家蝇二氯苯醚菊酯抗性机理的初步研究
作者：朱礼华 赵彤言 程景侠 董言德 陆宝麟
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，全军媒介生物学与防治重点实验室，北京 100071
关键词：家蝇；P450基因；PCR；RT-PCR
寄生虫与医学昆虫学报000109摘要 为了研究家蝇拟除虫菊酯抗性机理，在实验室选育了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系，根据P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物，用PCR方法从敏感品系和抗性品系个体都能扩增出一条约210bp的特异性片段，从片段大小和条带明亮程度上均未显示出二者之间有什么差异，初步表明抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。RT-PCR结果多次重复显示抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮，揭示二者RNA的含量可能不同，抗性品系P450基因的转录活性可能升高。这些为在分子水平研究P450基因相关的拟除虫菊酯抗性机理打下基础。
, 百拇医药
PRELIMINARY STUDIES ON THE MECHANISMS OF
PYRETHROID RESISTANCE IN HOUSEFLIES
Zhu Lihua
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Zhao Tongyan
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Cheng Jingxia
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
, 百拇医药
Dong Yande
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Lu Baolin
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Abstract To study the molecular mechanisms of P450 related pyrethroid-resistance in houseflies,a permethrin-resistant housefly strain was selected. According to P450 gene MDCYP6D1 and MDCYP6A1,which were putative gene responsible for pyrethroid-resistance in houseflies,two primers(named P1 and P2) were designed. A distinctive fragment can be obtained using PCR.From the Genome DNA of both selected permethrin-resistant and susceptible strain. it show no difference between this two strains on the fragment lengths and bright. But the results of RT-PCR have showed some undefined differences between this two stains,the fragment is much brighter in resistant strain,which may show the P450 gene transcribed much more mRNA.
, 百拇医药
Key words Houseflies Permethrin-resistant PCR PT-PCR SSCP
拟除虫菊酯具有杀虫谱广、选择毒性强、在环境中易被分解成无毒化合物，曾被广泛应用于卫生害虫的防治中，然而随之产生的抗药性问题严重影响了这类杀虫剂的使用，因此拟除虫菊酯抗性机理研究越来越引起重视。一般认为昆虫对杀虫剂产生抗性的原因主要有三种：表皮穿透性降低、作用部位结构的改变以及对杀虫剂解毒作用的增强，其中后者更为重要(唐振华，1993)。离体及活体的实验研究结果表明：多功能氧化酶P450活性的增强是家蝇对拟除虫菊酯产生的主要原因之一(孙耘芹，1993)，随着分子生物学技术的应用，为在分子水平研究P450基因相关的拟除虫菊酯抗性机理打下基础，为此在实验室选育了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系，用PCR等技术对其抗性相关的P450基因作了相应研究，结果如下：
1 材料与方法
1.1 家蝇Musea domestica Linnaeus
, http://www.100md.com
敏感品系(SS)：为本实验室正常饲养10年以上，没有接触过任何杀虫剂。
二氯苯醚菊酯抗性品系(Pm-R)：采自北京的野外种群，在实验室选育30代以上，抗性倍数达2 000倍以上(未发表资料)。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 羽化3d～4d的成蝇低温麻醉后，加300μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,1%SDS,50mmol/L NaCl,0.15mmol/L精胺，0.5mmol/L亚精胺，pH8.6)匀浆，再加2.5μL蛋白酶K(40mg/mL)，50℃水浴过夜，用等体积水饱和酚、氯仿-异戊醇(24：1)各抽提一次，乙醇沉淀，沉淀溶于100μL双蒸水ddH2O。
