生后大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体含量的研究
作者：王 炜 黄威权 吕坤聚 銶新宇
单位：第四军医大学组织学胚胎学教研室，西安 710032；**解放军 401 医院病理科，青岛
关键词：5-羟色胺；5-羟色胺受体；颌下腺；原位定量；免疫组织化学
解剖学报980322 摘 要 为研究大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体的相对含量与日龄的关系，用免疫组织化学法结合原位定量，测定了大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体免疫反应产物的相对含量。结果发现，大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体的相对含量在生后1～60日龄内随日龄的增长而增多，在60～90日龄内基本保持恒定。这提示大鼠颌下腺的5-羟色胺及其受体含量可能与其发育成熟有关。
随着研究的不断深入，人们发现颌下腺不仅能产生消化液，还可合成和分泌多种生物活性物质，这些生物活性物质在颌下腺中的含量与动物年龄有一定关系[1]。我们先前的实验已确立了5-羟色胺在颌下腺的正常分布，而且与5-羟色胺受体有共存关系[2]。本实验采用免疫组织化学ABC法结合原位定量测定，探讨了颌下腺内5-羟色胺及其受体的相对含量与动物日龄之间的关系，为颌下腺的功能提供新的依据。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 试剂
兔抗5-羟色胺多克隆抗体[3]及5-羟色胺β型抗独特型多克隆抗体[4]均为本室自产，ABC药盒购自武汉博士德生物制品公司。
2. 动物及标本制作
正常雄性SD大鼠30只，分为6组，每组5只。第1组为1日龄，第2组为5日龄，第3组为12日龄，第4组为30日龄，第5组为60日龄，第6组为90日龄。上述大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，右心房放血处死，取其左侧颌下腺，按常规石蜡切片的制作程序制成2μm厚的石蜡切片，贴在涂有铬矾明胶的载玻片上，置于37℃烤箱24h备用。
3. 免疫组织化学反应程序
石蜡切片经脱蜡水化后入PBS(pH7.4)，经甲醇-H2O2孵育20min，除去内源性过氧化物酶。按免疫组织化学ABC法进行染色。兔抗5-羟色胺多克隆抗体及其β型抗独特型多克隆抗体的稀释度分别为1∶2 000和1∶400，在4℃冰箱内孵育时间均为24h。生物素标记的羊抗兔IgG抗体的稀释度为1∶200，ABC复合物的稀释度为1∶100，在室温孵育时间分别为1h和30min，DAB-H2O2显色，镜下控制背景。分别用正常兔血清和PBS代替第一抗体孵育作为对照。
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4. 原位定量测定法
用MPV Ⅱ型细胞显微分光光度计对各组动物标本的5-羟色胺及其受体免疫反应产物的相对含量进行测定。每例随机测10个单位面积(相当于1个细胞的面积)，每组测50个单位面积，计算出每个单位面积的5-羟色胺及其受体的相对含量，然后进行t检验统计学处理。
结果与讨论
1. 不同日龄组大鼠颌下腺内5-羟色胺的分布及其相对含量的变化
生后1d到5d，大鼠颌下腺内5-羟色胺免疫反应细胞仅见于分泌管和小叶内导管的上皮细胞(图1)，生后12d阳性细胞开始在浆液性腺泡上皮细胞出现，生后30d阳性细胞数明显增多(图2)，生后60d阳性细胞数进一步增加(图3)，生后90d阳性细胞的分布与生后60d相仿，无明显变化。同时，不同日龄组5-羟色胺免疫反应性产物的相对含量也不相同，见表1。60日龄内的大鼠颌下腺5-羟色胺的相对含量随日龄的增长而增加，其中从1日龄组到5日龄组，5-羟色胺的相对含量增加较慢，这两组间无显著性差异(P>0.05)，从5日龄组到60日龄组其相对含量增加较快，相邻两个日龄组间5-羟色胺的含量差异非常显著(P<0.01)，60日龄后5-羟色胺的相对含量基本恒定，与90日龄组者相比，无显著差异(P>0.05)。
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表1 5-羟色胺在不同日龄大鼠颌下腺相对含量
Table 1 The relative contents of 5-HTin submaxillary glands of different day age rats 动物分组
groups
相对含量/单位面积(
±S)
relative amount/unit area
t值
t
P值
, http://www.100md.com
P
1d
0.0266±0.0082
-
-
5d
0.0275±0.0049
0.0730
>0.05
12d
0.0513±0.0038
3.7780
<0.01
, 百拇医药
