人外周血树突状细胞在LAK抗HPBALL细胞中作用的研究*
作者：邱立华** 缪继武 杨 宁 尹兰珍
单位：南京铁道医学院组织学胚胎学教研室，南京 210009；**天津市肿瘤医院病理科，天津 300060
关键词：树突状细胞；外周血；LAK；HPBALL细胞；凋亡
解剖学报980313 摘 要 为探讨树突状细胞(DC)在LAK抗HPBALL细胞中的作用，采用多因素、多水平的杀伤试验，同时以光镜、电镜观察DC、LAK、HPBALL相互作用的形态特征及DNA断端标记法检测瘤细胞是否凋亡。结果表明：(1)DC无直接杀伤HPBALL作用。(2)5×105～1×107/L DC有增强不同E/T LAK杀伤活性的趋势，而1×107～5×107/L DC对LAK活性有抑制趋势。(3)DC、LAK杀伤HPBALL的最佳组合条件为：DC培养4d、浓度5×106/L，LAK E/T=10/1，rIL-2=0。(4)光镜、电镜下均可见DC的突起与LAK、HPBALL细胞紧密接触形成细胞簇。(5)DNA断端标记法显示瘤细胞呈末端脱氧核糖核酸转移酶阳性反应。结论：DC对LAK杀伤HPBALL活性具有双向调节作用。
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树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种重要的免疫辅助细胞[1]，较强递呈抗原和辅助混合淋巴细胞反应[2]，在免疫相关性疾病发病中起重要作用。近年来，DC在肿瘤免疫中的作用受到人们的关注，大量动物和临床研究表明，DC可参与机体抗肿瘤免疫反应，然而有关这类研究仅局限于原位观察。我们试图观察人外周血DC在LAK抗HPBALL细胞中的作用、形态学特征并对其机制进行初步探讨。
材料和方法
1.人外周血DC分离
取浓集白细胞组分(南京红十字血液中心提供)1个单位，以Ficoll(自配)液分离单个核细胞(MNC)，洗涤，加用Verapamil(江苏省兴化县制药厂)5×10-2g/L，作用30min，继之以不连续Percoll(Pharmacia)密度梯度离心，取35%与50%界面层细胞，然后于含有人Ig(上海生物制品研究所)的克隆板上培养1h，轻轻吹打，收集非贴壁细胞，洗涤，即为DC组分，涂片4张，进行S-100蛋白免疫组织化学染色(ABC法，华美公司)。以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。油镜下每片观察200个细胞，计数阳性率。
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2.LAK细胞诱导
取MNC，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞浓度至3×109～5×109/L，同时加入rIL-2 1×106IU/L，于37℃、5%CO2培养箱中培养，第4d时补加rIL-2，继续诱导至第7d，收集LAK细胞。
3.DC抗HPBALL细胞
人急性T淋巴细胞性白血病细胞系(中国医学科学院血液学研究所提供)及调节LAK杀伤HPBALL细胞活性试验。
3.1 初筛试验：采用析因试验设计，探讨DC有无直接抗HPBALL作用及DC调节LAK杀伤HPBALL的较合适的浓度范围。
3.2 正交试验：在析因试验的基础上，进行正交试验，选用L27(313)正交表，探讨DC、LAK抗HPBALL的最佳组合条件。
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4.细胞毒性检测
采用改良乳酸脱氢酶释放法[3]。细胞毒性检测数据以SAS软件进行方差分析和显著性检验。
5.光镜标本制作
DC、LAK、HPBALL混合培养4h后，涂片，进行S-100蛋白和瑞氏染色。S-100蛋白染色以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。
6.透射电镜标本制作
DC、LAK、HPBALL混合液，经3 000 r/min，离心30 min后，加入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，各级丙酮脱水，Epon 812包埋，超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅染色，H600型电镜观察。
7.原位细胞凋亡检测
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DC、LAK、HPBALL混合培养4h后，离心，涂片，10%中性福尔马林固定，20 mg/L蛋白酶K消化15 min，置0.3%过氧化氢水溶液中20 min，加TdT和Biotin-ll-dUTP各1μl/片37℃标记60 min，封闭液50μl/片，后加Avidin-HRP 50μl/片，反应30 min，0.03%过氧化氢-0.5 g/L DAB显色10 min，苏木素复染，常规封片，镜检。
结 果
1.DC纯度
经S-100蛋白染色检测，计数的阳性细胞数744，阴性细胞数56，阳性率93%。
2.杀伤试验
2.1 析因试验(表1、图1)
单独DC在5×105L、1×106/L、1×107/L、5×107/L浓度下未检测到对HPBALL的杀伤作用。(P<0.05)
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由图1可见：(1)5×105～1×107/L DC有增强不同E/TLAK杀伤活性的趋势，而1×107～5×107/L DC对LAK杀伤活性有抑制趋势。(2)DC调节LAK活性的较适浓度范围为：1×106～1×107/L。(P<0.05)