1.2.2 RNA提取(一步法) 取单只家蝇腹部，加100μL裂解液(4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，0.5%SDS，0.1巯基乙醇，pH7.0)，等体积氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀溶于20μL双蒸水ddH2O。
, 百拇医药
1.2.3 PCR方法的建立
1.2.3.1 引物设计 根据家蝇CYP6D1的保守序列设计(Tomita et al.,1995)，并参考家蝇P450基因CYP6A1的相应序列(Feyereisen et al.,1989)，京海生物工程公司合成，引物P1：GAAACCACCCGCAAATACCC，引物P2：ACAATGCCTTGGACC CTCTCC。扩增片段长度为212bp。
1.2.3.2 PCR反应总体积25μL 分别加入10×PCR缓冲液(0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl,pH8.4,0.15mol/L MgCl2,1mg/mL明胶)2.5μL，dNTP(25mmol/L)2μL，引物(25μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，余下用双蒸水ddH2O补齐。
1.2.3.3 PCR循环条件 95℃预变性10min、94℃变性1min、65℃复性50sec、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
, 百拇医药
1.2.3.4 1%琼脂糖电泳 75V电压出胶，60V恒压1h，紫外灯下拍照。
1.2.4 RT-PCR RT反应 反应体积10μL，其中dNTP 2μL，AMV酶2U，AMV缓冲液2μL，随机引物1μL，RNA样品4μL。室温(28℃)放置10min，42℃水浴30min，95℃5min，后迅速放入-20℃冻存。PCR循环反应和1%琼脂糖电泳同上。
2 结果
2.1 PCR扩增的结果
根据家蝇抗性品系(LPR)的P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物，同时分别提取敏感品系和抗性品系的不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，发现两组都能扩增出一条相同大小的特异性扩增片段(图1)，两组间的个体比较并没有显出明显不同，但不同个体条带的明亮程度有一定差异。
, 百拇医药
图1 PCR扩增琼脂糖电泳结果
1～3：抗性株；4～6：敏感株
Fig.1 1% Agarose Electrophoresis of PCR
1～3:resistant strains;4～6:susceptible strains
2.2 RT-PCR结果
同时分别提取敏感品系和抗性品系的不同个体的总RNA，逆转录后进行PCR扩增，结果也都能扩增出一条特异性扩增片段(图2)，但多次重复实验发现抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮。
图2 RT-PCR扩增琼脂糖电泳结果
, 百拇医药
1～4：敏感株；5：标准DNA；6～9：抗性株
Fig.2 1% Agarose Electrophoresis of RT-PCR
1～4:susceptible strains；5：markers;6～9:resistant strains
3 讨论
目前对昆虫抗药性研究比较清楚的是尖音库蚊(广义)对有机磷抗性的分子机理，其主要原因是由于起主要解毒作用的酯酶基因扩增所致，即在DNA水平上的变化，基因扩增导致了基因的拷贝数增加，相应表达的酯酶蛋白量增高，对杀虫剂的水解能力增强从而使蚊虫对有机磷类杀虫剂产生抗性。P450氧化代谢引起的抗性机理也逐步有了一些明确的认识，有研究认为与P450蛋白的结构变化有关，而更多的研究发现是由于P450蛋白量的增加，氧化代谢活力的增强。在对拟除虫菊酯抗性品系LPR的研究中发现，P450基因CYP6D1在抗性家蝇中表达水平比敏感品系高(Tomita et al.,1995)。本研究用PCR方法发现抗性品系的个体和敏感品系的个体一样，都能扩增出一条相同大小的特异性扩增片段，初步显示抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。对扩增产物进行单链构象多态分析(PCR-SSCP)也曾发现抗性品系和敏感品系的扩增产物一样在一级结构上均有相同的多态性(另文报道)，在抗性品系的个体中P450基因的DNA没有基因突变的现象发生，即无所谓质的变化。RT-PCR结果发现二者也都能扩增出一条特异性扩增片段，说明P450基因在两个品系的个体中均有表达，而多次重复实验发现抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮，说明在抗性品系个体中RNA的量有所增加，可能是P450基因的转录RNA活性有所升高。至于与抗性之间的数量关系还有待进一步研究。
, 百拇医药
国家自然科学基金课题，批准号：39470643
本文联系人：赵彤言
参考文献
1，冷欣夫，唐振华，王荫长.1996.杀虫药剂分子毒理学及昆虫抗药性.北京：中国农业出版社，136～138.
