小鼠血吸虫感染后肝脏羟脯氨酸含量测定方法的实验研究
作者：应奇才 周承
单位：应奇才(杭州医学高等专科学校机能实验室 杭州 310012)；周承(浙江大学附属第一医院传染病研究所，杭州 310005)
关键词：
寄生虫与医学昆虫学报000112LABORATORY EXPLORE ON BIOCHEMICAL ASSAY OF
HYDROXYPROLINE IN SCHISTOSOMIASIS MICE LIVERS
Ying Qicai
(Hangzhou Medical College 310012)
Zhun Cheng
, http://www.100md.com
(The Institute of Infectious Diseases,the first affiliated hospital of Zhejiang University 310005)
机体胶原蛋白的主要特征性成份之一为羟脯氨酸，它占胶原蛋白氨基酸总量的13%，因此测定肝脏组织的羟脯氨酸含量，是反映肝脏纤维化程度的直接指标。但传统的测定方法有待进一步完善，在此作者进行了部分改进。
1 材料和方法
1.1 实验材料
用日本血吸虫大陆株尾蚴30±2条感染ICR小鼠80只，分别于4周、5周、6周、7周、8周、9周、11周、12周、14周、16周剖杀小鼠，每次6～8只，取其肝脏备测，同时以10只正常同种小鼠为对照。
1.2 测定方法
, 百拇医药
将肝组织剪碎，置于青霉素小瓶中，用乙醚、丙酮混合液脱脂2～3次，每次24 h以上，110℃烘干致恒重，称取3mg～6 mg，加工1 mL 6 mol/L HCl于具塞试管中，于98℃水解28h，冷却后加6 mol/LNaOH中和，稀释至5.0 mL，取0.5 mL水解液，用氯胺T法(金博，1994)测定其羟脯氨酸含量。
2 结果与讨论
2.1 实验条件
2.1.1 水解方式 对胶原纤维的水解方式见于各种报道(金博等，1994；许志勤等，1990；宋代军等，1987；Mitchell AD et al.,1970;Reddy GK,1996)，主要为110℃酸式水解24 h及125℃、压力20磅下酸式水解3 h。经作者试验发现：110℃水解24 h，极易爆腾、烧干；125℃高压水解，亦易发生爆裂。作者经过重复试验发现，在98℃水解28h，可达到酸式水解完全。测定结果如表1。
, http://www.100md.com
表1 不同水解方式对肝HYP测定的影响
Tab.1 The effects of various hydrolysis conditions on the detections of liver hydroxyproline 水解方式
Hydrolysis conditions
样品数
Samples
HYP含量(ug/mg)(
±s)
Contents of Hyp(ug/mg)(±s)
, 百拇医药
110℃水解24h
be hydrolysised in 24 hours
with the temperature 110℃
10
15.34±2.64
98℃水解28h
be hydrolysised in 28 hours
with the temperature 98℃
10
14.52±2.46
, 百拇医药 125℃高压水解3h
be hydrolysised on high pressure in 3 hours
with the temperature 125℃
10
15.17±2.73
经统计学检验表明，不同水解方式对羟脯氨酸测定无显著性影响。在98℃酸式水解28 h，可避免110℃水解的爆腾、烧干和125℃高压水解的爆裂现象，使测定方法较为安全可靠。
2.1.2 测定体系中PH的影响 据文献报道(许志勤等，1990；宋代军等，1987)，水解液需精确调pH至5～7后才可测定。作者将水解好的样品分别在调pH至5～7后、直接(此时pH<0)及部分中和(加入一定量NaOH，使pH在2～6的范围内)测定羟脯氨酸含量，结果如下表2：表2 pH对肝Hyp测定的影响
, 百拇医药
Tab.2 The effects of pH on the detections of liver hydroxyproline pH
样本数
Samples
Hyp 含量(μg/mL)(±s)
Contents of hydroxyproline
5～7
10
1.78±0.23