2.2 正交试验(表2、图2)
表1 析因试验的因素及水平
Table 1 The arrangement of factors and levels in factrial test
(HPBALL:1×109/L) 因 素
factors
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水 平(level)
1
2
3
4
树突状细胞(细胞数/升)
DC (cells/L)
(A)5×107
1×107
1×106
5×105
, http://www.100md.com LAK细胞(效/靶)
LAK (E/T)
(B)4/1
2/1
0
白介素-2(单位/升)
rIL-2 (IU/L)
(C)1×106
0
表2 正交试验的因素及水平
Table 2 The arrangement of factors and levels inorthogonal test
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(HPBALL:1×109/L) 因 素
factor
水 平(level)
1
2
3
树突状细胞(细胞数/升)
DC (cells/L)
(A)1×107
5×106
1×106
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LAK细胞(效/靶)
LAK (E/T)
(B)10/1
5/1
0
白介素-2(单位/升)
rIL-2 (IU/L)
(C)2×105
1×105
0
DC培养时间(天)
culturing time of DC(d)
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(D)0
4
7
据SAS软件数据处理结果，所得趋势图为：
图1 析因试验趋势图
Fig.1 The tendancy of each level in factorial test
根据数据处理结果，所得趋势图为：
图2 正交试验趋势图
Fig.2 The tendancy of each level in orthogonal test
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从图2可见DC、LAK杀伤HPBALL的最佳组合条件为：DC培养4d、浓度5×106/L，LAK(E/T)=10/1,rIL-2=0。(P<0.01)3.DC、LAK、HPBALL相互作用的形态学观察
3.1 正常DC 形状不规则，表面有大量突起，核形状不规则、染色较淡、核膜周围有致密的异染色质，胞质内有较多的线粒体，可见空泡和脂滴；而高尔基复合体，内质网少见，溶酶体少量或没有(图3)。
3.2 光镜观察 DC与LAK、HPBALL形成细胞簇(图4)。
3.3 电镜观察 DC、LAK与HPBALL细胞紧密接触。DC在其与HPBALL接触处有线粒体存在；LAK在其与HPBALL接触处有大量细胞毒颗粒出现；而HPBALL体积收缩，胞质电子密度较大，核染色质浓集成新月体状。(图5)
4.原位细胞凋亡检测
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示HPBALL细胞呈末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)阳性反应，核内出现棕黄色颗粒，数目多少不一(图6)。
讨 论
由于DC无特异性阳性标志，目前，S-100蛋白染色是鉴定DC的一个重要而可靠的指标，非DC组分呈阴性反应，经检测DC纯度达93%。
大量实验性肿瘤和人类肿瘤临床免疫的研究均表明机体确实存在抗肿瘤的免疫应答。树突状细胞作为肿瘤免疫的发动者，在抗肿瘤免疫中起重要作用。
LAK在机体非特异性免疫应答中，不仅对自身肿瘤有杀伤作用，而且对其他异基因个体甚至不同种属来源的肿瘤亦具有杀伤作用。
我们在实验中发现：不同浓度的DC对于LAK细胞功能的调节具有双向性。5×105～1×107/L DC有增强LAK杀伤活性的趋势，以5×106/L作用最强；而1×107～5×105/L DC抑制LAK功能，随浓度增高，抑制功能增强。前者推测与DC递呈抗原作用得以正常发挥及分泌GM-CSF等上调该作用[4,5]有关；而高浓度DC抑制LAK 杀伤活性的原因可能是：人血DC可通过其CD40分子激活T细胞[6]。HPBALL为人急性T淋巴细胞性细胞株，其表面有CD40配体，该配体的激活抑制瘤细胞凋亡。由此，高浓度的DC可通过大量激活CD40配体抑制HPBALL凋亡的方式拮抗LAK的杀伤作用；亦或通过自分泌的TNF-α、IL-1 α、IL-10因子下调甚至抑制DC递呈肿瘤抗原的能力[7]而发挥抑制作用。
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在DC调节LAK杀伤活性体系中，DC的培养时间亦为重要因素。培养4d组的DC其功能明显强于刚分离的DC。考虑原因是：DC的培养时间与其功能密切相关。刚分离的DC，未成熟亚型居多，而培养36h后，DC成熟亚型占多数[3]，故培养4d的DC功能较强。DC体外培养的维持与功能上的自身成熟，可能与DC本身能分泌少量GM-CSF有关[8,9]。但培养7d后DC已失去功能，与国外报道7d后DC仍具功能[10]不一致。推测与DC纯度有关，GM-CSF能维持、促进DC发育、繁殖，纯度低的DC组分中混杂的单核细胞能分泌大量GM-CSF[11]，这就有可能使DC培养7d后仍具功能。
