考马斯亮蓝染色法检测人精子顶体反应的评价*
作者：江一平 卓丹心**陈 勇 林芸秀 韩咪莎
单位：福建医科大学组织学胚胎学教研室，福州 350004；**南京军区福州医学高等专科学校
关键词：精子；顶体反应；考马斯亮蓝；人
解剖学报980325 摘 要 为建立一种检测人精子顶体反应的简便实用的新技术，用3.5%高氯酸水溶液配制0.05%考马斯亮蓝(R250)染色液浸染人精子30min，顶体完整者顶体区染成紫蓝色，顶体反应者则不染。对获能前后和钙离子载体A23187诱导顶体反应的精子进行染色并与经典的顶体反应检测技术PSA法对照，两种方法检测顶体反应率无显著差异。方法学检验证明新技术结果可靠。本法操作简便、经济，普通显微镜即可检测，易于推广，克服了原有技术复杂昂贵的缺点，具有研究和临床诊断的良好价值。
顶体反应(acrosome reaction, AR)是精子在受精过程中所经历的重要环节之一。已完成获能的精子受一定因素诱导而发生AR，将顶体内的酶释放出来以溶解卵放射冠和透明带(ZP)，从而穿越ZP并和卵母细胞融合——完成受精。业已证明，只有完成AR的精子，才能与卵母细胞融合，但AR的机理尚未阐明。近年来还发现，人精子“顶体反应缺陷”(acrosome reaction insufficiency)是临床上所谓“不明原因不育症”的病因之一[1]。因此，检测精子是否发生AR成为生殖生物学和生殖医学十分常用的研究手段。自1967年Brros等用电子显微镜术证明了AR以来，众多学者致力于较简便实用的AR检测技术研究并相继建立了数以十计的方法。然而，由于精子及其顶体的种间差异很大致使各种方法均有较大应用局限。特别是人精子的顶体很小，检测难度极大，迄今只有少数技术具有实用性但也因各种客观因素而存在显著缺点[2，3]。如迄今最为可靠且广为应用的PSA法，因需借助免疫荧光技术而显昂贵和不便，尤其难于满足临床要求。近年来Moller\+\{[4]\}和Aarons[5，6]等采用考马斯亮蓝染色来检测小鼠AR，方法简便、经济。本研究对此法稍加改良，移用于人精子AR的检测并进行方法学评价，报道如下。
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材料和方法
1. 精液标本采集与精子分离
手淫法采集生育过的健康男子精液。经常规分析各项指标符合WHO精液标准[7]的标本予以采用。用上游技术分离活动良好的精子，具体按SPA技术[8，9]稍加改良进行：于5ml的BWW(含HSA3.5g/L)底部加入已液化的新鲜精液0.5ml，于37℃恒温箱中呈20°角斜置30 min，使活动力良好的精子上游；收集上层精子悬液，500×g离心5 min，沉淀精子用适量BWW悬浮，计数活动率≥95%者用BWW稀释至精子密度为5～10×109/L，即为未获能活精子。
2.精子获能与诱导顶体反应
精子悬液分装于1.5ml容量的eppendorf管，1.0ml/管，Parafilm密封，37℃培养5～6h，以使精子获能。显微镜观察获能培养的精子，活动力显著增强而活动率不降低并有约20%精子呈现超激活状态者视为完成获能。获能后的精子悬液中加入溶于DMSO的1 mmol/L钙离子载体A23187 (Sigma, C7522)10μl/管，终浓度为10 μmol/L，Parafilm密封，37℃继续培养1h以诱导顶体反应。
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3. 考马斯亮蓝染色液的配制
50mg考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250, CBB， Fluke)以3.5%的高氯酸(上海桃浦化工厂)水溶液100 ml煮沸溶解，滤纸过滤，取滤液置棕色瓶中贮存，即为0.05%考马斯亮蓝染色液。
4. 精子的考马斯亮蓝染色法
精子悬液离心(500×g， 5 min)，沉淀以4%甲醛-PBS溶液悬浮固定10 min，离心去上清，PBS洗涤2遍；适量PBS悬浮沉淀，吸取20 μl精子悬液涂片晾干(或电吹风吹干)；精子涂片用0.05%考马斯亮蓝(CBB)染色液滴玻片或入染色缸中浸染30 min，三蒸水冲洗玻片，晾干，中性树脂封片。普通光学显微镜观察。
同一供精者的平行样片经上述染色后加1%苯胺棕(BB)酸性水溶液(100ml加2 mol/L盐酸4滴)复染5 min，其余步骤同上。
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5. 精子的PSA免疫荧光染色
按Mendoza改良的一步法操作[10]，简述如下。精子悬液离心(500×g， 5 min)，沉淀以适量PBS悬浮，吸取20μl精子悬液涂片，电吹风吹干；纯甲醇固定30s，迅速干燥，用溶于PBS的100 mg/L氢溴酸罗丹明豌豆凝集素(TRITC-PSA, Sigma, L6639)孵育30 min；双蒸水冲洗并浸泡15 min，吹干；50%甘油PBS封片；指甲油封边。
观察采用Olympus落射荧光显微镜(BH-RFL-W-I)，荧光附件包括：G激发滤片/G双色分光组件(激发光谱0～545nm)、O-515阻挡滤片，×40油浸物镜观察。每份标本分别观察2片平行样。每片计数精子200个以上，观察精子荧光图像并分型记录；换算各型精子的平均百分率；凡顶体区呈TRITC-PSA染色阳性者为顶体完整者，而赤道带出现带状染色或顶体区染色阴性者为已发生AR者，全精子染色者为死亡精子。计数AR型精子在3种类型中的百分率视为AR率。