<0
, 百拇医药
10
1.42±0.21
2～6
10
1.69±0.25
由此可得，pH不调与调有明显差异(t=3.655，P<0.01)，pH粗调与精调没有显著差别(t=0.838，P>0.05)。而将pH调至5～7过于繁锁，只需粗略估算需加NaOH量，使pH在2～6的范围内，对结果没有影响。
综上所述，可以确定小鼠肝组织羟脯氨酸含量测定的适宜条件：1)肝组织在98℃，28 h内酸式水解完全；2)水解后只要粗略估算需加NaOH的量，使水解液pH在2～6范围内，而不必精确调pH。因而使羟脯氨酸测定更为简便、准确，具有一定推广价值。
, 百拇医药
2.2 羟脯氨酸测定方法在小鼠血吸虫病肝纤维化研究中的应用
将本法应用于日本血吸虫病小鼠肝纤维化的动态研究中，结果如图1所示：
图1 小鼠感染日本血吸虫后肝脏羟脯氨酸的动态变化
Fig.1 Hydroxyproline in the livers of mice after infection with Schistosoma japonica at different times
本研究得到浙江省自然科学基金资助(基金编号395120)
参考文献
1，许志勤，高兰兴.1990.组织羟脯氨酸测定方法的改进.解放军预防医学杂志，(6)：40～41.
, 百拇医药
2，宋代军，顾德官，茅守玉.1987.高血压大鼠尿和组织中羟脯氨酸的测定.上海第二医科大学学报，7(1)：58～59.
3，金博，李玉彬，王朝，等.1994.氯氨T法测定羟脯氨酸含量的方法改进.陕西医学检验，9(3)：176.
4，Reddy,G.K.1996 A simplified method for the analysis of hydroxyprofine in biological tissuses.Clin Biochem 29(3):225～229.
5，Mitchell,A.D.,I.E.P. Taylor.1970 The spectrophometric determination of hydroxyproline:An analytical investigation.Analyst 95:1003～1005.
收稿日期：1998-11-23, 百拇医药
单位：应奇才(杭州医学高等专科学校机能实验室 杭州 310012)；周承(浙江大学附属第一医院传染病研究所，杭州 310005)
关键词：
寄生虫与医学昆虫学报000112LABORATORY EXPLORE ON BIOCHEMICAL ASSAY OF
HYDROXYPROLINE IN SCHISTOSOMIASIS MICE LIVERS
Ying Qicai
(Hangzhou Medical College 310012)
Zhun Cheng
, http://www.100md.com
(The Institute of Infectious Diseases,the first affiliated hospital of Zhejiang University 310005)
机体胶原蛋白的主要特征性成份之一为羟脯氨酸，它占胶原蛋白氨基酸总量的13%，因此测定肝脏组织的羟脯氨酸含量，是反映肝脏纤维化程度的直接指标。但传统的测定方法有待进一步完善，在此作者进行了部分改进。
1 材料和方法
1.1 实验材料
用日本血吸虫大陆株尾蚴30±2条感染ICR小鼠80只，分别于4周、5周、6周、7周、8周、9周、11周、12周、14周、16周剖杀小鼠，每次6～8只，取其肝脏备测，同时以10只正常同种小鼠为对照。
1.2 测定方法
, 百拇医药
将肝组织剪碎，置于青霉素小瓶中，用乙醚、丙酮混合液脱脂2～3次，每次24 h以上，110℃烘干致恒重，称取3mg～6 mg，加工1 mL 6 mol/L HCl于具塞试管中，于98℃水解28h，冷却后加6 mol/LNaOH中和，稀释至5.0 mL，取0.5 mL水解液，用氯胺T法(金博，1994)测定其羟脯氨酸含量。
2 结果与讨论
2.1 实验条件
2.1.1 水解方式 对胶原纤维的水解方式见于各种报道(金博等，1994；许志勤等，1990；宋代军等，1987；Mitchell AD et al.,1970;Reddy GK,1996)，主要为110℃酸式水解24 h及125℃、压力20磅下酸式水解3 h。经作者试验发现：110℃水解24 h，极易爆腾、烧干；125℃高压水解，亦易发生爆裂。作者经过重复试验发现，在98℃水解28h，可达到酸式水解完全。测定结果如表1。
