimotope[J]. Immunology, 1999, 96(1): 109-113.
[8] Smith G P, Scott J K. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage[J]. Methods in Enzymology, 1993, 217: 228-257.
收稿日期：1999-10-08；修回日期：2000-03-30, 百拇医药