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6. 实验设计和方法学评价
6.1. 对未获能(0组)、获能后(1组)和诱导AR(2组)的精子分别进行考马斯亮蓝(CBB)染色、CBB染色后加BB复染(CBB+)和PSA免疫荧光染色检测精子AR率。统计各组精子的AR率并对不同染色法的AR率进行配对资料t检验，比较3种技术评价顶体反应的差异。统计学处理采用Microsoft Excel 7.0的分析工具软件在586微机上进行。
6.2.由8位观察者对同一张经A23187诱导AR的CBB或CBB+染色标本，各计数>200个精子，记录AR率，分别统计两组的均数、标准差和批内变异系数(CV)并作配对资料t检验，方法同上。
图1 精子CBB染色图像。标尺10μmA.顶体完整 B.顶体反应
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Fig.1 Human sperm stained with CBBA:Acrosome intact
B:Acrosome reacted. Bar=10 μm
图2 二型精子构成比变化 n=8
Fig.2 Percentage of two patterns of spermatozoa. n=8
0:incapacitated 1:capacitated 2:acrosome reacted
图3 三种方法检测AR率比较 n=6
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Fig.3 Comparison of 3 methods. n=6CBB+:CBB+Bismark brown
结 果
经CBB染色后，所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈两种染色类型：A型和B型。A型精子的顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色；B型精子顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似(图1)。两类精子的根本差别是顶体区是否染成紫蓝色。加苯胺棕复染后，精子呈色反应基本不变，但顶体区与顶体后区的反差增强，较有利于观察。对未获能、获能后和诱导AR的精子分别进行考马斯亮蓝染色，发现两类精子的构成比发生规律性变化。A型精子在未获能组百分率最高，经获能和诱导AR后依次下降；B型精子百分率变化则呈相反趋势，于A23187诱导AR后达最高峰。同一型精子的百分率在不同组间有高度显著性差异(P<0.01，图2)。据此，将A型精子视为顶体完整者，B型判为顶体缺失，代表精子已完成顶体反应(AR)，即B型精子百分率可视为精子的AR发生率。
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对0、1、2三组精子分别同时用3种方法检测AR率的实验结果表明，3种方法对AR率的评价在各组均无显著差异(P>0.05)，参见图3。
8位观察者分别对同一张经A23187诱导AR精子的CBB和CBB+染色标本进行观察，前者的AR率为76.04%±3.6%，CV为4.74%；后者AR率为74.83%±3.02%，CV为4.03%，两者无显著差异(P>0.05)。
讨 论
研究结果表明，考马斯亮蓝(CBB)可将人精子染成两种类型即A型和B型，两者的主要区别是精子的顶体区是否染成紫蓝色。获能前的精子绝大部分(>95%)呈A型——顶体区染紫蓝色。本研究应用上游技术分离活精子，只有活动率≥95%的标本才被采用，故绝大部分精子的结构包括顶体应是完整的，所以A型精子当是顶体完整者，其顶体区可被考马斯亮蓝染成紫蓝色；经钙离子载体A23187处理后，大部分精子表现为B型——顶体区不染紫蓝色。A23187是公认的顶体反应(AR)诱导剂，经其处理后精子发生AR而致顶体丢失，故B型精子可能是顶体缺失者。这说明CBB染色可区分不同的顶体状态，其B型精子百分率可代表精子AR率。用检测AR的经典技术PSA法与之对照，表明两者检测的AR率无显著差异。方法学实验表明，CBB染色的批内变异系数低，说明该法可重复性好，结果可靠。以上证明，考马斯亮蓝染色可作为检测AR的可靠方法。此外，苯胺棕复染结果虽与单纯考马斯亮蓝染色无明显差别，但其染色反差较强，批内变异系数略小，对观察经验较少者有利，必要时可作为一补充选择。
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迄今国际上已报道的检测人精子AR的技术大体有4类[2，3]，即凝集素亲和荧光技术、金霉素荧光染色技术、三色染色法和间接免疫细胞化学技术。在这些技术中，凝集素法尤其是其中的PSA法因技术可靠而得到广泛应用，但其试剂昂贵、操作复杂；金霉素法虽试剂较便宜，但染液须新鲜配制，实验方法较不稳定。以上两类技术均需采用荧光显微镜观察，仪器较贵重，且荧光标本不易保存，对推广应用有较大局限性，尤其不便在临床和基层单位推广；三色染色法的染色效果常随染料批号或精液标本的差异而受影响，方法也显繁琐，故建立近20年来应用者不多；免疫细胞化学技术则需特异性抗精子抗体，同样昂贵、复杂，仅在少数实验室采用。本研究证明Moller和Aarons等建立的考马斯亮蓝染色法也可用于人精子的AR检测，表明其具有一定的通用性，这具有良好的实践价值。考马斯亮蓝是常用的蛋白质染料，试剂价廉易得，染色操作简单，标本可保存，普通显微镜即可观察，十分经济实用。
