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编号:10258592
我国八代按蚊及其近缘种rDNA-ITS2序列差异和分类地位的探讨
http://www.100md.com 《寄生虫与医学昆虫学报》 2000年第1期
     作者:马雅军 瞿逢伊 雷心田 曹毓存

    单位:马雅军(第二军医大学病原生物学教研室,上海 200433);瞿逢伊(第二军医大学病原生物学教研室,上海 200433);雷心田(四川省寄生虫病防治研究所,成都 610041);曹毓存(沈阳市卫生防疫站,沈阳 110031)

    关键词:八代按蚊;筠连按蚊;核糖体DNA;序列;分类地位

    寄生虫与医学昆虫学报000107摘要 对采用自四川、辽宁、山东及韩国的八代按蚊和四川的筠连按蚊,进行核糖体DNA第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)序列差异分析。结果显示:四川、辽宁及对照韩国八代按蚊群体间的ITS2序列同源性达96.7%~99.6%;筠连按蚊与各地(除山东外)八代按蚊间序列同源性达96.2%~99.8%,与四川同域的八代按蚊除一个碱基缺失外,rDNA-ITS2序列完全相同,显然属于种内变异水平,筠连按蚊可能是八代按蚊的同物异名:而山东八代按蚊与各地八代按蚊相比则同源性仅70.4%~71.1%,差异明显增大,提示山东的“八代按蚊”为一存疑蚊种,其分类地位尚需要进一步研究确定。
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    SEQUENCE DIFFERENCES OF rDNA-ITS2 OF ANOPHELES

    YATSUSHIROENSIS AND SIBILING SPECIES IN CHINA,WITH

    DISCUSSION ON TAXONOMIC STATUS

    Ma Yajun

    (Department of Etiologic Biology,Second Military Medical University,Shanghai 200433)

    Qu Fenyi

    (Department of Etiologic Biology,Second Military Medical University,Shanghai 200433)
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    Lei Xintian

    (Sichuan Institute of Antiparasitic Diseases,Chengdu 610041)

    Cao Yucun

    (Shenyang Health and Anti-epidemic Station,Shenyang 110031)

    Abstract The sequences of second internal transcribed spacers of ribosomal DNA (rDNA-ITS2) of different sources of Anopheles yatsushiroensis and An.junlianensis from China has been compared.The range of identity of Anopheles yatsushiroensis among the specimens from Sichuan,Liaoning,and South Korea (control) was from 96.7% to 99.6%. The range of identity among An.junlianensis and different sources of An.yatsushiroensis,except Shandong,was 92.2% to 99.8%.The rDNA-ITS2 sequences of An.junlianensis and An.yatsushiroensis from symptric Sichuan province was identically except the loss of one base “T” at position 491,the variation between above two mosquito species was in the intraspecific level,and belong to the same species.The An.junlanensis should be the synonym of An.yatsushiroensis.The identity of An.yatsushiroensis from Shandong varies from the other sites in the range of 70.4% to 71.1%.It indicated that An.yatsushiroensis from Shandong would be a doubtful species.
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    Key words Anopheles yatsushiroensis Anopheles junlianensis Ribosomal DNA Sequence Taxonomic status

    八代按蚊Anopheles yatsushiroensis Miyazaki,1951的模式产地为日本九州。我国学者经多年研究,在东北、华北、华东及西南等省均有分布记录,并发现其形态有不同程度的地理变异(许锦江,1997)。此后,国内又有学者分别报告了与八代按蚊近似的两个新种:小宽按蚊An.xiaokuanus Ma 1981(马素芳,1981)和筠连按蚊An.junlianensis Lei 1996(雷心田,1996)。小宽按蚊经遗传学研究证实与八代按蚊杂交后代F1具生育力,幼虫染色体联会,不存在生殖隔离(缪建吾等,1998)。综上情况表明我国八代按蚊鉴别困难,容易发生混淆,本研究通过核糖体DNA第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)序列差异分析,对我国八代按蚊及其近缘种的分类地位作探讨。
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    1 材料和方法

    1.1 蚊种及来源

    本研究筠连按蚊采自四川洪雅(1997,Ⅷ,30),八代按蚊采自四川蒲江(1997,Ⅸ,30)、辽宁东港(1997,Ⅷ,26)和法库(1996,Ⅸ)、山东荣城(1991,Ⅵ,10,标本系许锦江教授惠赠),并以采自韩国京畿道(1997,Ⅷ,14)的八代按蚊作对比,研究用蚊种及采集地代号见表1。每采集地或每种蚊随机取2~4个70%酒精保存的雌性成蚊作为测序样本。