2，孙耘芹，袁家硅，龚坤元.1990.家蝇对拟除虫菊酯农药的抗性机制.昆虫学报，33(3)：265～271.
3，唐振华.1993.昆虫抗药性及其治理.北京：中国农业出版社，166～203.
4，黄俊勇，冷欣夫.1991.P450酶系的研究进展.昆虫知识，28(5)：308～310.
5，翟启慧.1995.昆虫分子生物学的一些进展：杀虫剂抗性的分子基础.昆虫学报，38(4)：493～497.
, 百拇医药
6，Alan, J.P.1991 The cytochrome P450 gene superfamily.Int. J.Exp. Path.72:349～363.
Ernest Hodgson 1983 The significance of cytochrome P450 in insects.Insect Biochem.13(3):237～246.
7，Feyereisen,R.1989 Isolation and sequence of cDNA encoding a cytochrome P-450 from an insecticide-resistant strain of the housefly,Musca domestica. Proc. Natl.Acad.Sci.USA,861465～1469.
8，Liu Nannan and J.F.Scott 1996 Genetic analysis of factors controlling high-level expression of cytochrome P450,CYP6D1,cytochrome b5,P450 reductase,and monooxygenase activities in LPR houseflies,Musca domestica. Biochem. Genet.34(3/4):133～148.
, http://www.100md.com
9，Tomita, T. and J.G.Scott 1995 cDNA and reduced protein sequence of CYP6D1:the putative gene for a cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in house fly. Insect Biochem. Mol. Biol.25(2):275～283.
10，Tomita, T.,N.Liu,F.F.Smith et al. 1995 Molecular mechanisms involved in increased expression of a cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in the housefly,Musca domestica. Insect Mol. Biol. 4(3):135～140.
收稿日期：1999-04-01, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，全军媒介生物学与防治重点实验室，北京 100071
关键词：家蝇；P450基因；PCR；RT-PCR
寄生虫与医学昆虫学报000109摘要 为了研究家蝇拟除虫菊酯抗性机理，在实验室选育了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系，根据P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物，用PCR方法从敏感品系和抗性品系个体都能扩增出一条约210bp的特异性片段，从片段大小和条带明亮程度上均未显示出二者之间有什么差异，初步表明抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。RT-PCR结果多次重复显示抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮，揭示二者RNA的含量可能不同，抗性品系P450基因的转录活性可能升高。这些为在分子水平研究P450基因相关的拟除虫菊酯抗性机理打下基础。
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PRELIMINARY STUDIES ON THE MECHANISMS OF
PYRETHROID RESISTANCE IN HOUSEFLIES
Zhu Lihua
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Zhao Tongyan
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Cheng Jingxia
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
, 百拇医药
Dong Yande
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Lu Baolin
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Abstract To study the molecular mechanisms of P450 related pyrethroid-resistance in houseflies,a permethrin-resistant housefly strain was selected. According to P450 gene MDCYP6D1 and MDCYP6A1,which were putative gene responsible for pyrethroid-resistance in houseflies,two primers(named P1 and P2) were designed. A distinctive fragment can be obtained using PCR.From the Genome DNA of both selected permethrin-resistant and susceptible strain. it show no difference between this two strains on the fragment lengths and bright. But the results of RT-PCR have showed some undefined differences between this two stains,the fragment is much brighter in resistant strain,which may show the P450 gene transcribed much more mRNA.