镜下观察：DC、LAK、HPBALL紧密接触形成细胞簇，LAK的细胞毒颗粒移向瘤细胞，而HPBALL呈现体积收缩，胞质致密，核染色质浓集成新月体状等凋亡形态。DNA断端标记法证实瘤细胞呈TdT阳性反应，为凋亡。在DC参与非特异性抗肿瘤免疫过程中，可能存在两方面的作用机制：即DC本身及其分泌的细胞因子均可能起重要作用。DC作为一种重要的免疫辅助细胞，能较强递呈抗原，而DC的激活需抗原的刺激。DC特异性递呈抗原后被激活，进而激活的DC通过某种方式作用于LAK，形成DC、LAK、HPBALL三者间的紧密接触，LAK的细胞毒颗粒移向瘤细胞，其内的穿孔素和丝氨酸蛋白酶等通过一定机制诱导HPBALL细胞凋亡[12]。
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有人曾推测：DC可能作为一种效应细胞直接参与杀伤肿瘤细胞[13]，但我们在实验中未发现人外周血DC在体外对HPBALL有直接杀伤作用。可能DC不具备效应细胞功能，也有可能是体外与体内微环境不同造成的。
以上我们对DC在LAK抗HPBALL中的作用做了初步探讨。通过观察血DC形态、功能和数量的变化有利于进一步了解肿瘤的发生、发展及预后，并为临床治疗肿瘤提供新的思路。至于DC在非特异性肿瘤免疫中详尽的分子机制有待于进一步探讨。
收稿1997-07 修回1997-11
图1 SEB组细胞培养5d后，经5μg/L抗APO-1单抗处理16h,↑示凋亡细胞 ×400
图2 对照组细胞培养5d后，经5μg/L抗APO-1单抗处理16h ×400
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Fig.1 Lymphocytes in SEB groupwere treated with 5μg/L of APO-1 McAb for 16h after cultured for 5 days Arrowhead indicates apoptotic lymphocytes. ×400
Fig.2 Lymphocytes in control group were treated with 5μg/L of APO-1 McAb for 16h after cultured for 5days. ×400
图版说明
图3 人外周血树突状细胞电镜照片 ×6 000
图4 S-100蛋白染色阳性DC与LAK、HPBALL形成细胞簇(
：示HPBALL细胞)。 ×1 000
, 百拇医药
图5 电镜下DC、LAK、HPBALL紧密接触，LAK的细胞毒颗粒(Δ)移向瘤细胞，而HPBALL()呈现胞质收缩，染色质浓集成新月体状等凋亡形态。 ×4 000
图6 DNA断端标记法示HPBALL呈末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)阳性反应() ×1 000
Explanation of figures
Fig.3 The morphological character of dendritic cell ×6 000
Fig.4 The cluster of S-100 protein positive dendritic cell,lymphokin-activated killer cells (LAK) and HPBALL cells.(HPBLL cells) ×1 000
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Fig.5 Dendritic cell contacting with LAK and HPBALL cells tightly.The cytotoxity particles(Δ)of LAK transmitting to tumor cells and HPBALL cells () appearing the morphological character of apoptosis ×4 000
Fig.6 Programmed cell death assay showing that HPBALL cell appearing TdT positive reaction ×1 000
* 铁道部、江苏省科学委员会资助课题(No.J 932030、Bs92021)
参考文献
, 百拇医药
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THE STUDY OF FUNCTION OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD
DENDRITIC CELLS IN THE SYSTEM OF LAK ANTI-HPBALL
, 百拇医药
CELLS IN VITRO
CELLS IN VITRO
Qiu Lihua,Miao Jiwu,Yang Ning,Yin Lanzhen△
(Department of Histology and Embryology,Nanjing Railway Medical College,Nanjing)