    1.2 扩增rDNA-ITS2区及测序

    按Collins等(1987)的方法提取单蚊基因组DNA,溶于50μL双蒸灭菌水中,置0℃冰箱保存待用。扩增rDNA-ITS2区片段按Ma等(1998)的方法,PCR产物经1%琼脂糖(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳,从胶中回收扩增片段(QIAGEN公司胶回收试剂盒),用四色荧光标记双脱氧链终止法测序(PE-ABI377全自动测序仪)。所得序列用PCGENE软件(Version 5.05)分析其同源性及差异,必要时用手工排序。
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    以上反应中所用试剂除注明外,均采用国产分析纯。

    2 结果

    用5.8S引物和28S引物从单蚊基因组扩增的片段,包括部分5.8S和28S编码区序列,以及ITS2区全长。编码区序列与中华按蚊相同(Ma et al.,1998),ITS2区界限根据5.8S与28S编码区碱基配对形成的二级结构,并参照其它蚊种确定。筠连按蚊和各地八代按蚊(其中辽宁东港和法库的标本序列完全相同,合并为YLN)的rDNA-ITS2序列特征见图,其序列长度和GC含量如表1。

    表1 筠连按蚊和各地八代按蚊的分子特征

    Tab. 1 The molecular characters of Anopheles junlianensis and An.yatsushiroensis 蚊种

, http://www.100md.com     Species

    采集地

    Collection Site

    代号

    Code

    ITS2长度(bp)

    Length of ITS2(bp)

    GC含量(%)

    GC Contenet(%)

    筠连按蚊

    四川洪雅

    JSC
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    452

    45.70

    An.junlianensis

    Sichuan

    八代按蚊

    四川蒲江

    YSC

    453

    45.47

    An.yatsushiroensis

    Sichuan

    辽宁东港和法库
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    YLN

    453

    45.70

    Liaoning

    韩国京畿道

    YK

    456

    46.27

    Korea

    山东荣城

    YSD

    459

    45.32
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    Shandong

    将筠连按蚊和各地八代按蚊的ITS2序列进行同源性分析和对比排序(表2,图1),显示四川、辽宁及韩国八代按蚊群体间的序列同源性达96.7%~99.6%,除3处双碱基改变(排序位置142~143,445~446,453~454)外,其它均为单个碱基的改变,包括缺失/插入或置换/颠换共有12处;筠连按蚊与各地八代按蚊(山东除外)序列同源性达96.2%~99.8%,与四川同域的八代按蚊相比,除在491位有一个T缺失外完全一致;采自山东荣城的八代按蚊与四川、辽宁及韩国的八代按蚊相比,同源性明显为低,分别为71.1%、70.9%和70.4%,其差异包括178个碱基位改变,其中有3个较大缺口(排序位置387~395,402~410,468~472)。表2 各地八代按蚊及近似种rDNA-ITS2序列间的同源性和差异性

    Tab. 2 The identity and diversity of rDNA-ITS2 sequences between Anopheles
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    yatsushiroensis and allied species.

    YSC

    JSC

    YLN

    YK

    YSD

    YSC

    -

    0.2

    2.9

    3.3

    28.9

    JSC
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    99.8

    -

    3.8

    3.5

    29.1

    YLN

    97.1

    96.2

    -

    0.4

    29.1

    YK

    96.7
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    96.5

    99.6

    -

    29.6

    YSD

    71.1

    70.9

    70.9

    70.4

    -

    下三角为同源性(%),上三角为差异性 (%)

    below diagonal:identity,above diagonal:diversity
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    图1 八代按蚊和筠连按蚊的rDNA-ITS2序列特征(蚊种代号及来源见表1)

    Fig.1 The nucleotide sequence of ITS2 regions of ribosomal DNA from Anopheles yatsushiroensis

    and An.junlianensis.(the code of mosquito species and its collection site see Table 1)