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Key words Houseflies Permethrin-resistant PCR PT-PCR SSCP
拟除虫菊酯具有杀虫谱广、选择毒性强、在环境中易被分解成无毒化合物，曾被广泛应用于卫生害虫的防治中，然而随之产生的抗药性问题严重影响了这类杀虫剂的使用，因此拟除虫菊酯抗性机理研究越来越引起重视。一般认为昆虫对杀虫剂产生抗性的原因主要有三种：表皮穿透性降低、作用部位结构的改变以及对杀虫剂解毒作用的增强，其中后者更为重要(唐振华，1993)。离体及活体的实验研究结果表明：多功能氧化酶P450活性的增强是家蝇对拟除虫菊酯产生的主要原因之一(孙耘芹，1993)，随着分子生物学技术的应用，为在分子水平研究P450基因相关的拟除虫菊酯抗性机理打下基础，为此在实验室选育了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系，用PCR等技术对其抗性相关的P450基因作了相应研究，结果如下：
1 材料与方法
1.1 家蝇Musea domestica Linnaeus
, http://www.100md.com
敏感品系(SS)：为本实验室正常饲养10年以上，没有接触过任何杀虫剂。
二氯苯醚菊酯抗性品系(Pm-R)：采自北京的野外种群，在实验室选育30代以上，抗性倍数达2 000倍以上(未发表资料)。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 羽化3d～4d的成蝇低温麻醉后，加300μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,1%SDS,50mmol/L NaCl,0.15mmol/L精胺，0.5mmol/L亚精胺，pH8.6)匀浆，再加2.5μL蛋白酶K(40mg/mL)，50℃水浴过夜，用等体积水饱和酚、氯仿-异戊醇(24：1)各抽提一次，乙醇沉淀，沉淀溶于100μL双蒸水ddH2O。
1.2.2 RNA提取(一步法) 取单只家蝇腹部，加100μL裂解液(4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，0.5%SDS，0.1巯基乙醇，pH7.0)，等体积氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀溶于20μL双蒸水ddH2O。
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1.2.3 PCR方法的建立
1.2.3.1 引物设计 根据家蝇CYP6D1的保守序列设计(Tomita et al.,1995)，并参考家蝇P450基因CYP6A1的相应序列(Feyereisen et al.,1989)，京海生物工程公司合成，引物P1：GAAACCACCCGCAAATACCC，引物P2：ACAATGCCTTGGACC CTCTCC。扩增片段长度为212bp。
1.2.3.2 PCR反应总体积25μL 分别加入10×PCR缓冲液(0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl,pH8.4,0.15mol/L MgCl2,1mg/mL明胶)2.5μL，dNTP(25mmol/L)2μL，引物(25μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，余下用双蒸水ddH2O补齐。
1.2.3.3 PCR循环条件 95℃预变性10min、94℃变性1min、65℃复性50sec、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
, 百拇医药
1.2.3.4 1%琼脂糖电泳 75V电压出胶，60V恒压1h，紫外灯下拍照。
1.2.4 RT-PCR RT反应 反应体积10μL，其中dNTP 2μL，AMV酶2U，AMV缓冲液2μL，随机引物1μL，RNA样品4μL。室温(28℃)放置10min，42℃水浴30min，95℃5min，后迅速放入-20℃冻存。PCR循环反应和1%琼脂糖电泳同上。
2 结果
2.1 PCR扩增的结果
根据家蝇抗性品系(LPR)的P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物，同时分别提取敏感品系和抗性品系的不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，发现两组都能扩增出一条相同大小的特异性扩增片段(图1)，两组间的个体比较并没有显出明显不同，但不同个体条带的明亮程度有一定差异。
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图1 PCR扩增琼脂糖电泳结果
1～3：抗性株；4～6：敏感株
Fig.1 1% Agarose Electrophoresis of PCR
1～3:resistant strains;4～6:susceptible strains
2.2 RT-PCR结果
同时分别提取敏感品系和抗性品系的不同个体的总RNA，逆转录后进行PCR扩增，结果也都能扩增出一条特异性扩增片段(图2)，但多次重复实验发现抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮。