30d
0.0733±0.0035
5.5000
<0.01
60d
0.1343±0.0090
4.8410
<0.01
90d
0.1512±0.0067
1.0970
>0.05
, http://www.100md.com
2. 不同日龄组大鼠颌下腺内5-羟色胺受体的分布及其含量的变化
1日龄大鼠颌下腺无5-羟色胺受体在生后5d的大鼠，免疫反应细胞只限于一些导管的上皮细胞。生后12d，免疫反应细胞开始在浆液性腺泡出现。生后30d，阳性细胞数明显增加；生后60d，免疫反应性细胞数进一步增加；生后90d，免疫反应性细胞的分布基本与60d的大鼠相同。原位定量检测表明，5-羟色胺受体在不同发育日龄大鼠颌下腺的相对含量也不同，见表2。在60日龄内的大鼠，颌下腺5-羟色胺受体的相对含量随日龄的增长而增加，其中从1日龄组到5日龄组其相对含量增加较慢，从5日龄组到60日龄组其相对含量增加较快，相邻两个日龄组间5-羟色胺受体的含量差别显著(P<0.05)。(由于5-羟色胺受体与5-羟色胺在颌下腺具有共存关系[2]，故此部分不再附照片)。表2 5-羟色胺受体在不同日龄大鼠颌下腺的相对含量
Table 2 The relative contents of 5-HT receptorin submaxillary glands of different day age rats 动物分组
, http://www.100md.com
groups
相对含量/单位面积(±S)
relative amount/unit area
t值
t
P值
P
1d
0.0245±0.0065
-
-
, 百拇医药
5d
0.0363±0.0030
0.5240
>0.05
12d
0.0396±0.0062
0.5240
<0.05
30d
0.0738±0.0087
2.7141
<0.05
, 百拇医药
60d
0.1024±0.0049
2.2700
<0.05
90d
0.0968±0.0118
1.0570
>0.05
一些资料表明[5]，大鼠颌下腺在14d胚龄时开始发育，至出生时已初具分泌功能，但在出生到生后两周这段时间内，颌下腺结构的成熟分化非常显著，至出生后40d左右，其腺泡结构与成鼠相似，而且颌下腺所含的生物活性物质，也随日龄的增长而逐渐增多。如小鼠颌下腺中的神经生长因子，在生后前2周，没有随日龄增长而增多的趋势，但在此后却表现出明显的随日龄而增多的趋势：15日龄的小鼠颌下腺中的神经生长因子的含量为3.2μg/L，27日龄时含量为9.8μg/L，是15日龄的3倍余；而成年小鼠颌下腺的含量高达30μg/L，是15日龄的10倍。同时颌下腺中所含的各种神经纤维的密度也是随日龄的增长而增大的(但有些神经纤维的密度在日龄增大到一定程度后有回降趋势)。如肾上腺能和胆碱能神经纤维，在出生时即有相当数量的神经纤维支配颌下腺，但其密度在出生后3周才能达到成鼠水平[6]。另外，颌下腺所含的一些酶类的含量也呈现随日龄增长而增多的趋势(如乙酰胆碱酯酶等)。本实验结果证明不同日龄的大鼠颌下腺的5-羟色胺及其受体的相对含量也随日龄增长而增多，这表现在两个方面：一是免疫反应性细胞数的增多；二是免疫反应性物质含量的增多。生后1～5d内免疫反应性细胞仅限于导管的上皮细胞，所有腺泡上皮在这段时间内均无免疫反应。生后12d，免疫反应性细胞开始在腺泡上皮细胞出现，生后30d阳性细胞明显增多，至60d达到成鼠水平，所测得的光密度值也随日龄的增长而增大。其中生后1～5d增大的速度较慢，5d后增大的速度加快，这与颌下腺的其他生物活性物质的变化规律基本相同。有资料表明[6]，肾上腺能和胆碱能神经纤维及P物质神经纤维在颌下腺结构和功能的成熟过程中起着重要的作用，能影响腺泡的分泌(指腺泡分泌成分的改变)。有文献报道，5-羟色胺可影响消化液的分泌，如外源性5-羟色胺可抑制胃酸的分泌，参与肠液电解质的转运等[7，8]。那么5-羟色胺及其受体在颌下腺的出现及其含量与日龄的关系的存在，是否也同颌下腺的成熟过程以及其分泌活动有关，有待进一步研究。收稿 1997-05 修回 1997-09
, 百拇医药
本文图1～3见插图第11页
图版说明
图1 5-羟色胺免疫反应性细胞在5日龄大鼠颌下腺的分布 ×200(下同)
图2 5-羟色胺免疫反应性细胞在30日龄大鼠颌下腺的分布
图3 5-羟色胺免疫反应性细胞在60日龄大鼠颌下腺的分布
↑指示分泌管，↑指示小叶内导管，↑ ↑指示腺泡
Explanation of figures
Fig.1 Showing 5-HT immunoreactive cells in submaxilary gland of a postnatal 5-day rat. ×200(The same as follows)
, http://www.100md.com
Fig.2 Showing 5-HT immunoreactive cells in submaxilary gland of a postnatal 30-day rat.