值得指出的是，Aarons[6，11]等报道考马斯亮蓝对小鼠染色仅需2min，而我们的预实验显示需要≥30min才能使小鼠精子顶体染色，这或许与染料来源不同有关。我们的预实验还显示，相同条件下人精子染色明显弱于小鼠精子，且延长染色时间并不能加深人精子染色，这可能与种的差异有关。
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收稿 1997-11 修回1998-04
* 福建省自然科学基金资助课题(No. 96A040)
参考文献
[1]Tesarik J, Mendoza C. Sperm treatment with pentoxifylline improves the fertilizing ability in patients with acrosome reaction insufficiency. Fertil Steril, 1993,60(1):141
[2]Cross NL, Meizel S. Methods for evaluating the acrosomal status of mammalian sperm. Biol Reprod, 1989,41:635
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[3]Liu DY, Baker HW. Tests of human sperm function and fertilization in vitro. Fertil Steril,1992,58(3):465
[4]Moller CC, Bleil JD,Kinloch RA, et al. Structural and functional relationships between mouse and hamster zona pellucida glycoproteins. Dev Biol,1990,137(2):276
[5]Aarons D, Boettger-Tong H, Holt G, et al. Acrosome reaction induced by immunoaggregation of a proteinase inhibitor bound to the murine sperm head. Mol Reprod Dev, 1991,30(3):258
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[6]Aarons D, Battle T, Boettger-Tong H, et al. Role of monoclonal antibody J-23 in inducing acrosome reactions in capacitated mouse spermatozoa. J Reprod Fertil, 1992,96(1):49
[7]世界卫生组织编.人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册.第3版.陈振文等译，北京：科学出版社，1994：30
[8]江一平，余庆亮，刘秀玲等.异种体外受精实验模型的建立及其方法学探讨.福建医学院学报，1991，25(4)：297
[9]江一平，余庆亮，李晓光等.精子穿透试验技术改良——小管法体外授精及其效果评价.福建医学院学报，1994，28(4)：301
, 百拇医药 [10]Mendoza C, Carreras A, Moos J, Tesarik J. Disinction between true acrosome reaction and degenerative acrosome loss by a one-step staining method using Pisum sativum agglutinin. J Reprod Fertil, 1992,95(3):755
[11]Biegler BE, Aarons DJ,George BC, et al. Induction of physiological acrosome reactions in caput epididymal spermatozoa of mice. J Reprod Fertil,1994,100(1):219
EVALUATION OF COOMASSIE BRILLIANT BLUE STAINING FOR
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DETECTION OF HUMAN SPERM ACROSOME REACTION
Jiang Yiping，Zhuo Danxin，Chen Yong，Lin Yunxiu,Han Misha