图2 RT-PCR扩增琼脂糖电泳结果
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1～4：敏感株；5：标准DNA；6～9：抗性株
Fig.2 1% Agarose Electrophoresis of RT-PCR
1～4:susceptible strains；5：markers;6～9:resistant strains
3 讨论
目前对昆虫抗药性研究比较清楚的是尖音库蚊(广义)对有机磷抗性的分子机理，其主要原因是由于起主要解毒作用的酯酶基因扩增所致，即在DNA水平上的变化，基因扩增导致了基因的拷贝数增加，相应表达的酯酶蛋白量增高，对杀虫剂的水解能力增强从而使蚊虫对有机磷类杀虫剂产生抗性。P450氧化代谢引起的抗性机理也逐步有了一些明确的认识，有研究认为与P450蛋白的结构变化有关，而更多的研究发现是由于P450蛋白量的增加，氧化代谢活力的增强。在对拟除虫菊酯抗性品系LPR的研究中发现，P450基因CYP6D1在抗性家蝇中表达水平比敏感品系高(Tomita et al.,1995)。本研究用PCR方法发现抗性品系的个体和敏感品系的个体一样，都能扩增出一条相同大小的特异性扩增片段，初步显示抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。对扩增产物进行单链构象多态分析(PCR-SSCP)也曾发现抗性品系和敏感品系的扩增产物一样在一级结构上均有相同的多态性(另文报道)，在抗性品系的个体中P450基因的DNA没有基因突变的现象发生，即无所谓质的变化。RT-PCR结果发现二者也都能扩增出一条特异性扩增片段，说明P450基因在两个品系的个体中均有表达，而多次重复实验发现抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮，说明在抗性品系个体中RNA的量有所增加，可能是P450基因的转录RNA活性有所升高。至于与抗性之间的数量关系还有待进一步研究。
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国家自然科学基金课题，批准号：39470643
本文联系人：赵彤言
参考文献
1，冷欣夫，唐振华，王荫长.1996.杀虫药剂分子毒理学及昆虫抗药性.北京：中国农业出版社，136～138.
2，孙耘芹，袁家硅，龚坤元.1990.家蝇对拟除虫菊酯农药的抗性机制.昆虫学报，33(3)：265～271.
3，唐振华.1993.昆虫抗药性及其治理.北京：中国农业出版社，166～203.
4，黄俊勇，冷欣夫.1991.P450酶系的研究进展.昆虫知识，28(5)：308～310.
5，翟启慧.1995.昆虫分子生物学的一些进展：杀虫剂抗性的分子基础.昆虫学报，38(4)：493～497.
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6，Alan, J.P.1991 The cytochrome P450 gene superfamily.Int. J.Exp. Path.72:349～363.
Ernest Hodgson 1983 The significance of cytochrome P450 in insects.Insect Biochem.13(3):237～246.
7，Feyereisen,R.1989 Isolation and sequence of cDNA encoding a cytochrome P-450 from an insecticide-resistant strain of the housefly,Musca domestica. Proc. Natl.Acad.Sci.USA,861465～1469.
8，Liu Nannan and J.F.Scott 1996 Genetic analysis of factors controlling high-level expression of cytochrome P450,CYP6D1,cytochrome b5,P450 reductase,and monooxygenase activities in LPR houseflies,Musca domestica. Biochem. Genet.34(3/4):133～148.
, http://www.100md.com
9，Tomita, T. and J.G.Scott 1995 cDNA and reduced protein sequence of CYP6D1:the putative gene for a cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in house fly. Insect Biochem. Mol. Biol.25(2):275～283.
10，Tomita, T.,N.Liu,F.F.Smith et al. 1995 Molecular mechanisms involved in increased expression of a cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in the housefly,Musca domestica. Insect Mol. Biol. 4(3):135～140.
收稿日期：1999-04-01, http://www.100md.com