Fig.3 Showing 5-HT immunoreactive cells in submaxilary gland of a postnatal 60-day rat.
The ↑:points to secretary duct,the ↑：points to interlobular ducts,the ↑ ↑:points to acinus.
参考文献
[1]Virta E, Unsitalo H. Developmental study of substance P and neurokinin A immunoreactivity in ganglia supplying nerves to the submaxillary glands of the rat. Histochemistry, 1993,100(4):311
, http://www.100md.com
[2]王 炜，黄威权，苏慧慈.5-羟色胺及其受体在大鼠颌下腺的免疫组织化学定位.解剖学报，1996，27(2)：198
[3]黄威权，司玉灿，王文超.自制5-羟色胺抗体的特异性和敏感性.第四军医大学学报，1987，16(4)：200
[4]黄威权，孙 岚，王百忍等.5-羟色胺抗独特型抗体的免疫组织化学鉴定及5-羟色胺定位的研究.第四军医大学学报，1995，16(3)：195
[5]Ekstrom J, Ekman R, Hekenson R. Developmental studies on vasoactive intestinal peptide, substance P and calcitonin gene-related peptide in salivary glands of postnatal rats. Acta Physiol Scand, 1994,151(2):107
, 百拇医药
[6]Virta E, Torm W, Unsitalo H, et al. Substance P and neurokinin A immunoreactive nerve fibers in the developing salivary glands of the rat. Histochemistry, 1992,98(4):317
[7]Hansen MB. Involvment of non-classical 5-HT receptor in serotonin and cisapride induced secretion in hen colon. Com Biochem Physiol,1992,101A(2):283
[8]Mohan K, Yin N, Shivia L, et al. Gastrointestinal effects of 5-hydroxytryptamine and related drugs. Life Sci, 1994,54(20):1651
, 百拇医药
STUDIES ON RELATIVE CONTENTS OF 5-HYDROXYTRY-
PTAMINE AND ITS RECEPTOR IN SUBMAXILLARY
GLANDS OF POSTNATAL RAT
PTAMINE AND ITS RECEPTOR IN SUBMAXILLARY
GLANDS OF POSTNATAL RAT
Wang Wei，Huang Weiquan△，Lü Kunju, Di Xinyu
(Department of Histology and Embryology, The Fourth Military Medical
, http://www.100md.com
University, Xi′an;* Department of Pathology, 401 Hospital of PLA, Qingdao′an;* Department of Pathology, 401 Hospital of PLA, Qingdao)
The relationship between the relative contents of 5-hydroxytryptamime (5-HT) and its receptor and age in days of postnatal rat was studied by using immunohistchemistry and in situ quantitative analysis. It showed that they increased with time passing by during postnatal 60 days and kept steadily from 60th to 90th day. These results suggested that the contents of 5-HT and its receptor may implicate mature development of rat.