    3 讨论

    rDNA-ITS2序列特征在种内非常保守,而在种间具有一定差异,其差异程度在不同复合体成员种间有所不同(Paskewitz et al,1993,Cornel et al,1996)。本研究八代按蚊来自四川、辽宁及韩国,不同群体间虽然地理位置相距甚远,但ITS2区序列相当保守,其长度、碱基成分及GC含量及排列基本一致,差异性仅0.4%~3.3%,表明ITS2区序列是鉴别按蚊近缘种的理想指标。蚊虫群体内、群体间及种内序列偶尔由错配造成的个别碱基改变,反映了蚊类遗传的多样性。将八代按蚊与近缘的中华按蚊(An.sinensis)和嗜人按蚊(An.anthropophagus)的ITS2序列相比,其差异性分别为26%、29.2%,均属我国赫坎按蚊复合体成员种种间变异范围(Ma et al,1998)。
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    筠连按蚊是根据四川省筠连县牛房的标本命名的新种,其形成与八代按蚊极为近似,用于鉴别的多为不稳定的可变特征(如:幼虫头毛3-C分支数,成蚊触须末端的淡色区域等);它与八代按蚊在四川省珙县、筠连、乐山、蒲江等地均为同域分布(雷心田,1996)。本研究比较筠连按蚊与八代按蚊的rDNA-ITS2序列特征,显示两种蚊的序列无明显差异,处于种内变异水平,提示两者可能为同一蚊种,即筠连按蚊可能是八代按蚊的同物异名。

    采自山东荣城的八代按蚊(许锦江等,1993)ITS2区序列,与其它三地的八代按蚊有较大差别,同源性仅为70.4%~71.1%,将其与中华按蚊和嗜人按蚊相比,同源性也不高,分别为80.6%、85%,提示山东荣城的“八代按蚊”为一存疑蚊种,其分类地位尚需进一步研究确定。以往报告采自辽宁庄河的“八代按蚊”与四川及北京的八代按蚊杂交有生殖隔离现象,分析可能为新种(缪建吾等,1998)。综上情况表明我国八代按蚊形态特征复杂,原订八代按蚊中可能有近缘种混淆,各地八代按蚊的分布记录尚需进一步核实。
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    蚊虫分类鉴定除对生活史各期形态进行系统研究外,采用分子鉴别方法,可能是识别蚊媒分类鉴定中错误和混淆有效的辅助手段。特别是无法用形态特征作出明确鉴别的隐种(cryptic species),采用rDNA-ITS2序列差异分析或PCR鉴别检测,均可获得明确可靠的结果,对判别存疑蚊种的分类地位具有重要的参考价值。

    国家自然科学基金资助项目(批准号:39670663)

    参考文献

    1,马素芳.1981.我国中华按蚊种团的研究,包括四新种.动物学集刊,1:59~70.

    2,许锦江.1997.八代按蚊.见:陆宝麟主编.中国动物志—昆虫纲 第九卷 双翅目蚊科(下卷).北京:科学出版社,36~38.

    3,许锦江,俞渊,王世平,等.1993.凶小库蚊应氏亚种在山东省荣城市发现.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,11(1):57~59.
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    4,雷心田.1996.按蚊属一新种描记(双翅目:蚊科).四川动物,15(1):1~4.

    5,缪建吾,潘家复,蒋文斌.1988.中国赫坎按蚊类群的六种按蚊的杂交和染色体的观察.动物学研究,9(3):231~237.

    6,Collins,F.H.,M.A.Mendez,M.O.Rasmussen et al.1987 A ribosomal RNA gene probe differentiates member species of the Anopheles gambiae complex.Am.J.Trop.Med.Hyg.37(1):37~41.

    7,Cornel,A.J.,C.H.Porter,F.H.Collins 1996 Polymerase chain reaction species diagnostic assay for Anopheles quadrimaculatus cryptic species (Diptera:Culicidae) based on ribosomal DNA ITS2 sequences.J.Med.Entomol.33(1):109~116.
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    8,Ma Yajun,Qu Fengyi,Xu Jiannong et al.1998 Sequence differences of rDNA-ITS2 and species-diagnostic PCR assay of Anopheles sinensis and Anopheles anthropophagus from China.J.Med.Coll.PLA.13(2):123~128.

    9,Miyazaki,I.1951 On a new anopheline mosquito Anopheles yatsushiroensis n.sp.found in Kyushu,with some remarks on two related species of the genus.Kyushu.Mem.Med.Sci.2(3):195~206.

    10,Paskewitz,S.M.,D.M.Wesson,F.H.Collins 1993 The internal transcribed spacers of ribosomal DNA in five members of the Anopheles gambiae species complex.Insect Mol.Biol.2(4):247~257.

    收稿日期:1999-09-14, 百拇医药