Factorial design and orthogonal design were adopted to examine the function of dendritic cells(DC)in the system of lymphokin-activated killer cells (LAK) anti-HPBALL tumor celler.In the mean time,the interactive morphological character of DC,LAK and HPBALL cells was observed under light and transmission electron microscope,and programmed cell deaath assay was applied to research whether or not HPBALL cells had been triggered to apoptosis.
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The results were as follows:(1)DC could not kill HPBALL cells directly.(2)5×108 to 1×107/L DC could have a trend of enhancing the killing activity of different effector/target(E/T)LAK cells.However,1×107/L to 5×107/L DC showed an inhibitory trend.(3)The most optimal combined elements of DC,LAK for killing HPBALL cells was:DC cultured for 4 days concentration 5×106/L,E/T=10/1 LAK without IL-2.(4)It was also observed that DC could contact and cluster with LAK and HPBALL cells.(5)The positive reaction of programmed cell death apperaed in HPBALL cells.
The results indicated that DC could regulate the cytotoxity of LAK killing HPBALL cells in some degree.
KEY WORDS Dendritic cells;Peripheral blood;LAK; HPBALL cells;Apoptosis
△Department of Histology and Embryology,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009,China, 百拇医药(邱立华** 缪继武 杨 宁 尹兰珍)
单位：南京铁道医学院组织学胚胎学教研室，南京 210009；**天津市肿瘤医院病理科，天津 300060
关键词：树突状细胞；外周血；LAK；HPBALL细胞；凋亡
解剖学报980313 摘 要 为探讨树突状细胞(DC)在LAK抗HPBALL细胞中的作用，采用多因素、多水平的杀伤试验，同时以光镜、电镜观察DC、LAK、HPBALL相互作用的形态特征及DNA断端标记法检测瘤细胞是否凋亡。结果表明：(1)DC无直接杀伤HPBALL作用。(2)5×105～1×107/L DC有增强不同E/T LAK杀伤活性的趋势，而1×107～5×107/L DC对LAK活性有抑制趋势。(3)DC、LAK杀伤HPBALL的最佳组合条件为：DC培养4d、浓度5×106/L，LAK E/T=10/1，rIL-2=0。(4)光镜、电镜下均可见DC的突起与LAK、HPBALL细胞紧密接触形成细胞簇。(5)DNA断端标记法显示瘤细胞呈末端脱氧核糖核酸转移酶阳性反应。结论：DC对LAK杀伤HPBALL活性具有双向调节作用。
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树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种重要的免疫辅助细胞[1]，较强递呈抗原和辅助混合淋巴细胞反应[2]，在免疫相关性疾病发病中起重要作用。近年来，DC在肿瘤免疫中的作用受到人们的关注，大量动物和临床研究表明，DC可参与机体抗肿瘤免疫反应，然而有关这类研究仅局限于原位观察。我们试图观察人外周血DC在LAK抗HPBALL细胞中的作用、形态学特征并对其机制进行初步探讨。
材料和方法
1.人外周血DC分离
取浓集白细胞组分(南京红十字血液中心提供)1个单位，以Ficoll(自配)液分离单个核细胞(MNC)，洗涤，加用Verapamil(江苏省兴化县制药厂)5×10-2g/L，作用30min，继之以不连续Percoll(Pharmacia)密度梯度离心，取35%与50%界面层细胞，然后于含有人Ig(上海生物制品研究所)的克隆板上培养1h，轻轻吹打，收集非贴壁细胞，洗涤，即为DC组分，涂片4张，进行S-100蛋白免疫组织化学染色(ABC法，华美公司)。以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。油镜下每片观察200个细胞，计数阳性率。
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2.LAK细胞诱导
取MNC，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞浓度至3×109～5×109/L，同时加入rIL-2 1×106IU/L，于37℃、5%CO2培养箱中培养，第4d时补加rIL-2，继续诱导至第7d，收集LAK细胞。