(Department of Histology and Embryology, Fujian Medical University, Fuzhou)
The detection of human sperm acrosome reaction (AR) Coomassie brilliant blue (CBB)staining is evaluated in the present research. The technique is a modification from Aaron's method on mouse(Aarons D et al,1991).The smear of prefixed spermatozoa after swimming-up, capacitation or A23187 pretreatment were stained for 30 min with 0.05%coomassie brilliant blue R250 which resolved in 3.5% perchloric acid (HClO4) and visualized with light microscopy. The sperm population was divided by CBB staining into two types:type A and type B. Type A was positive stained with dark violet blue on acrosome cap while type B was pale or negative stained on the same area. The percentage of type B sperm increased significantly after capacitation or AR induction. A comparison study showed there is no difference in assessing AR rate between CBB method and conventional PSA technique. Therefore, the simple and economical CBB staining procedure provides a reliable method for assessment of the human sperm acrosome reaction.
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KEY WORDS Coomassie brilliant blue; Acrosome reaction; Spermatozoa; Human.
△Department of Histology and Embryology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China
《解剖学报》征稿简约
1.本刊登载人类学、人体解剖学、比较解剖学、神经解剖学、组织学、胚胎学、细胞学、分子细胞学各学科的创见性研究论著。并辟有《综述》、《研究通讯》、《新技术方法》、《书讯》、《书评》等栏目。
2.投稿一式一两份，并请自留底稿。来稿须附单位推荐书，并声明同一资料未一稿多投。
3.论著及综述一般不超过6 000字(包括参考文献、英文摘要、表和文内插图)，每文可附文后插页图1版。欢迎投3 000字以内的短篇报道文章(包括中、英文摘要)，结果与讨论合述，参考文献不超过5条，可附1版图。《研究通讯》每篇不超过600字(不附插图、表、文献、关键词)，可用英文撰稿(须用中文注明文题、作者和单位)。
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4.来稿用计算机5号字(每行40字)隔行(每页20行)打印。简化字以国务院1964年2月批准的《简化字总表》及1986年的说明为准。计量单位以1991年7月1日开始实行的，由国家科委和新闻出版署共同发布的《科学技术期刊管理办法》中的国际标准、国家标准和法定计量单位为准，并应注意新旧单位换算。
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6.中、英文关键词尽可能采用《中国医学主题词表》(1983年出版，1993年再版)中所列的中、英文词。
7.中、英文摘要推行结构式，即依次写出目的、方法、结果和结论，字数以不超400字为宜。
8.表格按统计学制表原则设计，尽量使用三线表。用白纸绘制并插于文内，应有表题(中、英文并用)和序号，全表同一项目保留的小数位数应相同并与正文相符。
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10.参考文献附于正文末，另页书写或打字，并依文中出现的先后排序，以不超过15篇为宜。文献书写格式：[期刊]作者(1～3作者).文题.刊名，年，卷(期)：起页；[书籍]作者(1～作者).书名.卷次.版次.出版地：出版者，年：起页～迄页。未发表的文章或个人通信不应作为参考文献。
11.凡是可以使用阿拉伯数字，而且又很得体的地方，均应使用阿拉伯数字。