KEY WORDS 5-HT;5-HT receptor; Submaxillary gland; In situ quantitative determination; Immunohistochemistry
△Department of Histology and Embryology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China, 百拇医药
单位：第四军医大学组织学胚胎学教研室，西安 710032；**解放军 401 医院病理科，青岛
关键词：5-羟色胺；5-羟色胺受体；颌下腺；原位定量；免疫组织化学
解剖学报980322 摘 要 为研究大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体的相对含量与日龄的关系，用免疫组织化学法结合原位定量，测定了大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体免疫反应产物的相对含量。结果发现，大鼠颌下腺5-羟色胺及其受体的相对含量在生后1～60日龄内随日龄的增长而增多，在60～90日龄内基本保持恒定。这提示大鼠颌下腺的5-羟色胺及其受体含量可能与其发育成熟有关。
随着研究的不断深入，人们发现颌下腺不仅能产生消化液，还可合成和分泌多种生物活性物质，这些生物活性物质在颌下腺中的含量与动物年龄有一定关系[1]。我们先前的实验已确立了5-羟色胺在颌下腺的正常分布，而且与5-羟色胺受体有共存关系[2]。本实验采用免疫组织化学ABC法结合原位定量测定，探讨了颌下腺内5-羟色胺及其受体的相对含量与动物日龄之间的关系，为颌下腺的功能提供新的依据。
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材料和方法
1. 试剂
兔抗5-羟色胺多克隆抗体[3]及5-羟色胺β型抗独特型多克隆抗体[4]均为本室自产，ABC药盒购自武汉博士德生物制品公司。
2. 动物及标本制作
正常雄性SD大鼠30只，分为6组，每组5只。第1组为1日龄，第2组为5日龄，第3组为12日龄，第4组为30日龄，第5组为60日龄，第6组为90日龄。上述大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，右心房放血处死，取其左侧颌下腺，按常规石蜡切片的制作程序制成2μm厚的石蜡切片，贴在涂有铬矾明胶的载玻片上，置于37℃烤箱24h备用。
3. 免疫组织化学反应程序
石蜡切片经脱蜡水化后入PBS(pH7.4)，经甲醇-H2O2孵育20min，除去内源性过氧化物酶。按免疫组织化学ABC法进行染色。兔抗5-羟色胺多克隆抗体及其β型抗独特型多克隆抗体的稀释度分别为1∶2 000和1∶400，在4℃冰箱内孵育时间均为24h。生物素标记的羊抗兔IgG抗体的稀释度为1∶200，ABC复合物的稀释度为1∶100，在室温孵育时间分别为1h和30min，DAB-H2O2显色，镜下控制背景。分别用正常兔血清和PBS代替第一抗体孵育作为对照。
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4. 原位定量测定法
用MPV Ⅱ型细胞显微分光光度计对各组动物标本的5-羟色胺及其受体免疫反应产物的相对含量进行测定。每例随机测10个单位面积(相当于1个细胞的面积)，每组测50个单位面积，计算出每个单位面积的5-羟色胺及其受体的相对含量，然后进行t检验统计学处理。
结果与讨论
1. 不同日龄组大鼠颌下腺内5-羟色胺的分布及其相对含量的变化
生后1d到5d，大鼠颌下腺内5-羟色胺免疫反应细胞仅见于分泌管和小叶内导管的上皮细胞(图1)，生后12d阳性细胞开始在浆液性腺泡上皮细胞出现，生后30d阳性细胞数明显增多(图2)，生后60d阳性细胞数进一步增加(图3)，生后90d阳性细胞的分布与生后60d相仿，无明显变化。同时，不同日龄组5-羟色胺免疫反应性产物的相对含量也不相同，见表1。60日龄内的大鼠颌下腺5-羟色胺的相对含量随日龄的增长而增加，其中从1日龄组到5日龄组，5-羟色胺的相对含量增加较慢，这两组间无显著性差异(P>0.05)，从5日龄组到60日龄组其相对含量增加较快，相邻两个日龄组间5-羟色胺的含量差异非常显著(P<0.01)，60日龄后5-羟色胺的相对含量基本恒定，与90日龄组者相比，无显著差异(P>0.05)。
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表1 5-羟色胺在不同日龄大鼠颌下腺相对含量
Table 1 The relative contents of 5-HTin submaxillary glands of different day age rats 动物分组
groups
相对含量/单位面积(
±S)relative amount/unit area
t值
t
P值
, http://www.100md.com
P
1d
0.0266±0.0082
-
-
5d
0.0275±0.0049
0.0730
>0.05
12d
0.0513±0.0038
3.7780
<0.01
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30d
0.0733±0.0035
5.5000
<0.01
60d