3.DC抗HPBALL细胞
人急性T淋巴细胞性白血病细胞系(中国医学科学院血液学研究所提供)及调节LAK杀伤HPBALL细胞活性试验。
3.1 初筛试验：采用析因试验设计，探讨DC有无直接抗HPBALL作用及DC调节LAK杀伤HPBALL的较合适的浓度范围。
3.2 正交试验：在析因试验的基础上，进行正交试验，选用L27(313)正交表，探讨DC、LAK抗HPBALL的最佳组合条件。
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4.细胞毒性检测
采用改良乳酸脱氢酶释放法[3]。细胞毒性检测数据以SAS软件进行方差分析和显著性检验。
5.光镜标本制作
DC、LAK、HPBALL混合培养4h后，涂片，进行S-100蛋白和瑞氏染色。S-100蛋白染色以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。
6.透射电镜标本制作
DC、LAK、HPBALL混合液，经3 000 r/min，离心30 min后，加入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，各级丙酮脱水，Epon 812包埋，超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅染色，H600型电镜观察。
7.原位细胞凋亡检测
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DC、LAK、HPBALL混合培养4h后，离心，涂片，10%中性福尔马林固定，20 mg/L蛋白酶K消化15 min，置0.3%过氧化氢水溶液中20 min，加TdT和Biotin-ll-dUTP各1μl/片37℃标记60 min，封闭液50μl/片，后加Avidin-HRP 50μl/片，反应30 min，0.03%过氧化氢-0.5 g/L DAB显色10 min，苏木素复染，常规封片，镜检。
结 果
1.DC纯度
经S-100蛋白染色检测，计数的阳性细胞数744，阴性细胞数56，阳性率93%。
2.杀伤试验
2.1 析因试验(表1、图1)
单独DC在5×105L、1×106/L、1×107/L、5×107/L浓度下未检测到对HPBALL的杀伤作用。(P<0.05)
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由图1可见：(1)5×105～1×107/L DC有增强不同E/TLAK杀伤活性的趋势，而1×107～5×107/L DC对LAK杀伤活性有抑制趋势。(2)DC调节LAK活性的较适浓度范围为：1×106～1×107/L。(P<0.05)
2.2 正交试验(表2、图2)
表1 析因试验的因素及水平
Table 1 The arrangement of factors and levels in factrial test
(HPBALL:1×109/L) 因 素
factors
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水 平(level)
1
2
3
4
树突状细胞(细胞数/升)
DC (cells/L)
(A)5×107
1×107
1×106
5×105
, http://www.100md.com LAK细胞(效/靶)
LAK (E/T)
(B)4/1
2/1
0
白介素-2(单位/升)
rIL-2 (IU/L)
(C)1×106
0
表2 正交试验的因素及水平
Table 2 The arrangement of factors and levels inorthogonal test
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(HPBALL:1×109/L) 因 素
factor
水 平(level)
1
2
3
树突状细胞(细胞数/升)
DC (cells/L)
(A)1×107
5×106
1×106
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LAK细胞(效/靶)
LAK (E/T)
(B)10/1
5/1
0
白介素-2(单位/升)
rIL-2 (IU/L)
(C)2×105
1×105
0
DC培养时间(天)
culturing time of DC(d)
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(D)0
4
7
据SAS软件数据处理结果，所得趋势图为：
图1 析因试验趋势图
Fig.1 The tendancy of each level in factorial test
根据数据处理结果，所得趋势图为：
图2 正交试验趋势图
Fig.2 The tendancy of each level in orthogonal test
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从图2可见DC、LAK杀伤HPBALL的最佳组合条件为：DC培养4d、浓度5×106/L，LAK(E/T)=10/1,rIL-2=0。(P<0.01)3.DC、LAK、HPBALL相互作用的形态学观察
3.1 正常DC 形状不规则，表面有大量突起，核形状不规则、染色较淡、核膜周围有致密的异染色质，胞质内有较多的线粒体，可见空泡和脂滴；而高尔基复合体，内质网少见，溶酶体少量或没有(图3)。