, http://www.100md.com
表1 不同水解方式对肝HYP测定的影响
Tab.1 The effects of various hydrolysis conditions on the detections of liver hydroxyproline 水解方式
Hydrolysis conditions
样品数
Samples
HYP含量(ug/mg)(
±s)Contents of Hyp(ug/mg)(
±s), 百拇医药
110℃水解24h
be hydrolysised in 24 hours
with the temperature 110℃
10
15.34±2.64
98℃水解28h
be hydrolysised in 28 hours
with the temperature 98℃
10
14.52±2.46
, 百拇医药 125℃高压水解3h
be hydrolysised on high pressure in 3 hours
with the temperature 125℃
10
15.17±2.73
经统计学检验表明，不同水解方式对羟脯氨酸测定无显著性影响。在98℃酸式水解28 h，可避免110℃水解的爆腾、烧干和125℃高压水解的爆裂现象，使测定方法较为安全可靠。
2.1.2 测定体系中PH的影响 据文献报道(许志勤等，1990；宋代军等，1987)，水解液需精确调pH至5～7后才可测定。作者将水解好的样品分别在调pH至5～7后、直接(此时pH<0)及部分中和(加入一定量NaOH，使pH在2～6的范围内)测定羟脯氨酸含量，结果如下表2：表2 pH对肝Hyp测定的影响
, 百拇医药
Tab.2 The effects of pH on the detections of liver hydroxyproline pH
样本数
Samples
Hyp 含量(μg/mL)(
±s)Contents of hydroxyproline
5～7
10
1.78±0.23
<0
, 百拇医药
10
1.42±0.21
2～6
10
1.69±0.25
由此可得，pH不调与调有明显差异(t=3.655，P<0.01)，pH粗调与精调没有显著差别(t=0.838，P>0.05)。而将pH调至5～7过于繁锁，只需粗略估算需加NaOH量，使pH在2～6的范围内，对结果没有影响。
综上所述，可以确定小鼠肝组织羟脯氨酸含量测定的适宜条件：1)肝组织在98℃，28 h内酸式水解完全；2)水解后只要粗略估算需加NaOH的量，使水解液pH在2～6范围内，而不必精确调pH。因而使羟脯氨酸测定更为简便、准确，具有一定推广价值。
, 百拇医药
2.2 羟脯氨酸测定方法在小鼠血吸虫病肝纤维化研究中的应用
将本法应用于日本血吸虫病小鼠肝纤维化的动态研究中，结果如图1所示：
图1 小鼠感染日本血吸虫后肝脏羟脯氨酸的动态变化
Fig.1 Hydroxyproline in the livers of mice after infection with Schistosoma japonica at different times
本研究得到浙江省自然科学基金资助(基金编号395120)
参考文献
1，许志勤，高兰兴.1990.组织羟脯氨酸测定方法的改进.解放军预防医学杂志，(6)：40～41.
, 百拇医药
2，宋代军，顾德官，茅守玉.1987.高血压大鼠尿和组织中羟脯氨酸的测定.上海第二医科大学学报，7(1)：58～59.
3，金博，李玉彬，王朝，等.1994.氯氨T法测定羟脯氨酸含量的方法改进.陕西医学检验，9(3)：176.
4，Reddy,G.K.1996 A simplified method for the analysis of hydroxyprofine in biological tissuses.Clin Biochem 29(3):225～229.
5，Mitchell,A.D.,I.E.P. Taylor.1970 The spectrophometric determination of hydroxyproline:An analytical investigation.Analyst 95:1003～1005.
收稿日期：1998-11-23, 百拇医药