0.1343±0.0090
4.8410
<0.01
90d
0.1512±0.0067
1.0970
>0.05
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2. 不同日龄组大鼠颌下腺内5-羟色胺受体的分布及其含量的变化
1日龄大鼠颌下腺无5-羟色胺受体在生后5d的大鼠，免疫反应细胞只限于一些导管的上皮细胞。生后12d，免疫反应细胞开始在浆液性腺泡出现。生后30d，阳性细胞数明显增加；生后60d，免疫反应性细胞数进一步增加；生后90d，免疫反应性细胞的分布基本与60d的大鼠相同。原位定量检测表明，5-羟色胺受体在不同发育日龄大鼠颌下腺的相对含量也不同，见表2。在60日龄内的大鼠，颌下腺5-羟色胺受体的相对含量随日龄的增长而增加，其中从1日龄组到5日龄组其相对含量增加较慢，从5日龄组到60日龄组其相对含量增加较快，相邻两个日龄组间5-羟色胺受体的含量差别显著(P<0.05)。(由于5-羟色胺受体与5-羟色胺在颌下腺具有共存关系[2]，故此部分不再附照片)。表2 5-羟色胺受体在不同日龄大鼠颌下腺的相对含量
Table 2 The relative contents of 5-HT receptorin submaxillary glands of different day age rats 动物分组
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groups
相对含量/单位面积(
±S)relative amount/unit area
t值
t
P值
P
1d
0.0245±0.0065
-
-
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5d
0.0363±0.0030
0.5240
>0.05
12d
0.0396±0.0062
0.5240
<0.05
30d
0.0738±0.0087
2.7141
<0.05
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60d
0.1024±0.0049
2.2700
<0.05
90d
0.0968±0.0118
1.0570
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一些资料表明[5]，大鼠颌下腺在14d胚龄时开始发育，至出生时已初具分泌功能，但在出生到生后两周这段时间内，颌下腺结构的成熟分化非常显著，至出生后40d左右，其腺泡结构与成鼠相似，而且颌下腺所含的生物活性物质，也随日龄的增长而逐渐增多。如小鼠颌下腺中的神经生长因子，在生后前2周，没有随日龄增长而增多的趋势，但在此后却表现出明显的随日龄而增多的趋势：15日龄的小鼠颌下腺中的神经生长因子的含量为3.2μg/L，27日龄时含量为9.8μg/L，是15日龄的3倍余；而成年小鼠颌下腺的含量高达30μg/L，是15日龄的10倍。同时颌下腺中所含的各种神经纤维的密度也是随日龄的增长而增大的(但有些神经纤维的密度在日龄增大到一定程度后有回降趋势)。如肾上腺能和胆碱能神经纤维，在出生时即有相当数量的神经纤维支配颌下腺，但其密度在出生后3周才能达到成鼠水平[6]。另外，颌下腺所含的一些酶类的含量也呈现随日龄增长而增多的趋势(如乙酰胆碱酯酶等)。本实验结果证明不同日龄的大鼠颌下腺的5-羟色胺及其受体的相对含量也随日龄增长而增多，这表现在两个方面：一是免疫反应性细胞数的增多；二是免疫反应性物质含量的增多。生后1～5d内免疫反应性细胞仅限于导管的上皮细胞，所有腺泡上皮在这段时间内均无免疫反应。生后12d，免疫反应性细胞开始在腺泡上皮细胞出现，生后30d阳性细胞明显增多，至60d达到成鼠水平，所测得的光密度值也随日龄的增长而增大。其中生后1～5d增大的速度较慢，5d后增大的速度加快，这与颌下腺的其他生物活性物质的变化规律基本相同。有资料表明[6]，肾上腺能和胆碱能神经纤维及P物质神经纤维在颌下腺结构和功能的成熟过程中起着重要的作用，能影响腺泡的分泌(指腺泡分泌成分的改变)。有文献报道，5-羟色胺可影响消化液的分泌，如外源性5-羟色胺可抑制胃酸的分泌，参与肠液电解质的转运等[7，8]。那么5-羟色胺及其受体在颌下腺的出现及其含量与日龄的关系的存在，是否也同颌下腺的成熟过程以及其分泌活动有关，有待进一步研究。收稿 1997-05 修回 1997-09
, 百拇医药
本文图1～3见插图第11页
图版说明
图1 5-羟色胺免疫反应性细胞在5日龄大鼠颌下腺的分布 ×200(下同)
图2 5-羟色胺免疫反应性细胞在30日龄大鼠颌下腺的分布
图3 5-羟色胺免疫反应性细胞在60日龄大鼠颌下腺的分布
↑指示分泌管，↑指示小叶内导管，↑ ↑指示腺泡
Explanation of figures
Fig.1 Showing 5-HT immunoreactive cells in submaxilary gland of a postnatal 5-day rat. ×200(The same as follows)
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Fig.2 Showing 5-HT immunoreactive cells in submaxilary gland of a postnatal 30-day rat.