3.2 光镜观察 DC与LAK、HPBALL形成细胞簇(图4)。
3.3 电镜观察 DC、LAK与HPBALL细胞紧密接触。DC在其与HPBALL接触处有线粒体存在；LAK在其与HPBALL接触处有大量细胞毒颗粒出现；而HPBALL体积收缩，胞质电子密度较大，核染色质浓集成新月体状。(图5)
4.原位细胞凋亡检测
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示HPBALL细胞呈末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)阳性反应，核内出现棕黄色颗粒，数目多少不一(图6)。
讨 论
由于DC无特异性阳性标志，目前，S-100蛋白染色是鉴定DC的一个重要而可靠的指标，非DC组分呈阴性反应，经检测DC纯度达93%。
大量实验性肿瘤和人类肿瘤临床免疫的研究均表明机体确实存在抗肿瘤的免疫应答。树突状细胞作为肿瘤免疫的发动者，在抗肿瘤免疫中起重要作用。
LAK在机体非特异性免疫应答中，不仅对自身肿瘤有杀伤作用，而且对其他异基因个体甚至不同种属来源的肿瘤亦具有杀伤作用。
我们在实验中发现：不同浓度的DC对于LAK细胞功能的调节具有双向性。5×105～1×107/L DC有增强LAK杀伤活性的趋势，以5×106/L作用最强；而1×107～5×105/L DC抑制LAK功能，随浓度增高，抑制功能增强。前者推测与DC递呈抗原作用得以正常发挥及分泌GM-CSF等上调该作用[4,5]有关；而高浓度DC抑制LAK 杀伤活性的原因可能是：人血DC可通过其CD40分子激活T细胞[6]。HPBALL为人急性T淋巴细胞性细胞株，其表面有CD40配体，该配体的激活抑制瘤细胞凋亡。由此，高浓度的DC可通过大量激活CD40配体抑制HPBALL凋亡的方式拮抗LAK的杀伤作用；亦或通过自分泌的TNF-α、IL-1 α、IL-10因子下调甚至抑制DC递呈肿瘤抗原的能力[7]而发挥抑制作用。
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在DC调节LAK杀伤活性体系中，DC的培养时间亦为重要因素。培养4d组的DC其功能明显强于刚分离的DC。考虑原因是：DC的培养时间与其功能密切相关。刚分离的DC，未成熟亚型居多，而培养36h后，DC成熟亚型占多数[3]，故培养4d的DC功能较强。DC体外培养的维持与功能上的自身成熟，可能与DC本身能分泌少量GM-CSF有关[8,9]。但培养7d后DC已失去功能，与国外报道7d后DC仍具功能[10]不一致。推测与DC纯度有关，GM-CSF能维持、促进DC发育、繁殖，纯度低的DC组分中混杂的单核细胞能分泌大量GM-CSF[11]，这就有可能使DC培养7d后仍具功能。
镜下观察：DC、LAK、HPBALL紧密接触形成细胞簇，LAK的细胞毒颗粒移向瘤细胞，而HPBALL呈现体积收缩，胞质致密，核染色质浓集成新月体状等凋亡形态。DNA断端标记法证实瘤细胞呈TdT阳性反应，为凋亡。在DC参与非特异性抗肿瘤免疫过程中，可能存在两方面的作用机制：即DC本身及其分泌的细胞因子均可能起重要作用。DC作为一种重要的免疫辅助细胞，能较强递呈抗原，而DC的激活需抗原的刺激。DC特异性递呈抗原后被激活，进而激活的DC通过某种方式作用于LAK，形成DC、LAK、HPBALL三者间的紧密接触，LAK的细胞毒颗粒移向瘤细胞，其内的穿孔素和丝氨酸蛋白酶等通过一定机制诱导HPBALL细胞凋亡[12]。
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有人曾推测：DC可能作为一种效应细胞直接参与杀伤肿瘤细胞[13]，但我们在实验中未发现人外周血DC在体外对HPBALL有直接杀伤作用。可能DC不具备效应细胞功能，也有可能是体外与体内微环境不同造成的。
以上我们对DC在LAK抗HPBALL中的作用做了初步探讨。通过观察血DC形态、功能和数量的变化有利于进一步了解肿瘤的发生、发展及预后，并为临床治疗肿瘤提供新的思路。至于DC在非特异性肿瘤免疫中详尽的分子机制有待于进一步探讨。
收稿1997-07 修回1997-11
图1 SEB组细胞培养5d后，经5μg/L抗APO-1单抗处理16h,↑示凋亡细胞 ×400
图2 对照组细胞培养5d后，经5μg/L抗APO-1单抗处理16h ×400
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Fig.1 Lymphocytes in SEB groupwere treated with 5μg/L of APO-1 McAb for 16h after cultured for 5 days Arrowhead indicates apoptotic lymphocytes. ×400
Fig.2 Lymphocytes in control group were treated with 5μg/L of APO-1 McAb for 16h after cultured for 5days. ×400
图版说明
图3 人外周血树突状细胞电镜照片 ×6 000
图4 S-100蛋白染色阳性DC与LAK、HPBALL形成细胞簇(
：示HPBALL细胞)。 ×1 000, 百拇医药
图5 电镜下DC、LAK、HPBALL紧密接触，LAK的细胞毒颗粒(Δ)移向瘤细胞，而HPBALL(