12.来稿文责自负，刊登与否由编委会审定，编委会有权对来稿作文字和图的加工。退修稿时间一般限在1个月以内，超过3个月且未声明原因者，按自动退稿处理。稿件排版后，因印刷程序较紧，著者接校样后须尽快寄回。对已排版的校样，除重要原则问题外，请铁作大的更改。
13.来稿刊登后的致稿酬。论著、综述赠送单行本15本，《研究通讯》稿赠本期学报1本，不拟刊登之稿负责退还。
14.来稿寄至北京东四西大街42号《解剖学报》编辑部(邮政编码100710)。
《解剖学报》编辑部
1998年1月
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单位：福建医科大学组织学胚胎学教研室，福州 350004；**南京军区福州医学高等专科学校
关键词：精子；顶体反应；考马斯亮蓝；人
解剖学报980325 摘 要 为建立一种检测人精子顶体反应的简便实用的新技术，用3.5%高氯酸水溶液配制0.05%考马斯亮蓝(R250)染色液浸染人精子30min，顶体完整者顶体区染成紫蓝色，顶体反应者则不染。对获能前后和钙离子载体A23187诱导顶体反应的精子进行染色并与经典的顶体反应检测技术PSA法对照，两种方法检测顶体反应率无显著差异。方法学检验证明新技术结果可靠。本法操作简便、经济，普通显微镜即可检测，易于推广，克服了原有技术复杂昂贵的缺点，具有研究和临床诊断的良好价值。
顶体反应(acrosome reaction, AR)是精子在受精过程中所经历的重要环节之一。已完成获能的精子受一定因素诱导而发生AR，将顶体内的酶释放出来以溶解卵放射冠和透明带(ZP)，从而穿越ZP并和卵母细胞融合——完成受精。业已证明，只有完成AR的精子，才能与卵母细胞融合，但AR的机理尚未阐明。近年来还发现，人精子“顶体反应缺陷”(acrosome reaction insufficiency)是临床上所谓“不明原因不育症”的病因之一[1]。因此，检测精子是否发生AR成为生殖生物学和生殖医学十分常用的研究手段。自1967年Brros等用电子显微镜术证明了AR以来，众多学者致力于较简便实用的AR检测技术研究并相继建立了数以十计的方法。然而，由于精子及其顶体的种间差异很大致使各种方法均有较大应用局限。特别是人精子的顶体很小，检测难度极大，迄今只有少数技术具有实用性但也因各种客观因素而存在显著缺点[2，3]。如迄今最为可靠且广为应用的PSA法，因需借助免疫荧光技术而显昂贵和不便，尤其难于满足临床要求。近年来Moller\+\{[4]\}和Aarons[5，6]等采用考马斯亮蓝染色来检测小鼠AR，方法简便、经济。本研究对此法稍加改良，移用于人精子AR的检测并进行方法学评价，报道如下。
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材料和方法
1. 精液标本采集与精子分离
手淫法采集生育过的健康男子精液。经常规分析各项指标符合WHO精液标准[7]的标本予以采用。用上游技术分离活动良好的精子，具体按SPA技术[8，9]稍加改良进行：于5ml的BWW(含HSA3.5g/L)底部加入已液化的新鲜精液0.5ml，于37℃恒温箱中呈20°角斜置30 min，使活动力良好的精子上游；收集上层精子悬液，500×g离心5 min，沉淀精子用适量BWW悬浮，计数活动率≥95%者用BWW稀释至精子密度为5～10×109/L，即为未获能活精子。
2.精子获能与诱导顶体反应
精子悬液分装于1.5ml容量的eppendorf管，1.0ml/管，Parafilm密封，37℃培养5～6h，以使精子获能。显微镜观察获能培养的精子，活动力显著增强而活动率不降低并有约20%精子呈现超激活状态者视为完成获能。获能后的精子悬液中加入溶于DMSO的1 mmol/L钙离子载体A23187 (Sigma, C7522)10μl/管，终浓度为10 μmol/L，Parafilm密封，37℃继续培养1h以诱导顶体反应。
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3. 考马斯亮蓝染色液的配制
50mg考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250, CBB， Fluke)以3.5%的高氯酸(上海桃浦化工厂)水溶液100 ml煮沸溶解，滤纸过滤，取滤液置棕色瓶中贮存，即为0.05%考马斯亮蓝染色液。
4. 精子的考马斯亮蓝染色法
精子悬液离心(500×g， 5 min)，沉淀以4%甲醛-PBS溶液悬浮固定10 min，离心去上清，PBS洗涤2遍；适量PBS悬浮沉淀，吸取20 μl精子悬液涂片晾干(或电吹风吹干)；精子涂片用0.05%考马斯亮蓝(CBB)染色液滴玻片或入染色缸中浸染30 min，三蒸水冲洗玻片，晾干，中性树脂封片。普通光学显微镜观察。
同一供精者的平行样片经上述染色后加1%苯胺棕(BB)酸性水溶液(100ml加2 mol/L盐酸4滴)复染5 min，其余步骤同上。
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5. 精子的PSA免疫荧光染色
按Mendoza改良的一步法操作[10]，简述如下。精子悬液离心(500×g， 5 min)，沉淀以适量PBS悬浮，吸取20μl精子悬液涂片，电吹风吹干；纯甲醇固定30s，迅速干燥，用溶于PBS的100 mg/L氢溴酸罗丹明豌豆凝集素(TRITC-PSA, Sigma, L6639)孵育30 min；双蒸水冲洗并浸泡15 min，吹干；50%甘油PBS封片；指甲油封边。