Fig.3 Showing 5-HT immunoreactive cells in submaxilary gland of a postnatal 60-day rat.
The ↑:points to secretary duct,the ↑：points to interlobular ducts,the ↑ ↑:points to acinus.
参考文献
[1]Virta E, Unsitalo H. Developmental study of substance P and neurokinin A immunoreactivity in ganglia supplying nerves to the submaxillary glands of the rat. Histochemistry, 1993,100(4):311
, http://www.100md.com
[2]王 炜，黄威权，苏慧慈.5-羟色胺及其受体在大鼠颌下腺的免疫组织化学定位.解剖学报，1996，27(2)：198
[3]黄威权，司玉灿，王文超.自制5-羟色胺抗体的特异性和敏感性.第四军医大学学报，1987，16(4)：200
[4]黄威权，孙 岚，王百忍等.5-羟色胺抗独特型抗体的免疫组织化学鉴定及5-羟色胺定位的研究.第四军医大学学报，1995，16(3)：195
[5]Ekstrom J, Ekman R, Hekenson R. Developmental studies on vasoactive intestinal peptide, substance P and calcitonin gene-related peptide in salivary glands of postnatal rats. Acta Physiol Scand, 1994,151(2):107
, 百拇医药
[6]Virta E, Torm W, Unsitalo H, et al. Substance P and neurokinin A immunoreactive nerve fibers in the developing salivary glands of the rat. Histochemistry, 1992,98(4):317
[7]Hansen MB. Involvment of non-classical 5-HT receptor in serotonin and cisapride induced secretion in hen colon. Com Biochem Physiol,1992,101A(2):283
[8]Mohan K, Yin N, Shivia L, et al. Gastrointestinal effects of 5-hydroxytryptamine and related drugs. Life Sci, 1994,54(20):1651
, 百拇医药
STUDIES ON RELATIVE CONTENTS OF 5-HYDROXYTRY-
PTAMINE AND ITS RECEPTOR IN SUBMAXILLARY
GLANDS OF POSTNATAL RAT
PTAMINE AND ITS RECEPTOR IN SUBMAXILLARY
GLANDS OF POSTNATAL RAT
Wang Wei，Huang Weiquan△，Lü Kunju, Di Xinyu
(Department of Histology and Embryology, The Fourth Military Medical
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University, Xi′an;* Department of Pathology, 401 Hospital of PLA, Qingdao′an;* Department of Pathology, 401 Hospital of PLA, Qingdao)
The relationship between the relative contents of 5-hydroxytryptamime (5-HT) and its receptor and age in days of postnatal rat was studied by using immunohistchemistry and in situ quantitative analysis. It showed that they increased with time passing by during postnatal 60 days and kept steadily from 60th to 90th day. These results suggested that the contents of 5-HT and its receptor may implicate mature development of rat.
KEY WORDS 5-HT;5-HT receptor; Submaxillary gland; In situ quantitative determination; Immunohistochemistry
△Department of Histology and Embryology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China, 百拇医药