)呈现胞质收缩，染色质浓集成新月体状等凋亡形态。 ×4 000图6 DNA断端标记法示HPBALL呈末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)阳性反应(
) ×1 000Explanation of figures
Fig.3 The morphological character of dendritic cell ×6 000
Fig.4 The cluster of S-100 protein positive dendritic cell,lymphokin-activated killer cells (LAK) and HPBALL cells.(
HPBLL cells) ×1 000, http://www.100md.com
Fig.5 Dendritic cell contacting with LAK and HPBALL cells tightly.The cytotoxity particles(Δ)of LAK transmitting to tumor cells and HPBALL cells (
) appearing the morphological character of apoptosis ×4 000Fig.6 Programmed cell death assay showing that HPBALL cell appearing TdT positive reaction ×1 000
* 铁道部、江苏省科学委员会资助课题(No.J 932030、Bs92021)
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THE STUDY OF FUNCTION OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD
DENDRITIC CELLS IN THE SYSTEM OF LAK ANTI-HPBALL
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CELLS IN VITRO
CELLS IN VITRO
Qiu Lihua,Miao Jiwu,Yang Ning,Yin Lanzhen△
(Department of Histology and Embryology,Nanjing Railway Medical College,Nanjing)
Factorial design and orthogonal design were adopted to examine the function of dendritic cells(DC)in the system of lymphokin-activated killer cells (LAK) anti-HPBALL tumor celler.In the mean time,the interactive morphological character of DC,LAK and HPBALL cells was observed under light and transmission electron microscope,and programmed cell deaath assay was applied to research whether or not HPBALL cells had been triggered to apoptosis.
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The results were as follows:(1)DC could not kill HPBALL cells directly.(2)5×108 to 1×107/L DC could have a trend of enhancing the killing activity of different effector/target(E/T)LAK cells.However,1×107/L to 5×107/L DC showed an inhibitory trend.(3)The most optimal combined elements of DC,LAK for killing HPBALL cells was:DC cultured for 4 days concentration 5×106/L,E/T=10/1 LAK without IL-2.(4)It was also observed that DC could contact and cluster with LAK and HPBALL cells.(5)The positive reaction of programmed cell death apperaed in HPBALL cells.
The results indicated that DC could regulate the cytotoxity of LAK killing HPBALL cells in some degree.
KEY WORDS Dendritic cells;Peripheral blood;LAK; HPBALL cells;Apoptosis
△Department of Histology and Embryology,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009,China, 百拇医药(邱立华** 缪继武 杨 宁 尹兰珍)