观察采用Olympus落射荧光显微镜(BH-RFL-W-I)，荧光附件包括：G激发滤片/G双色分光组件(激发光谱0～545nm)、O-515阻挡滤片，×40油浸物镜观察。每份标本分别观察2片平行样。每片计数精子200个以上，观察精子荧光图像并分型记录；换算各型精子的平均百分率；凡顶体区呈TRITC-PSA染色阳性者为顶体完整者，而赤道带出现带状染色或顶体区染色阴性者为已发生AR者，全精子染色者为死亡精子。计数AR型精子在3种类型中的百分率视为AR率。
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6. 实验设计和方法学评价
6.1. 对未获能(0组)、获能后(1组)和诱导AR(2组)的精子分别进行考马斯亮蓝(CBB)染色、CBB染色后加BB复染(CBB+)和PSA免疫荧光染色检测精子AR率。统计各组精子的AR率并对不同染色法的AR率进行配对资料t检验，比较3种技术评价顶体反应的差异。统计学处理采用Microsoft Excel 7.0的分析工具软件在586微机上进行。
6.2.由8位观察者对同一张经A23187诱导AR的CBB或CBB+染色标本，各计数>200个精子，记录AR率，分别统计两组的均数、标准差和批内变异系数(CV)并作配对资料t检验，方法同上。
图1 精子CBB染色图像。标尺10μmA.顶体完整 B.顶体反应
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Fig.1 Human sperm stained with CBBA:Acrosome intact
B:Acrosome reacted. Bar=10 μm
图2 二型精子构成比变化 n=8
Fig.2 Percentage of two patterns of spermatozoa. n=8
0:incapacitated 1:capacitated 2:acrosome reacted
图3 三种方法检测AR率比较 n=6
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Fig.3 Comparison of 3 methods. n=6CBB+:CBB+Bismark brown
结 果
经CBB染色后，所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈两种染色类型：A型和B型。A型精子的顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色；B型精子顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似(图1)。两类精子的根本差别是顶体区是否染成紫蓝色。加苯胺棕复染后，精子呈色反应基本不变，但顶体区与顶体后区的反差增强，较有利于观察。对未获能、获能后和诱导AR的精子分别进行考马斯亮蓝染色，发现两类精子的构成比发生规律性变化。A型精子在未获能组百分率最高，经获能和诱导AR后依次下降；B型精子百分率变化则呈相反趋势，于A23187诱导AR后达最高峰。同一型精子的百分率在不同组间有高度显著性差异(P<0.01，图2)。据此，将A型精子视为顶体完整者，B型判为顶体缺失，代表精子已完成顶体反应(AR)，即B型精子百分率可视为精子的AR发生率。
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对0、1、2三组精子分别同时用3种方法检测AR率的实验结果表明，3种方法对AR率的评价在各组均无显著差异(P>0.05)，参见图3。
8位观察者分别对同一张经A23187诱导AR精子的CBB和CBB+染色标本进行观察，前者的AR率为76.04%±3.6%，CV为4.74%；后者AR率为74.83%±3.02%，CV为4.03%，两者无显著差异(P>0.05)。
讨 论
研究结果表明，考马斯亮蓝(CBB)可将人精子染成两种类型即A型和B型，两者的主要区别是精子的顶体区是否染成紫蓝色。获能前的精子绝大部分(>95%)呈A型——顶体区染紫蓝色。本研究应用上游技术分离活精子，只有活动率≥95%的标本才被采用，故绝大部分精子的结构包括顶体应是完整的，所以A型精子当是顶体完整者，其顶体区可被考马斯亮蓝染成紫蓝色；经钙离子载体A23187处理后，大部分精子表现为B型——顶体区不染紫蓝色。A23187是公认的顶体反应(AR)诱导剂，经其处理后精子发生AR而致顶体丢失，故B型精子可能是顶体缺失者。这说明CBB染色可区分不同的顶体状态，其B型精子百分率可代表精子AR率。用检测AR的经典技术PSA法与之对照，表明两者检测的AR率无显著差异。方法学实验表明，CBB染色的批内变异系数低，说明该法可重复性好，结果可靠。以上证明，考马斯亮蓝染色可作为检测AR的可靠方法。此外，苯胺棕复染结果虽与单纯考马斯亮蓝染色无明显差别，但其染色反差较强，批内变异系数略小，对观察经验较少者有利，必要时可作为一补充选择。
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迄今国际上已报道的检测人精子AR的技术大体有4类[2，3]，即凝集素亲和荧光技术、金霉素荧光染色技术、三色染色法和间接免疫细胞化学技术。在这些技术中，凝集素法尤其是其中的PSA法因技术可靠而得到广泛应用，但其试剂昂贵、操作复杂；金霉素法虽试剂较便宜，但染液须新鲜配制，实验方法较不稳定。以上两类技术均需采用荧光显微镜观察，仪器较贵重，且荧光标本不易保存，对推广应用有较大局限性，尤其不便在临床和基层单位推广；三色染色法的染色效果常随染料批号或精液标本的差异而受影响，方法也显繁琐，故建立近20年来应用者不多；免疫细胞化学技术则需特异性抗精子抗体，同样昂贵、复杂，仅在少数实验室采用。本研究证明Moller和Aarons等建立的考马斯亮蓝染色法也可用于人精子的AR检测，表明其具有一定的通用性，这具有良好的实践价值。考马斯亮蓝是常用的蛋白质染料，试剂价廉易得，染色操作简单，标本可保存，普通显微镜即可观察，十分经济实用。
值得指出的是，Aarons[6，11]等报道考马斯亮蓝对小鼠染色仅需2min，而我们的预实验显示需要≥30min才能使小鼠精子顶体染色，这或许与染料来源不同有关。我们的预实验还显示，相同条件下人精子染色明显弱于小鼠精子，且延长染色时间并不能加深人精子染色，这可能与种的差异有关。
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收稿 1997-11 修回1998-04
* 福建省自然科学基金资助课题(No. 96A040)
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EVALUATION OF COOMASSIE BRILLIANT BLUE STAINING FOR
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DETECTION OF HUMAN SPERM ACROSOME REACTION
Jiang Yiping，Zhuo Danxin，Chen Yong，Lin Yunxiu,Han Misha
(Department of Histology and Embryology, Fujian Medical University, Fuzhou)
The detection of human sperm acrosome reaction (AR) Coomassie brilliant blue (CBB)staining is evaluated in the present research. The technique is a modification from Aaron's method on mouse(Aarons D et al,1991).The smear of prefixed spermatozoa after swimming-up, capacitation or A23187 pretreatment were stained for 30 min with 0.05%coomassie brilliant blue R250 which resolved in 3.5% perchloric acid (HClO4) and visualized with light microscopy. The sperm population was divided by CBB staining into two types:type A and type B. Type A was positive stained with dark violet blue on acrosome cap while type B was pale or negative stained on the same area. The percentage of type B sperm increased significantly after capacitation or AR induction. A comparison study showed there is no difference in assessing AR rate between CBB method and conventional PSA technique. Therefore, the simple and economical CBB staining procedure provides a reliable method for assessment of the human sperm acrosome reaction.
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KEY WORDS Coomassie brilliant blue; Acrosome reaction; Spermatozoa; Human.
△Department of Histology and Embryology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China
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1998年1月
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